初始污染菌方法驗證

常州賀利氏醫(yī)療器械有限公司初始污染菌方法檢查驗證方案編制: 日期審核： 日期批準：日期：初始污染菌檢查驗證方案目錄1.驗證目的2.參照標準3.驗證項目驗證小組及職責5.合格標準6.試驗材料：7.菌液制備8.菌液計數(shù)培養(yǎng)基的制備細菌、霉菌及酵母菌計數(shù)方法的驗證菌回收率計算公式12.結果及結論1.驗證目的：建立本公司醫(yī)療器械產(chǎn)品表面微生物限度檢查方法，本公司產(chǎn)品初始污染菌系采用平皿法現(xiàn)對該方法進行驗證，以確認該方法適合于產(chǎn)品表面初始污染菌的檢查。2.參照標準：2010版中國藥典二部附錄XIJ微生物限度檢查法。3.驗證項目：本公司醫(yī)療器械產(chǎn)品表面微生物限度檢查。4.驗證小組人員及職責：驗證小組人員:小組人員職務姓名所在部門職務組長巢雪芬質量部部門負責人組員吳海雙質量部專職檢驗員組員秦亞芬質量部專職檢驗員驗證人員職責及要求按驗證方案及相關文件實施驗證。認真觀察并做好驗證原始記錄。4.2.3對實施驗證的結果負責。4.3驗證中各部門的職責4.3.1驗證領導組職責制訂驗證總計劃，負責全公司驗證工作的管理4.3.1.2確定驗證項目及驗證項目負責人。4.3.1.3負責驗證方案的批準工作。4.3.1.4負責驗證資料及結果的審核工作。4.3.1.5負責驗證報告的批準工作。4.3.2驗證工作小組職責4.3.2.1負責驗證方案的起草工作。4.3.2.2參與驗證方案的討論、確認工作。4.3.2.3負責驗證方案的實施。負責驗證結果的分析、統(tǒng)計、報告工作。4.3.2.5參與驗證結果的評價工作。質量部職責4.3.3.1負責公司驗證日常管理工作。4.3.3.2負責驗證方案的審核工作。負責驗證過程中儀器、儀表、計量器具的校驗工作。4.3.3.4負責檢驗儀器及檢驗方法的驗證。負責驗證中各項檢測工作，提供驗證的檢驗記錄、檢驗報告，對驗證過程中的各項檢驗工作負責。負責對驗證人員的培訓、考核工作。4.3.3.7負責驗證資料和報告的審核工作。4.3.3.8負責驗證文件回收、歸檔管理工作。合格標準：實驗組的菌回收率和稀釋劑對照組的菌回收率均不得低于70%。6.試驗材料：被驗證產(chǎn)品：本公司醫(yī)療器械產(chǎn)品吻合器儀器設備：YXQ-LS-18SI型手自動提式滅菌器YJ875SDA型凈化臺MJX-100B-Z型霉菌培養(yǎng)箱（23?28°C）HPX-9162MBE數(shù)顯式恒溫培養(yǎng)箱（30?35C）202-OA型電熱恒溫干燥箱6.3.驗證用培養(yǎng)基名稱生產(chǎn)廠家批號營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基上海中科昆蟲生物技術開發(fā)有限公司110429改良馬丁培養(yǎng)基上海中科昆蟲生物技術開發(fā)有限公司100415改良馬丁瓊脂培養(yǎng)基上海中科昆蟲生物技術開發(fā)有限公司101203玫瑰紅鈉瓊脂培養(yǎng)基上海中科昆蟲生物技術開發(fā)有限公司1105266.4.驗證用菌株：（第 代）驗證菌株培養(yǎng)基培養(yǎng)溫度培養(yǎng)時間（小時）大腸埃希菌營養(yǎng)肉湯30—35C18—24金黃色葡萄球菌營養(yǎng)肉湯30—35C18—24枯草芽抱桿菌營養(yǎng)肉湯30—35C18—24白色念珠菌改良馬丁培養(yǎng)基23—28C24—48黑曲霉菌改良馬丁瓊脂培養(yǎng)基23—28C5—7（天）7.菌液制備7.1.接種大腸埃希菌、金黃色葡萄球菌、與枯草芽孢桿菌的新鮮培養(yǎng)物至營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基中，于30?35°C培養(yǎng)18?24小時。取經(jīng)30?35°C培養(yǎng)18?24小時的大腸埃希菌、金黃色葡萄球菌、與枯草芽抱桿菌營養(yǎng)肉湯新鮮培養(yǎng)物1ml加入到9ml0.9%無菌氯化鈉溶液中，10倍稀釋至10-6?10-7約為50?100cfu/ml的菌懸液備用。72接種白色念珠菌的新鮮培養(yǎng)物至改良馬丁培養(yǎng)基中，于23?28C培養(yǎng)24~48小時。取經(jīng)23?28C培養(yǎng)24~48小時的白色念珠菌改良馬丁液體培養(yǎng)物1ml加入到9ml0.9%無菌氯化鈉溶液中，10倍稀釋至10-5約為50~100cfu/ml的菌懸液備用。接種黑曲霉菌的新鮮培養(yǎng)物至改良馬丁瓊脂斜面培養(yǎng)基上，于23?28C培養(yǎng)5?7天，加入3?5ml含0.05%(ml/ml)聚山梨脂80的0.9%無菌氯化鈉溶液，將抱子洗脫。然后，用無菌吸管吸出抱子懸液至無菌試管內，用含0.05%(ml/ml)聚山梨脂80的0.9%無菌氯化鈉溶液制成每1ml含抱子數(shù)50?100cfu/ml的菌懸液備用。菌液計數(shù)：(每種菌液接種2個平皿)大腸埃希菌、金黃色葡萄球菌與枯草芽抱桿菌分別取1ml接種至營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基中，置30?35°C培養(yǎng)48小時；白色念珠菌、黑曲霉分別取1ml接種至玫瑰紅鈉瓊脂培養(yǎng)基，置23?28C培養(yǎng)72小時。菌落計數(shù)結果(2個平皿計數(shù)取平均值)見下表菌落計數(shù)結果(cfu/ml)試驗次數(shù)10-5稀釋10-6稀釋10-7稀釋123123123大腸埃希菌797573金黃色葡萄球菌556263枯草芽抱桿菌667263白色念珠菌747577黑曲霉555356培養(yǎng)基的制備取配好的營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基和玫瑰紅鈉瓊脂培養(yǎng)基，加熱至液態(tài)，倒入已滅菌的培養(yǎng)皿中約15-20ml,冷卻。細菌、霉菌及酵母菌計數(shù)方法的驗證驗證方法驗證試驗至少應進行3次獨立的平行試驗，并分別計算各試驗菌（金黃色葡萄球菌、大腸埃希菌、枯草芽孢桿菌、白色念珠菌、黑曲霉）每次試驗的回收率。10.1試驗組分別取樣品lml（注：我公司醫(yī)療器械是硬件產(chǎn)品，加20ml無菌氯化鈉進行洗脫）和50?1OOcfu的試驗菌（金黃色葡萄球菌、大腸埃希菌、枯草芽抱桿菌），分別注入平皿中，立即傾注營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基中，每珠試驗菌平均傾注2個平皿，于30?35°C培養(yǎng)3天。分別取樣品lml（注：我公司醫(yī)療器械是硬件產(chǎn)品，加20ml無菌氯化鈉進行洗脫）和50?1OOcfu的試驗菌（白色念珠菌、黑曲霉），分別注入平皿中，立即傾注玫瑰紅鈉瓊脂培養(yǎng)基中，每珠試驗菌平均傾注2個平皿，于23?28C培養(yǎng)5天。菌液組取3份營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基分別向里面加入含50~100個/ml菌（CFU）的金黃色葡萄球菌菌液、大腸埃希菌菌液、枯草芽抱桿菌菌液。另取2個玫瑰紅鈉瓊脂培養(yǎng)皿加入含50~100個/ml菌（CFU）的白色念珠菌、黑曲霉菌。供試品對照組取樣品2ml分別注入營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基中于30?35C培養(yǎng)3天和玫瑰紅鈉瓊脂培養(yǎng)基中于23?28C培養(yǎng)5天。稀釋劑對照組取無菌氯化鈉3ml和50?100cfu的試驗菌（金黃色葡萄球菌、大腸埃希菌、枯草芽抱桿菌），分別注入平皿中，立即傾注營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基中，每珠試驗菌平均傾注2個平皿，于30?35C培養(yǎng)3天。取無菌氯化鈉2ml和50?100cfu的試驗菌（白色念珠菌、黑曲霉），分別注入平皿中，立即傾注玫瑰紅鈉瓊脂培養(yǎng)基中，每珠試驗菌平均傾注2個平皿，于23?28C培養(yǎng)5天。菌回收率計算試驗組平均菌落數(shù)-供試品對照組平均菌落數(shù)11.1試驗組的菌回收率（％）= X100%菌液組平均菌落數(shù)稀釋劑對照組平均菌落數(shù)11.2稀釋劑對照組的菌回收率（％）= X100%菌液組平均菌落數(shù)12.結果見附錄附表1：試驗時間2012年3月日 完成時間2012年3月26日驗證菌株試驗組（回收率）菌液組供試品對照組稀釋劑對照組（回收率）金黃色葡萄球菌（培養(yǎng)3天計數(shù)）53(89.5%)57254(94.7%)61(93.8%)64162(96.9%)51(89.1%)55253(96.4%)大腸埃希菌（培養(yǎng)3天計數(shù)）72(95%)76271(93.4%)75(93.7)79177(97.5%)77(95%)80178(97.5%)枯草芽抱桿菌（培養(yǎng)3天計數(shù)）62(89.6%)67261(91%)63(90%)70062(88.6%)67(91.7%)72167(93.1%)白色念珠菌（培養(yǎng)5天開始計數(shù)）73(91%)78272(92.3