酪氨酸酶是黑素合成的關(guān)鍵酶

酪氨酸酶是黑素合成的關(guān)鍵酶，可能是白瘢風(fēng)自身免疫的重要抗原。最近發(fā)現(xiàn)部分白瘢風(fēng)患者血清中有酪氨酸酶抗體，且與白瘢風(fēng)臨床類型和分期密切相關(guān)。提示自身免疫性白瘢風(fēng)發(fā)病機(jī)制與酪氨酸酶抗體水平有關(guān)，為其免疫治療提供依據(jù)。酪氨酸酶抗體可以作為白瘢風(fēng)活動(dòng)性的一個(gè)指標(biāo)。酪氨酸酶（TYR）是一種75kD含銅酶，來源于胚胎神經(jīng)峭細(xì)胞，是黑素代謝和兒茶酚胺的關(guān)鍵酶。Spritz等［1］證實(shí)人TYR是一種銅結(jié)合蛋白，有銅A和銅B位點(diǎn)。離子銅特異性能與人TYR結(jié)合，一個(gè)位點(diǎn)的銅結(jié)合可以促進(jìn)另一個(gè)位點(diǎn)的銅結(jié)合。組氨酸在銅B位點(diǎn)協(xié)調(diào)其結(jié)合OTYR的多肽鏈的適當(dāng)折疊對(duì)銅結(jié)合及其催化活性是關(guān)鍵性的，TYR突變可中斷銅結(jié)合使其催化活性喪失。眼、皮膚白化病是由于TYR基因突變所致，該病TYR陽性患者色素性皮膚損害發(fā)生率高［2］。超氧化物負(fù)離子（O2-）能穿透黑素細(xì)胞（MC）入胞內(nèi)，TYR通過利用O2-保護(hù)MC，免受O2-細(xì)胞毒作用［3,4］。在黑素瘤患者黑素瘤細(xì)胞（MMC）和MC中抗氧化系統(tǒng)失衡，內(nèi)源性反應(yīng)性氧生成，細(xì)胞內(nèi)不能抵御內(nèi)源性超氧化物的攻擊［5］。白瘢風(fēng)患者血清中TYR抗體的生成，提示白瘢風(fēng)的發(fā)病與自身免疫有關(guān)。酪氨酸酶的抗原性酶是多種自身免疫紊亂性疾病的自身抗原［6］，TYR作為抗原必需具備下列條件：①酶活躍性；②免疫原性；③能誘導(dǎo)識(shí)別自身的抗體。

TYR能暴露于免疫系統(tǒng)中，從惡性或正常色素細(xì)胞來源的TYR,可以作為自身抗體產(chǎn)物的靶抗原;TYR與蛋白酶等無交叉反應(yīng)，提示抗TYR抗體對(duì)TYR是特異性的，MC能表達(dá)MHCII類分子，可作為抗原遞呈細(xì)胞。人MMC能分泌TYR，TYR抗體在黑素瘤患者血清中發(fā)現(xiàn)，其它惡性腫瘤患者血清中則沒有，提示惡性黑素瘤可產(chǎn)生抗TYR的抗體［7,8］，TYR基因編碼抗原能被黑素瘤細(xì)胞毒性T細(xì)胞(CTL)識(shí)別［9］，顯示系統(tǒng)免疫系統(tǒng)能對(duì)TYR發(fā)揮作用［10］。哺乳動(dòng)物黑素生成由多個(gè)基因位點(diǎn)共同參與調(diào)控。不同位點(diǎn)基因及相關(guān)蛋白具有多種特征性結(jié)構(gòu)位點(diǎn)(B位點(diǎn)，C位點(diǎn)，S位點(diǎn)和P位點(diǎn))。哺乳動(dòng)物色素細(xì)胞調(diào)節(jié)基因有多種，這些基因的最大特點(diǎn)是定位于C位點(diǎn)(C-allbinolocus)，編碼TYR。鼠C位點(diǎn)基因長(zhǎng)70kb，定位第7號(hào)染色體，人C位點(diǎn)基因長(zhǎng)50kb，定位11號(hào)染色體。鼠及人C位點(diǎn)基因均含有5個(gè)外顯子和4個(gè)內(nèi)含子°TYR是一種膜糖蛋白，可在MC中特異性表達(dá)°B位點(diǎn)(brownlocus)基因編碼TRP-(gp75)。鼠B位點(diǎn)基因長(zhǎng)18kb，有8個(gè)外顯子和7個(gè)內(nèi)含子，定位14號(hào)染色體。人B位點(diǎn)基因定位第9號(hào)染色體。TRP-1能在MC中表達(dá)且定位黑素體膜，具酪氨酸羥化酶和多巴氧化酶活性。S位點(diǎn)(slatylocus)基因編碼TRP-2，小鼠S位點(diǎn)基因位于第14號(hào)染色體，為多巴色素異構(gòu)酶。鼠及人P位點(diǎn)(Pmel-17locus)基因編碼stablin蛋白，人及鼠P位點(diǎn)基因定位第10、12號(hào)染色體，參與黑素合成終末途徑的調(diào)節(jié)。

TYR、gp75、TRP-2結(jié)構(gòu)相似，其基因產(chǎn)物有下列特點(diǎn)：①高同源性(氨基酸序列相同40%，相似45%)。②分子量幾乎相同。③三級(jí)結(jié)構(gòu)有高度保守序列半胱氨酸殘基。④具有酶活性銅結(jié)合位點(diǎn)。⑤含有跨膜區(qū)。TYR是黑素合成的關(guān)鍵酶，其已知的氨基酸序列含有一段前導(dǎo)信號(hào)肽和一個(gè)跨膜結(jié)構(gòu)基元(motif)，與黑素體膜上的錨定蛋白(anchorin)相一致。HLA-A2遞呈TYR抗原，不同的細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞克隆識(shí)別具有活性基元的九肽LLAVLYCLL，說明TYR在不同個(gè)體的表達(dá)呈相當(dāng)高的同源性。TYR的表達(dá)均一性優(yōu)于TRP-2，表達(dá)頻率亦較TRP-1高。除CD8+T細(xì)胞外，人CD4+T細(xì)胞也能特異性識(shí)別TYR基因編碼的相關(guān)抗原。黑素瘤患者中檢出TYR，TYR是MMC上的分化抗原?？勺鳛橹鲃?dòng)免疫的良好抗原靶。TYR既受MHC-I限制，又受MHC-II限制的黑素瘤共同抗原，誘生的CD8+T細(xì)胞和CD4+T細(xì)胞均能產(chǎn)生有效的抗腫瘤應(yīng)答°TRP-1原位雜交證實(shí)編碼基因位于人第9號(hào)染色體q23區(qū)，為IgG抗體識(shí)別抗原，具有DHI-2羧酸氧化酶活性，非突變型TRP-1抗原可被HLA-A31特異性CTL識(shí)別。外源性TRP-1cDNA在MMC等中表達(dá)。gp100即MC/MMC特異性蛋白Pmel-17，免疫電鏡證實(shí)gp100主要位于I、I期黑素體膜，廣泛表達(dá)于人MMC(50%)。HLA-A2mMC的gp100可被自體腫瘤浸潤(rùn)性淋巴細(xì)胞(TIL)識(shí)別。識(shí)別部位是十肽LLDGTATLRL(aa457-486)，從gp100提取的十肽能體外誘導(dǎo)TIL，將TIL細(xì)胞與IL-2配伍應(yīng)用于HLA-A2+黑素瘤患者，可消除自發(fā)性黑素瘤的轉(zhuǎn)移灶。

酪氨酸酶抗體（一）檢測(cè)方法：TYR抗體在白瘢風(fēng)患者血清中檢出oSong等［11］1994年用細(xì)菌合成人TYR,免疫印跡法檢測(cè)TYR抗體。這種方法相對(duì)不敏感且不能定量檢測(cè)。Baharav等［12］1996年使用蘑菇TYR,ELISA法檢測(cè)TYR抗體，此法敏感，但所用蘑菇TYR與人TYR同源性低。而Xie等［13］1996年則用人MC提取物作為TYR的來源，免疫沉淀法等檢測(cè)TYR抗體。Kemp等［14］1997年采用放免法（RIA）檢測(cè)TYR抗體。近來此法已被用來檢測(cè)自身免疫性疾病患者血清中的特異性抗體［15-17］。這種方法能敏感定量檢測(cè)抗體。（二）產(chǎn)生、特點(diǎn)、特性：抗TYR抗體的產(chǎn)生：用人TYRcDNA轉(zhuǎn)染L細(xì)胞，獲得L-TY細(xì)胞，免疫同源性C3H鼠，即用5X106L-TY細(xì)胞與等量Frend佐劑混合，腹膜內(nèi)注入有6周鼠齡的雌性C3H鼠體內(nèi)，每次間隔2周，第3,4次用5X106細(xì)胞裂解物與等量Frend佐劑混合免疫動(dòng)物。第4次注射后3天，抽血，分離血清，同時(shí)用未轉(zhuǎn)制細(xì)胞去除非特異反應(yīng)性成分，結(jié)果用人TYRcDNA轉(zhuǎn)染L細(xì)胞免疫的8只C3H鼠中，4次免疫后，有4只對(duì)TYRcDNA轉(zhuǎn)染L細(xì)胞的鼠血清抗體滴度＞10-4，C3H鼠免疫前及正常鼠對(duì)L-TY細(xì)胞無反應(yīng)性。用L-TY細(xì)胞免疫動(dòng)物獲得的血清能沉淀L-TY和有色素MMC細(xì)胞裂解物。免疫沉淀法可見

分子量為70kD?80kD的寬幅條帶，可能為TYR生物合成中間代謝產(chǎn)物，未轉(zhuǎn)染L細(xì)胞，TYR陰性無色素MMC中未見特異性條帶。免疫印跡法檢測(cè)TYR抗體：用抗TYR血清10-3稀釋度，在TYR轉(zhuǎn)染L細(xì)胞和有色素MMC可見細(xì)胞內(nèi)顆粒染色，親代L細(xì)胞內(nèi)無胞內(nèi)染色，在L-TY細(xì)胞，細(xì)胞內(nèi)染色顆粒位于核周和胞質(zhì)內(nèi)。無色素MMC，不表達(dá)TYRmRNA，無TYR活性，與TYR抗體無相互作用。有色素MMC和培養(yǎng)MC，高度表達(dá)TYR活性，黑素形成多，細(xì)胞質(zhì)顆粒深度染色。單克隆抗體TA99能識(shí)別TRP-1糖蛋白，TA99能與人有色素MMC表達(dá)的TRP-1和轉(zhuǎn)染L-GP細(xì)（用編碼TRP-1全長(zhǎng)cDNA轉(zhuǎn)染鼠L細(xì)胞獲得）表達(dá)的全長(zhǎng)人TRP-1cDNA相互作用，且免疫耗竭實(shí)驗(yàn)證實(shí)TA99不耗竭能產(chǎn)生分子量為70kD?80kD條帶的抗TYR血清，免疫熒光分析抗TYR抗體與TRP-1，TYRl-GP細(xì)胞無相互作用，抗TYR抗體不沉淀來自L-GP細(xì)胞的TRP-1。TYR抗體使TYR活性喪失：免疫鼠血清能沉淀鼠MMC，L-TY細(xì)胞裂解物，提示免疫鼠血清能滅活有色素MMC及L-TY細(xì)胞TYR的活性，加入L-多巴底物后，見黑素形成，提示TYR活性恢復(fù)，免疫沉淀時(shí)如用免疫前血清則無黑素形成［7］。白瘢風(fēng)簡(jiǎn)介

白瘢風(fēng)與TYR抗體：TYR抗體在白瘢風(fēng)中常常發(fā)生。Song等［11］應(yīng)用免疫印跡法檢測(cè)了26例白瘢風(fēng)患者血清，其中有16例（61%）可與重組TYR特異性結(jié)合。26例白瘢風(fēng)患者，有16例（61%）血清TYR抗體陽性，其中7例伴發(fā)非胰島素性糖尿（IDDM）有4例（57%）、8例伴發(fā)橋本甲狀腺炎有4例（50%）、3例伴發(fā)Grave病有3例（100%）、7例伴發(fā)Addison病有4例（57%）陽性。Kemp等［14］應(yīng)用35S標(biāo)記人TYR，放免法（RIA）檢測(cè)白瘢風(fēng)患者血清TYR抗體。在被檢測(cè)的46例白瘢風(fēng)患者的血清中，5例（10.9%）TYR抗體陽性，20例對(duì)照血清及10例橋本甲狀腺炎患者血清陰性。Baharav等應(yīng)用固相ELISA法檢測(cè)18例白瘢風(fēng)患者（彌漫性7例，局限性1例）血清中的TYRigG抗體滴度，結(jié)果（OD均值）彌漫性白瘢風(fēng)為0.658±0.251，局限性白瘢風(fēng)0.188±0.05，健康對(duì)照組0.093±0.049，顯示彌漫性白瘢風(fēng)丁丫日igG抗體滴度較局限性白瘢風(fēng)及健康對(duì)照組顯著增高。這些TYR抗體與TYR的親和力高，與b位點(diǎn)基因產(chǎn)物TRP-1沒有交叉反應(yīng)［12］。大多數(shù)急性白瘢風(fēng)及黑素瘤患者有對(duì)MC、MMC的抗體，這些抗體在體外通過補(bǔ)體介導(dǎo)細(xì)胞毒作用和抗體依賴細(xì)胞毒作用殺傷MC。Cui等檢測(cè)發(fā)現(xiàn)30例黑素瘤患者血清有24例（80%）、29例白瘢風(fēng)患者血清有24例（83%）抗體陽性，而28例對(duì)照組只有2例（7%）陽性。人及動(dòng)物黑素瘤中，白瘢風(fēng)的出現(xiàn)能改變其進(jìn)程。用MMC免疫動(dòng)物可誘發(fā)白瘢風(fēng)。重組抗MMC抗體對(duì)黑素瘤有效［18］。黑素瘤伴發(fā)白瘢風(fēng)時(shí)預(yù)后較好，白瘢風(fēng)患者抗體出現(xiàn)的頻率和水平與黑素瘤退變

(regression)一致。提示抗白瘢風(fēng)和黑素瘤抗體作用于色素細(xì)胞(MC,MMC)上有相同的抗原，并且這些抗原能在MC和MMC上表達(dá)［19］。白瘢風(fēng)耽抗體既能溶解MC，致皮膚白斑形成，又能有效破壞MMC；MMC抗體也能與正常MC結(jié)合，誘導(dǎo)黑素瘤產(chǎn)生白瘢風(fēng)樣白斑，TYR抗體則是二者之間的橋梁。白瘢風(fēng)患者血清MC抗體滴度與該病活動(dòng)性和嚴(yán)重程度密切相關(guān)，50%局限性白瘢風(fēng)患者血清中有對(duì)MC的抗體，而彌漫性白瘢風(fēng)則高達(dá)93%，且彌漫性白瘢風(fēng)MC抗體能與MMC結(jié)合，抑制其增殖。在補(bǔ)體存在的情況下溶解細(xì)胞，減少體內(nèi)鼠黑素瘤轉(zhuǎn)移，MMC上抗體表位滴度在白瘢風(fēng)較健康者及黑素瘤高。黑素體是黑素合成和貯存的亞細(xì)胞器，Ando等［20］認(rèn)為黑素體數(shù)量變化與TYRmRNA水平有關(guān)。UVB上調(diào)TYRmRNA水平致皮膚色素沉著［21］。TYR和gp75都是黑素體轉(zhuǎn)膜糖蛋白，TYR抗體與gp75沒有交叉反應(yīng)［22］。白瘢風(fēng)患者血清含有抗MC抗體，MC抗體在Smyth雞模型中于脫色前數(shù)周被檢測(cè)到。近來黑素瘤患者血清中亦分離到TRP-1自身抗體，循環(huán)中的這些抗體被認(rèn)為是導(dǎo)致Smyth雞色素脫失斑的主要原因［23,24］。白瘢風(fēng)患者血清中TYR抗體的檢出，進(jìn)一步提示白瘢風(fēng)的分子發(fā)病機(jī)制，為臨床分型、分期、治療及預(yù)后提供依據(jù)。其他

一種皮膚及其附屬物色素缺乏的遺傳病。可分全身性白化病和局部性白化病兩種，以前者最為常見?；颊咂つw呈白色，毛發(fā)銀白或淡黃色；虹膜呈淡紅色或淡灰色，半透明，瞳孔淡紅，視網(wǎng)膜無色素、羞光，眼球震顫，視力下降；病人對(duì)陽光很敏感，日曬后，皮膚可增厚并發(fā)生鱗狀上皮癌。白化病的發(fā)病是由于黑色素代謝障礙所致。正常人體內(nèi)的黑色素由黑色素細(xì)胞合成，黑色素細(xì)胞內(nèi)有黑素小體，它含有酪氨酸酶，這種酶能將酪氨酸轉(zhuǎn)變成黑色素。白化病患者體內(nèi)黑色素細(xì)胞數(shù)目正常，細(xì)胞內(nèi)也有黑素小體，但由于控制酪氨酸酶的基因發(fā)生突變，不能合成酪氨酸酶，于是黑素小體中酪氨酸酶缺乏，不能使酪氨酸轉(zhuǎn)變成黑色素，從而導(dǎo)致皮膚、粘膜、毛發(fā)、眼等白化。白化病有多種遺傳方式。全身性白化病屬常染色體隱性遺傳方式。局部白化病為常染色體顯性遺傳，眼白化病(皮膚、毛發(fā)均正常)可為X伴性隱性或常染色體隱性遺傳。白化病遍及全世界，總發(fā)病率為1/10000?1/20000。對(duì)白化病目前尚無有效的治療方法，因此應(yīng)以預(yù)防為主。禁止近親結(jié)婚是重要的預(yù)防措施之一。對(duì)此病也可作產(chǎn)前診斷。在妊娠4?5個(gè)月時(shí)，通過胎兒鏡取胎兒一小塊皮膚，在電子顯微境下檢查胎兒是否為白化病，以避免患兒的出生，達(dá)到優(yōu)生的目的。在遺傳的方式上白化病是屬于常染色體上的隱性遺傳。只有當(dāng)個(gè)體為隱性純合子(aa)時(shí)，才表現(xiàn)為白化病，通常白化病患者的父母為表型正常的雜合子,其因型為(Aa)是致病基因的攜帶者,患者同胞中也有1/4的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)。五如何區(qū)分白化病與白瘢風(fēng)?

白化病與白瘢風(fēng)均屬于色素障礙性皮膚病。二者都是以皮膚出現(xiàn)白斑為主要臨床表現(xiàn)，無明顯癢痛感覺。但白化病與白瘢風(fēng)是截然不同的兩種疾病。臨床多從如下幾方面來區(qū)分：發(fā)病年齡白化病自出生時(shí)就有明顯的"變白”表現(xiàn)；而白瘢風(fēng)為后天發(fā)生，可開始于任何年齡，但以20歲以前發(fā)病人數(shù)最多。家族史白化病有典型的家族遺傳史；白瘢風(fēng)的發(fā)病與遺傳有一定關(guān)系，但無大量的統(tǒng)計(jì)資料來證實(shí)，我國學(xué)者報(bào)告白瘢風(fēng)與遺傳有關(guān)聯(lián)者僅占3.9%?10.7%。好發(fā)部位泛發(fā)性白化病是全身的皮膚、毛發(fā)及眼睛均變白；白瘢風(fēng)可發(fā)生在任何部位，但好發(fā)于暴露及皺褶部位。白斑特點(diǎn)白化病的皮膚全部變白，毛發(fā)呈白色或淡黃色，眼睛缺乏色素，畏光，白天視物不清；白瘢風(fēng)的白斑僅限于局部，邊緣清楚，周邊色素