農(nóng)藥毒理學課件 農(nóng)藥毒理學實驗指導書

農(nóng)藥毒理學實驗指導書植物保護學院農(nóng)藥毒理學實驗指導書植物保護學院農(nóng)藥教研室2008-08-01

Ⅰ驗證性實驗實驗一殺蟲劑對昆蟲表皮的穿透作用--生測法一、試驗原理和目的殺蟲劑進入有機體內(nèi)的途徑有多種，其中以對表皮的穿透作用最為重要。藥劑的穿透性在很大程度上決定于昆蟲表皮的結構和組成。由于表皮對化學物質具有一定的選擇吸收作用，因此不同種類的昆蟲對同一種藥劑的滲透性表現(xiàn)不同；不同的昆蟲個體或同一個體的不同部位，其滲透性也有較大差異；不同的物質或同一藥劑的不同濃度，其穿透性也有所不同。本實驗用點滴蟲體不同部位的藥效比較及用點滴和注射法的藥效比較，來測定藥劑對昆蟲表皮的穿透作用，以深入理解表皮的結構對藥劑穿透的影響。二、儀器、試劑和材料1.儀器電子天平、容量瓶(10ml12個)、微量點滴器（1μl）、青霉素小瓶若干、培養(yǎng)皿（10cm40套）、鑷子、吸管（1ml3支，5ml1支）2.試劑丙酮、乙醚、馬拉硫磷原藥、魚藤酮原藥3.供試昆蟲黃粉甲成蟲、粘蟲或棉鈴蟲老齡幼蟲三、操作步驟1.不同部位施藥法取黃粉甲成蟲50頭，分成5組，每組10頭。用乙醚麻醉后，以0.1%的馬拉硫丙酮溶液1微升分別滴涂于觸角、附節(jié)、胸部背板及腹部腹面節(jié)間膜上。對照蟲僅以丙酮滴涂觸角。處理后分別移至小養(yǎng)蟲皿內(nèi)，經(jīng)4、8、12、24、48小時觀察蟲體反應及其死亡情況。將觀察情況列于表1中，并計算24小時后的死亡率%，對照組若有死亡則需校正。死亡率（%）=死蟲數(shù)/總蟲數(shù)×100樣正死亡率（%）=（處理組死亡率-對照組死亡率）/（100-對照組死亡率）×100以不同時間作橫坐標，死亡率為縱坐標，制出不同時間的死亡曲線。比較分析點清蟲體不同部位后死亡情況與表皮穿透的關系。表1蟲體不同部位施藥后的死亡情況時間地點部位農(nóng)藥濃度（%）施藥量（μl/頭）藥后不同時間（h）死亡率（%）24h校正死亡率（%）48122448背板腹部觸角跗節(jié)CK2.體表及體腔內(nèi)施藥法(點滴及注射法)配制0.05%、0.1%、0.2%、0.3%、0.4%的魚藤酮丙酮溶液作注射用，同上另配制0.5%、1%、2%、3%、4%的藥液作點滴用。取蛻皮后0.5-1天的粘蟲或棉鈴蟲老齡幼蟲360頭，分成兩批，每批分5個處理，每處理30頭蟲，第一批各處理分別注射各濃度藥液1微升于試蟲第二對腹足，對照組注射等量丙酮。第二批分組處理與第一組相同，以所配點滴用藥液以1μl/頭的量分別滴涂于蟲體胸部背板，對照組施等量丙酮。按上述方法處理完畢后，分別置于小養(yǎng)蟲皿內(nèi)，每皿放5頭蟲，并投入少許飼料，隔2、4、6、12、24小時分別觀察其死亡情況，記錄于表2。根據(jù)記錄結果，計算24小時后的死亡率(或校正死亡率)，將劑量轉換成對數(shù)(X)，死亡率(或校正死亡率)轉換成機率值(Y)，用計算器求注射及點滴試驗的致死中量(LD50),并計算點滴LD50與注射LD50的比率，以此推定魚藤酮對試蟲表皮的滲透性。表2點滴和注射法施用魚藤酮毒力實驗結果時間地點處方法理處理劑量（μg/頭）劑量對數(shù)logx+2死亡蟲數(shù)死亡率（%）校正死亡率（%）校正死亡率機率值（Y）注射點滴

實驗二幾種不同類型殺蟲劑對昆蟲致毒癥狀觀察一、試驗原理和目的當殺蟲劑作用于昆蟲后，昆蟲在行為、形態(tài)、體征等方面發(fā)生異?；蚋淖?，即為中毒癥狀。不同類型的殺蟲劑，其作用機理不同，中毒癥狀也有所不同。研究新殺蟲化合物的致毒癥狀可為研究其作用機理提供思路和依據(jù)。本實驗的目的在與：觀察不同類型殺蟲劑致使昆蟲中毒在癥狀上的差異。聯(lián)系各類殺蟲劑的致毒機理，根據(jù)蟲中毒癥狀進行分析與綜合，加深理解幾類重要殺蟲劑的作用特點，并以此解釋生產(chǎn)實踐中的具體現(xiàn)象，特別是為某些緩效型、新型、特異性殺蟲劑的應用和推廣提供理論依據(jù)。二、儀器、試劑和材料1.儀器培養(yǎng)皿(Φ:7cm)、養(yǎng)蟲盒(Φ:4cm、h:7cm)、微量點滴儀、打孔器(0.4cm,lcm各l個)、解剖鏡。2.試劑a、有機磷類殺蟲劑：馬拉硫磷、久效磷b、有機氯類殺蟲劑：林丹、DDTc、氨基甲酸酯類殺蟲劑；西維因、呋喃丹d、沙蠶毒類殺蟲劑:巴丹、殺蟲單(雙)e、脒類殺蟲劑:殺蟲脒f、除蟲菊酯類殺蟲劑:氯氰菊酯、功夫g、礦物油類殺蟲劑:機油乳劑h、植物性殺蟲劑：魚藤酮、印楝油、川楝素、苦皮藤i、生物性殺蟲劑:B·T·乳劑3.供試昆蟲a.粘蟲(leucaniaseprata)：室內(nèi)飼養(yǎng)，試驗時挑選發(fā)育良好的5齡中期幼蟲供試。b.棉鈴蟲(Heliothisarimgera)：室內(nèi)飼養(yǎng)，試驗時挑選健康的5齡中期幼蟲供試。c.小菜蛾(Plutellaxylostella)：室內(nèi)飼養(yǎng)，試驗時挑選健康的3齡中期幼蟲供試。d.玉米象(SitopHiluszeamais)：室內(nèi)飼養(yǎng)，試驗時挑選羽化3天后的成蟲供試。e.黃粉甲(Tenebriomolitor)：室內(nèi)飼養(yǎng)，試驗時挑選羽化3天后的成蟲供試。三、操作步驟1.點滴法試驗時挑取適宜的試蟲，用微量點滴儀在試蟲的前胸背板上定量點滴藥劑的丙酮稀釋液(對照組只點等量丙酮)。每藥劑處理用蟲10-20頭，分置于培養(yǎng)皿(養(yǎng)蟲盒)內(nèi)，用正常飼料飼喂，于養(yǎng)蟲室(T:250C,RH:75%,L/D:12h/12h)內(nèi)飼養(yǎng)，定時觀察記載試蟲中毒癥狀。2．飼喂法:A.粘蟲打制葉蝶(Φlcm)，于一定濃度藥劑丙酮液中浸3-5秒鐘，晾干后，置于鋪有濕濾紙的培養(yǎng)皿中。接蟲前將試蟲饑餓5-8小時，每藥劑處理用試蟲10-20頭，于養(yǎng)蟲室內(nèi)飼養(yǎng)，定時觀察記載試蟲中毒癥狀。B.棉鈴蟲配制加藥飼料，每皿中加入適量飼料，接入饑餓1天后的試蟲，每藥劑處理用試蟲10-20頭，于養(yǎng)蟲室內(nèi)飼養(yǎng)，定時觀察并記載試蟲中毒癥狀。C.小菜蛾打制葉蝶(Φ0.4cm)，于一定濃度的丙酮藥液中浸3-5秒鐘，置于鋪有濕濾紙的養(yǎng)蟲盒內(nèi)，接入饑餓4-5小時后的試蟲，每藥劑處理用試蟲30-50頭，于養(yǎng)蟲室內(nèi)飼養(yǎng)，定時觀察記載試蟲中毒癥狀。四、結果處理詳細觀察并描述記錄各藥劑的致毒癥狀，歸納總結各類殺蟲劑致毒癥狀的特點，分析癥狀與機理之間的關系，比較不同類殺蟲劑在癥狀與機理上的區(qū)別，并闡述癥狀學在毒理學研究及生產(chǎn)實踐中的意義。

實驗三羧酸酯酶活性測定一、試驗原理和目的羧酸酯酶(carboxylesterases，CaE)是昆蟲體內(nèi)的一類重要代謝酶，其相對分子量為60000u。和AchE相似，CaE也是絲氨酸酶，活性部位是絲氨酸羥基。催化水解底物羧酸酯的反應可分為兩步：①羧酸酯?；疌aE的活性部位絲氨酸；②加水脫羧作用。測定該酶活性是探索昆蟲對殺蟲劑代謝作用及確定該酶的代謝作用增強是否參與了抗性的一項重要指標，也是殺蟲劑毒理學、昆蟲對寄主植物適應性中的重要研究內(nèi)容之一。測定原理同酯酶活性測定。二、儀器、試劑和材料1.儀器恒溫水浴、勻漿器、離心機，分光光度計、試管、燒杯、移液管、滴管、量筒、鑷子等。2.供試昆蟲粘蟲、棉鈴蟲、小菜蛾等鱗翅目高齡幼蟲。3.試劑(1)0.2MPH7.0PBS；(2)0.04MPH7.0PBS；(3)O.OO1M毒扁豆堿丙酮液取毒扁豆堿0.0275g，用不同溶解并定容至100ml；(4)O.OOO1M毒扁豆堿：取10mlO.OO1M毒扁豆堿丙酮液加90m1水；(5)0.0003M底物：配置稱取α-乙酸萘酯酸0.558g溶于丙酮中，定容至100ml為0.03M，然后取該溶液1ml，加O.OOO1M毒扁豆堿1ml,加O.04MPBS98ml；(6)0.OO1Mα-萘酚溶液：準確稱取α-萘酚0.0036g用少量丙酮溶解后，再用0.04MPBS定容至25ml；(7)顯色劑:使用前將5%十二烷基硫酸鈉溶液和1%堅牢藍B水溶液按5:2混合；(8)殺蟲劑原藥三、操作步驟1.試蟲處理方法采用點滴發(fā)或飼喂法以定量的供試藥劑進行處理，帶出現(xiàn)癥狀后，或間隔一定的時間取樣供試。2.酶液制備方法取供試昆蟲20頭,用0.04MPBS冰浴勻漿，定容至4ml,在40C4000rpm離心10min,取上清液作為酶源。3.酶活性測定方法（1）標準曲線按照下表加入試劑；將各管混勻后，室溫下放置30min,于600nm處比色測定OD值(重復3次取平均值)。按回歸分析法得出回歸式y(tǒng)=a+bx，式中x為α-萘酚含量，y為OD值。試劑管號012345671.OmMα-萘酚(ml)00.040.060.080.100.120.160.200.04MPBS(ml)65.965.945.925.90.5.885.845.80顯色液(ml)1.01.01.01.01.01.01.01.0(2)羧酸酯酶活性測定將酶液稀釋10倍，取0.2-0.5ml加入0.04MPBS，使總體積為lml,再加入5.0m10.0003M底物，370C水浴振蕩30min,加入顯色劑1.0ml,混勻后室溫下靜置30min,于600nm處比色測OD值；對照管中不加酶液，其它條件不變。(重復3次取平均值)(3)羧酸酯酶Km及Vmax的測定×0.0010.30.0750.150.30.61.22.44.8底物（ml）5.05.05.05.05.05.05.05.00.04MPBS(ml)1.00.60.60.60.60.60.60.6酶液(ml)00.40.40.40.40.40.40.4將上述三種溶液混勻，370C水浴振蕩15min后加人顯色劑1.0毫升，室溫下放置30min，于600nm處比色測OD值。(以Lineweaver-Bank法求出Km及Vmax)(4)酶液中蛋白質含量的測定(考馬司亮藍法)四、結果處理將測得的OD600值，用標準曲線方程求出相應的α-萘酚μM數(shù)。計算出酶液中的蛋白含量，以用15每分鐘每毫克蛋白可催化水解α-萘酚的微摩爾數(shù)作為酶活性的指標，比較分析藥劑對酶活力的影響。

實驗四血淋巴蛋白及酯酶同工酶的分離一、試驗原理和目的聚丙烯酰胺凝膠是一種人工合成的凝膠，具有機械強度好、彈性大、透明、化學穩(wěn)定性高、無電滲作用、設備簡單、樣品最?。?～100μg）、分辨率高等優(yōu)點，并可通過控制單體濃度或單體與交聯(lián)劑的比例，聚合成不同孔徑大小的凝膠，可用于蛋白質、核酸等分子大小不同的物質的分離、定性和定量分析。根據(jù)凝膠支柱形狀不一，可分為盤狀電泳和垂直板型電泳。盤狀電泳是在直立的玻璃管內(nèi)利用不連續(xù)的緩沖溶液、pH和凝膠孔徑進行的電泳。垂直板型電泳是將聚丙烯胺凝膠聚合成方形或長方形薄片狀，薄片可大可小。采用聚丙烯酰胺凝膠電泳技術分離蛋白質和酯酶同工酶，其分離效力遠大于醋酸纖維薄膜電泳，可以得到滿意的蛋白譜和酯酶同工酶譜，這種方法也適用于其它酶系同工酶的分離。這些譜帶在昆蟲生理、生態(tài)、病理、毒理及分類學等各個領域中具有重要的應用價值。通過實驗掌握凝膠電泳基本方法，并測定各種昆蟲在殺蟲藥劑處理后其血淋巴及各種組織的蛋白譜和酯酶譜，比較它們與正常主體之差異，有助于殺蟲劑致毒機理的深入探討。二、儀器、試劑和材料1.儀器高壓電泳儀與垂直平板電泳槽；冰箱、組織勻漿器；玻璃紙、吸水紙；離心機(6000g)；微量注射器(50u1)；刻度吸管、小試管或毛細吸管；注射器(5ml)及長針頭(8一1Ocm)；玻璃培養(yǎng)皿(直徑20cm)。2.供試昆蟲粘蟲和棉鈴蟲等鱗翅目昆蟲的幼蟲。，3.試劑(1)7.5%分離膠：4.93mlH2O，2.47ml30%Arc（丙烯酰胺）和Bis（N，N/甲叉雙丙烯酰胺），2.53mlPH8.9的Tris（三羥甲基氨基甲烷）-HCl，100μ110%AP,6μ1TMED（N，N，N/，N/-四甲基乙二胺）,共10ml。(2)3.5%大孔膠：3.74mlH2O，0.58ml30%Arc和Bis，0.63mlPH6.7的Tris-HCl，50μ110%AP,5μ1TMED,共10ml。(3)30%Arc和Bis：29gArc和1gBis,加蒸餾水定容至100ml。（溶解時需加溫，但要小于37度）(4)PH8.9的Tris-HCl：36.6gTris，48ml1M的HCl，加蒸餾水至100ml,過濾。(5)PH6.7的Tris-HCl：5.98gTris，48ml1M的HCl加，蒸餾水至100ml,過濾。(6)10%AP（過硫酸銨）：1g過硫酸銨加蒸餾水至10ml。(7)20%蔗糖：20g蔗糖加80g水。(8)40%蔗糖：40g蔗糖加80g水。(9)Tris-Gly(電極緩沖液)：Tris6g，Gly28.8g，加蒸餾水至1000ml。使用時稀釋10倍，一般每次電泳，加800ml稀釋液即可。(10)脫色液：450ml甲醇，450mlH2O,再加100ml冰乙酸。(11)0.1MPH6.5磷酸緩沖液：稱取11.79gNa2HPO4·12H2O和10.69gNaH2PO4·2H2O，加入蒸餾水定容至1000ml。三、操作步驟1.試蟲處理方法根據(jù)所選藥劑的具體情況自定。2.樣品的制備(1)血淋巴樣品。用蒸餾水沖洗蟲體，剪斷腹足，用20μ1采血管取血放入加有少許苯基硫脲的小試管中，加入1000倍體積的20%蔗糖溶液，12000r/min冰凍離心15min，取上清液置于冰箱中備用。(2)消化道樣品。解剖試蟲，取中腸部分，拉出圍食膜，再用蒸餾水沖洗，定量加入20%蔗糖溶液（1.5ml/10頭蟲）冰浴勻漿，在12000r/min冰凍離心15min，上清液置于冰箱中備用。3.電泳（1）制膠安裝電泳槽，并以2%瓊脂沸液快速加到玻璃與膠框下緣開口（順大片玻璃兩側傾倒至封住底槽）。在膠框上做標記（2/3約高一點），以保證各次所制膠片的分離膠高度一致（10-15ml），加入分離膠，在膠面上加2-5ml厚的一層正丁醇。30min后，倒出正丁醇，以蒸餾水沖洗幾次，吸去水分，倒入濃縮膠約5ml，插入梳子，凝膠后（約40min）取出梳子，用濾紙條吸干槽內(nèi)殘留的水分。（2）點樣以微量進樣器吸取10μ1樣液，加入樣品槽，然后在上面逐孔滴40%的蔗糖，加入電極緩沖液，再沿點樣孔上方以10%溴酚藍指示劑劃一條線。（3）電泳將電泳槽置于冰箱中，開始控制電源110V，約2h后，指示線進入分離膠后，電壓升至300V。（約跑3h）（4）剝膠取出膠板，在點樣起始端正對左上角切下一角作為標記，以蒸餾水沖若干次，再將膠片放在染液中染色。（5）染色α-乙酸萘酯20mg，β-乙酸萘酯20mg，固蘭50mg,5ml丙酮（丙酮∶水=1∶1），加入150ml0.1M磷酸緩沖液（PH6.5），染色30min。（6）脫色將染好色的膠片放入脫色葉液中，在脫色搖床上脫色，直到底色褪去為止。（7）固定及保存將膠片從脫色液中取出，以蒸餾水或自來水沖洗，放在7%的乙醇溶液中（10ml乙醇，加170ml水）固定，過夜。（8）制干膠取一塊比膠略大的玻璃板，鋪上一張比兩塊玻璃板略大的浸濕的玻璃紙，將凝膠移至玻璃紙上，將玻璃紙的另一半覆蓋在膠上，去除氣泡，用玻璃條壓緊。將玻璃紙的多余邊緣部分褶向玻板反面，用小鐵夾夾緊，自然干燥一周即成較硬透明的膠片。此膠片可長期保存，并可照相、掃描。四、結果處理對染色后的膠板上tr及ck的酶帶進行分析，掃描后看其酶帶差異，并解釋藥劑對昆蟲的致毒機理。

Ⅱ設計性實驗實驗五新殺蟲化合物作用機理初步推測一、試驗目的殺蟲化合物對昆蟲的致毒機理一般與昆蟲體內(nèi)的一些生理生化指標的改變有關，一般為酶或者為受體。本實驗要求通過所學的毒理學知識及實驗方法，針對一新的殺蟲化合物設計出研究其作用機理的實驗方案，并通過實驗初步推測其作用機理。二、試驗要求1.設計出較為完善的實驗方案；2.通過癥狀觀察及簡單的生理生化指標的測試，分析推測該化合物的作用機理。

Ⅲ綜合性實驗實驗六吡蟲啉對昆蟲的生理生化影響一、試驗目的殺蟲劑對昆蟲的致毒機理較為復雜，不但對靶標具有影響，而且對昆蟲的代謝酶、解毒酶及保護酶均有一定的影響。本實驗通過測定吡蟲啉對粘蟲羧酸酯酶、磷酸酯酶、谷胱甘肽轉移酶、多功能氧化酶及保護酶的活性，結合所學的毒理學知識，分析討論吡蟲啉對昆蟲生理生化的影響及其致毒機理，可進一步加深學生對農(nóng)藥毒理學的認識。二、試驗要求1.設計出較為完善的實驗方案；2.通過癥狀觀察及對乙酰膽堿酯酶、羧酸酯酶、磷酸酯酶、谷胱甘肽轉移酶和多功能氧化酶活性的影響測定，分析討論吡蟲啉對昆蟲生理生化的影響及其致毒機理?！緦嶒炂摺繗⒕鷦w細胞膜通透性的影響1.實驗學時：4學時。2.實驗目的：通過實驗測定殺菌劑對菌體通透性的影響，有助于殺菌劑對細胞膜影響的致毒機理的有深入的理解。3.實驗內(nèi)容：接種辣椒疫霉病菌于PDA液體培養(yǎng)基中（不加瓊脂的PDA培養(yǎng)基），搖培20d（25℃，150r/min）。將處于對數(shù)生長期的菌體用去離子水懸浮至數(shù)量為109cfu·mL，分別向其中加入多果定至濃度為0、10、100μg/mL，充分搖勻，在作用10min、30min、60min、90min、120min后，用電導儀測定電導率。4.實驗要求：必做。5.實驗設備及器材：搖床，電導儀，三角瓶，量筒。【實驗八】除草劑對雜草光合作用的抑制1.實驗學時：3學時。2.實驗目的：了解除草劑抑制作物光合作用的測定方法。3.實驗內(nèi)容：采用圓葉片漂浮法測定除草劑對雜草光合作用的抑制。4.實驗要求：掌握除草劑抑制作物光合作用的測定方法