生物正交氧化還原體系的構(gòu)建及意義,生物化學(xué)論文

生物正交氧化還原體系的構(gòu)建及意義,生物化學(xué)論文細(xì)胞內(nèi)代謝經(jīng)過除以碳骨架構(gòu)造改變?yōu)橹鞯奈镔|(zhì)轉(zhuǎn)化外，通常還伴隨輔因子介導(dǎo)的能量轉(zhuǎn)移。物質(zhì)轉(zhuǎn)化和能量轉(zhuǎn)移高度耦合，顯著增加了代謝系統(tǒng)的復(fù)雜度。氧化復(fù)原輔因子通過在氧化態(tài)和復(fù)原態(tài)之間循環(huán)再生傳遞電子，將物質(zhì)轉(zhuǎn)化途徑關(guān)聯(lián)成復(fù)雜的代謝網(wǎng)絡(luò)[1].據(jù)不完全統(tǒng)計(jì)，在微生物中僅吡啶核苷酸輔酶〔nicotinamideadeninedinucleotide〔phosphate〕，NAD〔P〕〕及其復(fù)原態(tài)介入的生化反響就超過1000種[2],這還不包括它們介入的其他生物學(xué)經(jīng)過。傳統(tǒng)生物化學(xué)研究提供了大量生物學(xué)元件[3,4],系統(tǒng)生物學(xué)研究建立了各種代謝模型[5,6],分子生物學(xué)發(fā)展提供了有效的遺傳操作方式方法，使設(shè)計(jì)和構(gòu)建新的高效、受控的物質(zhì)轉(zhuǎn)化途徑成為可能。然而，輔因子在代謝網(wǎng)絡(luò)中的節(jié)點(diǎn)作用使各種生化反響建立起復(fù)雜的互相作用網(wǎng)絡(luò)，極大地影響了外源途徑在底盤細(xì)胞代謝環(huán)境中的功能。以氧化復(fù)原代謝為例，新途徑可能毀壞宿主內(nèi)源氧化復(fù)原平衡，進(jìn)而抑制生長(zhǎng)，使新途徑難以產(chǎn)生預(yù)期效果[7].人工構(gòu)建的外源途徑對(duì)底盤細(xì)胞中天然代謝網(wǎng)絡(luò)的互相干擾，十分是氧化復(fù)原環(huán)境的干擾，是影響外源合成途徑與底盤細(xì)胞適配性的重要因素。通過調(diào)節(jié)胞內(nèi)輔因子水平，如控制酶的表示出水平、優(yōu)化代謝途徑、改造酶的輔因子偏好性以及敲除競(jìng)爭(zhēng)代謝途徑等，能夠優(yōu)化外源途徑與底盤細(xì)胞的適配性，在一定程度上提高代謝調(diào)控效率[8~10].但輔因子擾動(dòng)的生物學(xué)效應(yīng)的可控性和可預(yù)見性低。例如，琥珀酸生產(chǎn)需要維持胞內(nèi)較高NADH水平，但高NADH水平影響菌株對(duì)培養(yǎng)條件的適應(yīng)性[11].設(shè)計(jì)脂肪酸生產(chǎn)菌株時(shí)需要使脂肪酸合成途徑與宿主NADPH供應(yīng)能力相匹配，但由于無法確定擾動(dòng)NADPH水平對(duì)代謝造成的全局性影響，無法預(yù)測(cè)適宜的外源基因表示出強(qiáng)度，需要挑選不同表示出強(qiáng)度的啟動(dòng)子表示出外源基因[12].輔因子關(guān)聯(lián)作用導(dǎo)致的復(fù)雜性也是限制代謝途徑可移植性的重要因素。例如，在大腸桿菌〔Escherichiacoli〕中構(gòu)建的高效丁醇合成途徑,移植到藍(lán)細(xì)菌〔Cyanobacteria〕中就難以到達(dá)積累丁醇的效果，由于藍(lán)細(xì)菌傾向于積累NADPH而非NADH[13,14].因而，提高人工代謝途徑在底盤細(xì)胞中的適配性、可預(yù)見性和可移植性需要降低代謝系統(tǒng)，十分是輔因子依靠型氧化復(fù)原系統(tǒng)的復(fù)雜度。1正交氧化復(fù)原體系為降低代謝系統(tǒng)復(fù)雜度，可設(shè)計(jì)獨(dú)立于生長(zhǎng)代謝的合成途徑及獨(dú)立的輔因子循環(huán)再生體系。這種在復(fù)雜代謝體系中執(zhí)行系統(tǒng)子功能，并且其執(zhí)行經(jīng)過獨(dú)立于系統(tǒng)其他組件的子系統(tǒng)稱為正交體系。正交體系的設(shè)計(jì)構(gòu)建經(jīng)過即正交化[15].正交氧化復(fù)原體系是指電子傳遞獨(dú)立于系統(tǒng)其他氧化復(fù)原輔因子系統(tǒng)的一種氧化復(fù)原體系。當(dāng)前主要有兩種策略可用于構(gòu)建正交氧化復(fù)原體系：〔ⅰ〕在空間上分隔輔因子依靠型體系，即空間正交氧化復(fù)原體系〔ⅱ〕構(gòu)建利用人工輔因子代替天然輔因子的體系，即生物正交氧化復(fù)原體系[8,15].設(shè)計(jì)構(gòu)建正交氧化復(fù)原體系，是減少外源途徑對(duì)底盤細(xì)胞中天然代謝網(wǎng)絡(luò)的干擾，提高外源合成途徑與底盤細(xì)胞適配性的重要策略。下面綜述正交氧化復(fù)原體系的設(shè)計(jì)和應(yīng)用特點(diǎn)。2空間正交氧化復(fù)原體系空間正交氧化復(fù)原體系通過將相關(guān)的酶及輔因子限定在特定區(qū)域，提高局部底物和輔因子濃度、減少或避免與其他子系統(tǒng)的互相作用[16,17],當(dāng)前主要通過構(gòu)建融合蛋白和設(shè)計(jì)蛋白錨定支架實(shí)現(xiàn)，并已有多個(gè)成功應(yīng)用的報(bào)道。另外，近期發(fā)現(xiàn)，細(xì)胞內(nèi)可構(gòu)成一些特殊的微區(qū)室〔microcompartment〕，能夠有效限制輔因子或代謝中間體擴(kuò)散，進(jìn)而避免胞內(nèi)輔因子水平干擾微區(qū)室內(nèi)氧化復(fù)原代謝[18,19].利用微區(qū)室可以構(gòu)建空間正交氧化復(fù)原體系[15].蛋白融合技術(shù)通過基因工程手段將多個(gè)酶用短肽序列連接構(gòu)成融合蛋白，通過調(diào)整連接肽特性和酶的連接方向控制酶的空間定位〔圖1A〕，優(yōu)化級(jí)聯(lián)催化經(jīng)過中底物和能量傳遞[20].蛋白錨定支架技術(shù)通過調(diào)整支架上的錨定位點(diǎn)距離、各種錨定位點(diǎn)的數(shù)量和連接肽特性3種方式調(diào)整酶的空間定位和比例〔圖1B〕，可降低代謝網(wǎng)絡(luò)對(duì)目的途徑的影響，提高目的途徑底物和輔因子的局部濃度，減少與環(huán)境的互相影響[21].兩種空間正交氧化復(fù)原體系構(gòu)建策略都遭到連接肽特性的影響，由于連接肽及蛋白構(gòu)造和功能的多樣性，需要通過挑選確定適宜的連接肽柔性和長(zhǎng)度，優(yōu)化酶的空間定位[2,22].連接肽通常使用柔性序列GGGGS〔G4S〕[23~26],通過調(diào)整其拷貝數(shù)改變連接肽長(zhǎng)度，但有時(shí)利用剛性氨基酸延長(zhǎng)連接肽效果更好，如將惡臭假單胞菌〔Pseudomonasputida〕細(xì)胞色素P450〔P450cam〕、假單胞氧還蛋白〔putidaredoxin,PdX〕和假單胞氧還蛋白復(fù)原酶〔putidaredoxinreductase,PdR〕分別與硫磺礦硫化葉菌〔Sulfolobussolfataricus〕的增殖細(xì)胞核抗原〔proliferatingcellnuclearantigen,PCNA〕融合時(shí)，比擬兩組連接肽G4S-〔P5〕n-G4S〔n=1~5〕和〔G4S〕n〔n=1~6〕效果，以G4S-〔P5〕4-G4S連接時(shí)活性最高〔〔6.50.3〕mol/〔Lmin〕〕，而〔G4S〕n〔n=1~6〕最高活性〔G4S〕5約為5mol/〔Lmin〕[22].相比于柔性，調(diào)節(jié)連接肽長(zhǎng)度效果通常更顯著，上述實(shí)例中最適連接肽長(zhǎng)度對(duì)應(yīng)活性比n=1時(shí)提高兩倍。長(zhǎng)度選擇也是最常見的連接肽優(yōu)化方式。在P450單加氧酶CinA的C-末端融合黃素氧還蛋白CinC,催化桉樹醇轉(zhuǎn)化為2-羥基-桉樹醇，發(fā)現(xiàn)當(dāng)連接肽長(zhǎng)度為10個(gè)氨基酸時(shí)產(chǎn)量最高，少于4個(gè)氨基酸時(shí)檢測(cè)不到催化活性[2].除了連接肽特性，空間正交氧化復(fù)原體系構(gòu)建還需要綜合優(yōu)化多種因素以在提高體系獨(dú)立性的同時(shí)獲得更好的催化活性。構(gòu)建融合蛋白要考慮融合方向?qū)Υ呋实挠绊?將丙酮丁醇梭菌〔Clostridiumacetobutylicum〕來源的氫酶〔hydrogenase,H2ase〕融合鐵氧還蛋白〔ferredoxin,FD〕促進(jìn)產(chǎn)氫時(shí)，用2個(gè)氨基酸殘基連接時(shí)，F(xiàn)D連在H2ase的C-末端對(duì)產(chǎn)氫經(jīng)過無促進(jìn)作用，而連在N-末端氫氣產(chǎn)量提高約3倍[26].這是由于H2ase與FD作用位點(diǎn)在氫酶N-末端，N-末端融合更利于兩個(gè)蛋白互相作用。這種融合蛋白組合的催化效率也受連接肽長(zhǎng)度的影響，以14個(gè)氨基酸殘基連接效果最好，產(chǎn)氫效率提高近5倍，延長(zhǎng)至46個(gè)氨基酸殘基幾乎沒有促進(jìn)作用[26].與蛋白融合技術(shù)相比蛋白錨定支架技術(shù)可更自若地設(shè)計(jì)酶的空間分布和計(jì)量關(guān)系[27,28].仍以上述H2ase與FD生物轉(zhuǎn)化產(chǎn)氫途徑為例：將真核信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)相關(guān)的PDZ〔postsynapticdensityproteinof95kilodaltons,disclarge,zonaoccludens-1〕，SH3〔sarcomahomology3〕和GBD〔gelatinbindingdomain〕3種構(gòu)造域整合到支架蛋白上，通過配體肽段將催化生物合成的酶特異性結(jié)合到支架蛋白的對(duì)應(yīng)位置，這種設(shè)計(jì)能夠通過調(diào)整H2ase和FD在支架上的結(jié)合位置、酶與支架配體間連接肽的長(zhǎng)度、結(jié)合域數(shù)量等調(diào)整酶的空間分布與比例[26].結(jié)合域在支架上間距靠近時(shí)產(chǎn)氫效率高；結(jié)合域相對(duì)位置一樣，F(xiàn)D與支架蛋配體白的連接肽長(zhǎng)度分別為10,20,40個(gè)氨基酸時(shí)，延長(zhǎng)肽鏈長(zhǎng)度可使氫氣產(chǎn)量提高3~5倍；通過調(diào)整支架蛋白上的PDZ,SH3和GBD結(jié)合域比例調(diào)整FD:H2ase比率，比率越小產(chǎn)氫效率越高[26].除了蛋白，DNA,RNA等大分子可以作為蛋白錨定支架[20,29,30],并且隨著DNA合成技術(shù)發(fā)展及對(duì)DNA,RNA構(gòu)造預(yù)測(cè)能力的提高，基于核酸的支架遭到更多重視。利用DNA整合NAD〔P〕H:黃素單核苷酸〔flavinmononucleotide,FMN〕氧化復(fù)原酶和熒光素酶，復(fù)原力NADH經(jīng)過NAD〔P〕H:FMN氧化復(fù)原酶?jìng)鬟f給FMN,然后傳遞給熒光素酶，與分別連在兩條不同DNA鏈上的游離狀態(tài)相比，連在同一DNA鏈上時(shí)活性提高到2~3倍[31].支架能夠是單個(gè)分子，可以以是可自組裝的蛋白亞基。如將前述P450cam,PdX,PdR和亞磷酸脫氫酶分別與PCNA