創(chuàng)新實(shí)驗(yàn)開題報(bào)告模板

蛇毒腺cDNA文庫的篩選小組成員：楊永艷、靳雪英、梁傳雯、侯芝娟一、 背景知識cDNA文庫是用某一組織細(xì)胞中全部的mRNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA構(gòu)建而成的，有組織細(xì)胞特性及蛋白質(zhì)基因表達(dá)的時(shí)空特異性。cDNA文庫構(gòu)建技術(shù)已經(jīng)相當(dāng)成熟，從cDNA文庫中篩選目的基因是研究臟器基因表達(dá)譜的有效方法，另外，由于cDNA文庫構(gòu)建時(shí)用的原材料是細(xì)胞中成熟的mRNA，因此從文庫中篩選出來的目的基因不含內(nèi)含子，可以直接用于基因工程表達(dá)，是研究蛋白功能的好方法。自20世紀(jì)70年代首例cDNA克隆技術(shù)問世以來，構(gòu)建cDNA文庫已成為研究功能基因組學(xué)的重要手段之一。通過構(gòu)建cDNA文庫不僅可以有利于瀕危珍惜生物資源基因的保護(hù)，而且可以提供構(gòu)建分子標(biāo)記連鎖圖譜所用的探針，可以用于分離全長基因，進(jìn)而開展基因功能的研究。因此，cDNA文庫在研究特定細(xì)胞中基因組的表達(dá)狀態(tài)及表達(dá)基因的功能鑒定方面具有特殊的優(yōu)勢，因而在個(gè)體發(fā)育、細(xì)胞分化、細(xì)胞周期調(diào)控、細(xì)胞衰老和凋亡調(diào)控、腫瘤分子機(jī)制等生命現(xiàn)象的研究中具有廣泛的應(yīng)用價(jià)值。建立cDNA文庫的目的在于分離目的基因，cDNA文庫構(gòu)建完成后，更繁重的任務(wù)是cDNA文庫的篩選。目前cDNA文庫的篩選方法主要有以下幾種：（1） 基于核酸探針的分子雜交篩選主要用于已知蛋白部分氨基酸序列的目的基因篩選，是從cDNA文庫中選擇目的基因最常用、最可靠的方法。適于大規(guī)模篩選某蛋白的基因家族，但操作的技術(shù)難度相對較大，成本高。（2） 菌落雜交篩選法可以通過在硝酸纖維素濾膜或尼龍膜上原位裂解細(xì)菌菌落,再與相應(yīng)的核酸探針進(jìn)行雜交的方法進(jìn)行篩選,該法雖有一定的篩選特異性,但操作中要用到同位素，通量小。（3） 基于抗體的免疫學(xué)篩選該方法成功的關(guān)鍵是要提供特定的特異性抗體，并且該方法只能針對目的基因的cDNA按正確讀框和方向插入載體的cDNA表達(dá)型文庫的篩選。如果外源蛋白對宿主菌有毒性，則對應(yīng)的克隆就無法正常生長，因此用抗體法篩選cDNA文庫，前提必須是外源蛋白對宿主菌沒有毒性。菌落PCR通常先隨機(jī)挑取大量候選菌落／克隆進(jìn)行培養(yǎng)，取小體積菌液離心收菌體，繞過提取質(zhì)粒DNA,利用在PCR預(yù)變性過程中直接釋放的質(zhì)粒DNA作模板,以設(shè)計(jì)的特異性引物作PCR,然后用瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果中目的基因片段的大小及有無來初步獲取候選克隆，再利用測序確定。隨機(jī)測序通常先隨機(jī)挑取大量候選菌落／克隆進(jìn)行培養(yǎng)(如幾千個(gè))，提取質(zhì)粒DNA,然后直接以載體的通用測序引物進(jìn)行測序,然后從中選取目的克隆用作下一步研究，該方法最大的缺點(diǎn)是成本昂貴。BLASTBLAST(BasicLocalAlignmentSearchTool) 是一套在蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫或DNA數(shù)據(jù)庫中進(jìn)行相似性比較的分析工具。BLAST程序能迅速與公開數(shù)據(jù)庫進(jìn)行相似性序列比較。BLAST結(jié)果中的得分是對一種對相似性的統(tǒng)計(jì)說明。BLAST采用一種局部的算法獲得兩個(gè)序列中具有相似性的序列。BLAST的功能BLAST對一條或多條序列(可以是任何形式的序列)在一個(gè)或多個(gè)核酸或蛋白序列庫中進(jìn)行比對。BLAST還能發(fā)現(xiàn)具有缺口的能比對上的序列。BLAST是基于Altschul等人在J.Mol.Biol上發(fā)表的方法(J.Mol.Biol.215:403-410(1990)),在序列數(shù)據(jù)庫中對查詢序列進(jìn)行同源性比對工作。從最初的BLAST發(fā)展到現(xiàn)在NCBI提供的BLAST2.0,已將有缺口的比對序列也考慮在內(nèi)了。BLAST可處理任何數(shù)量的序列,包括蛋白序列和核算序列;也可選擇多個(gè)數(shù)據(jù)庫但數(shù)據(jù)庫必須是同一類型的,即要么都是蛋白數(shù)據(jù)庫要么都是核酸數(shù)據(jù)庫。所查詢的序列和調(diào)用的數(shù)據(jù)庫則可以是任何形式的組合,既可以是核酸序列到蛋白庫中作查詢,也可以是蛋白序列到蛋白庫中作查詢,反之亦然。

BLASTX是核酸序列到蛋白庫中的一種查詢。BLASTX是核酸序列到蛋白庫中的一種查詢。先將核酸序列翻譯成蛋白序列（一條核酸序列會被翻譯成可能的六條蛋白），再對每一條作一對一的蛋白序列比對。BLASTN是核酸序列到核酸庫中的一種查詢。BLASTN是核酸序列到核酸庫中的一種查詢。庫中存在的每條已知序列都將同所查序列作一對一地核酸序列比對二、實(shí)驗(yàn)?zāi)康呐c原理實(shí)驗(yàn)?zāi)康?從蝮蛇毒腺cDNA文庫中篩選有較大外源片段插入的克隆作候選陽性克隆,為下一步研究奠定基礎(chǔ)。（含有重組DNA分子的克隆子被稱為重組子，如果重組子中含有外源目的基因則又稱為陽性克隆）實(shí)驗(yàn)原理：由于cDNA文庫較大，一個(gè)個(gè)篩選工作量大，采用菌落PCR法可以同時(shí)對多個(gè)克隆進(jìn)行初步鑒定，明確克隆體內(nèi)是否有較大外源cDNA片段，然后可以對陽性克隆做進(jìn)一步的篩選，提高篩選效率。故本次實(shí)驗(yàn)采菌落PCR法進(jìn)行陽性克隆的篩選。菌落PCR是以文庫中隨機(jī)挑取的菌落克隆為模板，采用特異性引物或通用引物對目的基因進(jìn)行擴(kuò)增,用來鑒定和篩選陽性克隆的技術(shù)。Sathe等將含有重組質(zhì)粒的細(xì)菌經(jīng)過94°C變性1min以后，用倒置顯微鏡觀察，發(fā)現(xiàn)大部分細(xì)胞破裂，釋放出其DNA,因此可將其細(xì)菌直接作為PCR反應(yīng)的模板，而不需要抽提、純化質(zhì)粒DNA。菌落PCR技術(shù)操作過程簡單，時(shí)間周期短，高通量，不僅提高了鑒定的效率，而且提高了鑒定的準(zhǔn)確性。雙脫氧鏈終止法測序原理：核酸模板在核酸聚合酶、引物、四種單脫氧堿基存在條件下復(fù)制或轉(zhuǎn)錄時(shí)，如果在4個(gè)反應(yīng)系統(tǒng)中分別按比例引入四種雙脫氧堿基，只要雙脫氧堿基摻入鏈端，該鏈就停止延長，鏈端摻入單脫氧堿基的片段可繼續(xù)延長。如此每管反應(yīng)體系中便合成以共同引物為5'端，以雙脫氧堿基為3'端的一系列長度不等的核酸片段。反應(yīng)終止后，分4個(gè)泳道進(jìn)行電泳。以分離長短不一的核酸片段（長度相鄰者僅差一個(gè)堿基），根據(jù)片段3'端的雙脫氧堿基，便可依次閱讀合成片段的堿基排列順序。三、材料和方法實(shí)驗(yàn)材料及試劑1.1實(shí)驗(yàn)材料待篩選的候選克隆，由課題組提供。1.2主要試劑LB培養(yǎng)基100mL配制：Bacto胰蛋白酶（DIFCO）lg,Bact酵母提取物（DIFCO）0.5g,NaCLlg,用1moL/LNaOH調(diào)pH至7.2,再補(bǔ)充雙蒸水至100mL，高溫滅菌。PCR相關(guān)試劑TaqDNA聚合酶、PCRMastermix：為Fermentus公司產(chǎn)品，針對不同蛋白家族的特異性引物1、引物2用生物信息學(xué)軟件設(shè)計(jì),由北京奧科生物技術(shù)有限公司合成。10mg/mLEB配制：小心稱量200mgEB，轉(zhuǎn)移到廣口瓶中，加入20mL雙蒸水,用磁力攪拌器攪拌直到完全溶解,用鋁箔包裹后,于4°C貯存電泳用瓊脂糖凝膠：為美國Ameresco公司產(chǎn)品。點(diǎn)樣緩沖液（Loadingbuffer）電泳緩沖液（50XTAE）配制：稱242gTris、溶于800mL雙蒸水中，加57.1mL冰醋酸和100mL0.5moL/LEDTA（pH8.0）,再加水定容至1L,室溫保存?zhèn)溆?.3儀器及其它試劑PCR儀、電泳儀、電泳槽、梳子、凝膠成像系統(tǒng)、低溫冰箱、恒溫?fù)u床、臺式高速離心機(jī)、微波爐、超凈工作臺、微量移液器（100uL、20uL、10uL、2uL）、槍頭、電子天平、恒溫水浴鍋、量筒（100mL）、酒精燈、雙蒸水、無菌牙簽、Eppendorf管（1.5mL,20個(gè)）、無菌試管（15mm*150mm5個(gè)）、250mL燒杯、玻璃棒、廣口瓶（1個(gè)）實(shí)驗(yàn)方法

2.1方法菌落PCR法。2.2技術(shù)路線（1）準(zhǔn)備:各種試劑及器材的準(zhǔn)備（見材料與試劑）（2） 搖菌:從文庫保存平板上隨機(jī)挑取5-10個(gè)單菌落克隆,分別接種到盛有500此LB液體培養(yǎng)基中（氨芐抗性），然后置于37°C恒溫?fù)u床中過夜培養(yǎng)。（3） 裂解菌體:取1.5mLEppendorf管，分別取20yL單克隆培養(yǎng)物分別加至到PCR管中,12000RPM離心1Min，將管中的上清取掉。PCR擴(kuò)增:PCR反應(yīng)體系（25uL）:1uL1uL10XPCRMasterMix12.5uL引物1(10umoL/L)1uL10XPCRMasterMix12.5uL引物1(10umoL/L)1uL引物2(10umoL/L)1uL加入一滴礦物油，離心30s.PCR反應(yīng)條件：預(yù)變性：94C5min變性：94C30s"退火:55C30s延伸:72C1-2min最終延伸：72C10min保存:4Coo滅菌去離子水>30個(gè)循環(huán)9.5uL

9.5uL（5）1%瓊脂糖凝膠電泳稱量0.5g瓊脂糖，轉(zhuǎn)入耐熱錐形瓶內(nèi)，加50mLTBE，用微波爐熔化，然后加2uLEB，混勻。在電泳槽內(nèi)插入梳子，平放于試驗(yàn)臺上，待凝膠冷卻到50-60°C后倒入電泳槽。加電泳緩沖液至充分沒過凝膠。拔出梳子時(shí)應(yīng)謹(jǐn)慎。取10uL擴(kuò)增物加入2uL點(diǎn)樣緩沖液（Loadingbuffer）,混合均勻。然后小心地加入凝膠點(diǎn)樣孔中，旁邊加上DNAMarker，然后開始電泳，電泳10-20min，等溴酚藍(lán)跑到凝膠前沿時(shí)停止。（6）結(jié)果把凝膠放到紫外成像儀下觀察，參照DNAmarker和DNA片段所在位置判斷PCR產(chǎn)物大小，選擇符合預(yù)期的克隆用雙脫氧鏈終止法測序。TAGCAACStlAlTdGTPdCl?dHP+dtfriTdA'IltlAlTdGTPdCl?dHP+dtfriTdA'Il1GTP

dCIT+ddCTP

emFdATPdGTP+ddGTPdCI'Pdi[TdA'ir+ddAIPdWjcn1UH?-AlCGIdJI-ATCGddT-AdJT、-AlCGIdJI-ATCGddT-AdJT、-ATcidCAlCGTrddG-ATCcidGddATCGA雙脫氧鏈終止法測序流程圖7）生物信息學(xué)分析按照候選克隆的測序結(jié)果，訪問NCBI網(wǎng)站，在線對測序結(jié)果作BlastX和blastn比對分析，構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹，分析蛋白的結(jié)構(gòu)域，為下一步的基因工程表達(dá)和功能研究奠定基礎(chǔ)。參考文獻(xiàn):請參照新文獻(xiàn)1、 J.薩姆布魯克等?分子克隆實(shí)驗(yàn)指南[M].北京:化學(xué)工業(yè)出版社，2007。2、 張軍科.白粉菌誘導(dǎo)的華東葡萄環(huán)化cDNA文庫中抗病基因篩選[J].中國農(nóng)業(yè)科學(xué),2010。3、 趙巧蓮.管圓線蟲V期幼蟲cDNA文庫的構(gòu)建及免疫學(xué)篩選J].中國病原生物學(xué)雜志,2010。4、 詹曉娟.三葉因子2相互作用蛋白基因在胃癌細(xì)胞cDNA文庫中的篩選J].世界華人消化雜志,2009。5、 劉琴.東方巴貝蟲cDNA文庫的構(gòu)建與免疫學(xué)篩選J].中國寄生蟲學(xué)與寄生蟲病雜志，2009.6、 李華等.菌落