細(xì)胞生物學(xué)試驗(yàn)指導(dǎo)

本文格式為Word版，下載可任意編輯——細(xì)胞生物學(xué)試驗(yàn)指導(dǎo)

細(xì)胞物學(xué)試驗(yàn)指生導(dǎo)

細(xì)胞生物學(xué)試驗(yàn)指導(dǎo)目錄

一．顯微鏡的使用

試驗(yàn)一、幾種光學(xué)顯微鏡的使用

試驗(yàn)二、參觀電子顯微鏡及生物超薄切片標(biāo)本制備

二．細(xì)胞形態(tài)結(jié)構(gòu)

試驗(yàn)三、細(xì)胞大小的形態(tài)觀測(cè)——測(cè)微尺的使用試驗(yàn)四、細(xì)胞活體染色技術(shù)

試驗(yàn)五、植物細(xì)胞骨架光學(xué)顯微觀測(cè)試驗(yàn)六、胞間連絲觀測(cè)

三．細(xì)胞化學(xué)

試驗(yàn)七、鑒定RNA的細(xì)胞化學(xué)方法——Branchet反應(yīng)

試驗(yàn)八、DNA顯色的觀測(cè)——Feulgen反應(yīng)

試驗(yàn)九、固綠染色法鑒定細(xì)胞內(nèi)酸性蛋白與堿性蛋白試驗(yàn)十、多糖及過氧化酶的顯示

試驗(yàn)十一、核仁組成區(qū)的銀染顯示與觀測(cè)

四．細(xì)胞生理

試驗(yàn)十二、細(xì)胞膜的通透性試驗(yàn)十三、細(xì)胞電泳

五．細(xì)胞和組織培養(yǎng)技術(shù)

試驗(yàn)十四、植物原生質(zhì)體的分開和融合

試驗(yàn)十五、植物細(xì)胞的培養(yǎng)與觀測(cè)試驗(yàn)十六、動(dòng)物細(xì)胞融合

試驗(yàn)十七、動(dòng)物細(xì)胞的培養(yǎng)與觀測(cè)

六．細(xì)胞化學(xué)成分的分開

試驗(yàn)十八、細(xì)胞器的分開、純化——細(xì)胞分級(jí)分開試驗(yàn)十九、熒光的細(xì)胞化學(xué)測(cè)定試驗(yàn)二十、細(xì)胞活力的鑒別

試驗(yàn)一幾種光學(xué)顯微鏡的使用

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一、試驗(yàn)?zāi)康?/p>

了解幾種光學(xué)顯微鏡的結(jié)構(gòu)、工作原理、主要用途和使用方法；把握使用普通顯微

鏡提高分辯力的方法。

二、試驗(yàn)原理

(一)基本原理

一般試驗(yàn)室經(jīng)常使用的光學(xué)顯微鏡都是由物鏡、目鏡、聚光器和光闌組成，普通顯

微鏡它們的放大原理及光路圖如下：

A2A1BB2AO2O1F1F2B1AB物體．A1Bl第一次成像，A2B2其次次成像，Ol目鏡．O2物鏡，F(xiàn)1為Ol的前焦點(diǎn)，F(xiàn)2為O2的前焦點(diǎn)

各種光學(xué)顯微鏡的光學(xué)放大原理基本一致，各種特別用途的光鏡不過只是在光源、物鏡、聚光器等方面作了改動(dòng)，或在其它方面增設(shè)了某些特別的設(shè)備。(二)幾種光學(xué)顯微鏡

l、普通光學(xué)顯微鏡：

普通光學(xué)顯微鏡也叫復(fù)式顯微鏡，是最常見，最簡單的顯微鏡。它適于觀測(cè)一般固定的，有色的透明度較高的標(biāo)本。其最大分辯力一般為0.2微米，從構(gòu)造上可分光學(xué)、機(jī)械和電子三大系統(tǒng)。2、暗視野顯微鏡：

暗視野顯微鏡是以丁達(dá)爾現(xiàn)象(Tyndallphenomenon)(即光的微粒散射現(xiàn)象)為基礎(chǔ)

設(shè)計(jì)的,它使用了特別的聚光器進(jìn)行斜射照明,因光源中心束不直入物鏡，所以視野黑暗，而被檢細(xì)胞器因斜射照明發(fā)生衍射和反射，所以發(fā)亮可見。暗視野顯微鏡可用增加光照方法增加物體與背景的反差，因而可觀測(cè)到0．2—0．004微米直徑的微小粒子，但它分不清被檢物的微弱構(gòu)造，它常用于觀測(cè)物體的存在與運(yùn)動(dòng)。而暗視野顯微鏡與普通光學(xué)顯微鏡的區(qū)別，主要在于聚光器的不同，致使照明方法有別。確鑿地說，稱暗視野顯微鏡為暗視野照明更為貼切。它是照明光線僅照亮被檢樣品而不進(jìn)入物鏡。使視野背景暗黑，樣品敞亮的照明方法。3、相差顯微鏡：

相差是指同一光線經(jīng)過折射率不同的介質(zhì)其相位發(fā)生變化并產(chǎn)生的差異。相位是指在某一時(shí)間上，光的波動(dòng)所達(dá)到的位置。

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一般由于被檢物體(如不染色的細(xì)胞)所能產(chǎn)生的相差的區(qū)別太小，我們的眼睛是很難分辯出這種區(qū)別的，只有在變相差為振幅差(明暗之差)之后，才能被分辯。相差顯微鏡是以光的干擾現(xiàn)象為基礎(chǔ)設(shè)計(jì)的。與普通光學(xué)顯微鏡比較，它在聚光器和物鏡上作了改動(dòng)。用裝有環(huán)狀光闌的聚光器造成的空心光線柱，使直射光(背景)和衍射光(樣品)分開。同時(shí)在物鏡的后焦面上裝有相板，使直射光和衍射光發(fā)生干擾，從而把我們?nèi)庋鄄荒芤姷南辔徊钭優(yōu)榭梢姷恼穹睿瑫r(shí)相板上裝有吸收膜，吸收部分直射(或衍射)光以增加反差，使人們能夠看清更加微弱的結(jié)構(gòu)。所以相差顯微鏡一般用于觀測(cè)活細(xì)胞的微弱結(jié)構(gòu)。4、熒光顯微鏡：

熒光是指某些物質(zhì)經(jīng)波長較短的光線照射后，分子被激活吸收能量后呈激發(fā)態(tài)，其能量部分轉(zhuǎn)化為熱量或用于光化學(xué)反應(yīng)外，相當(dāng)一部分則以波長較長的光能形式輻射出來，這種波長長于激發(fā)光的可見光稱作熒光。

熒光顯微鏡是以紫外線(3650A)或蘭紫光(4200A)照射某些物質(zhì)，可激發(fā)其產(chǎn)生熒光的原理為基礎(chǔ)設(shè)計(jì)的，利用一個(gè)高發(fā)光效率的光源，經(jīng)過一個(gè)濾光系統(tǒng)得到紫外光(或蘭紫外光)，直接照射標(biāo)本中的自然熒光物質(zhì)，使其產(chǎn)生自發(fā)熒光，再加以鏡檢?；蛞詿晒馊玖舷葘?duì)標(biāo)本進(jìn)行染色，然后使之在上述光源照射下產(chǎn)生次生熒光，再加以鏡檢。這種顯微鏡主要用于觀測(cè)熒光(或次生熒光)物質(zhì)在細(xì)胞內(nèi)分布狀況，以及測(cè)定細(xì)胞器的生理活性。

(三)如何提高分辯力

顯微鏡的能力是質(zhì)量和性能的標(biāo)志。能力包括分辯率、放大率、焦點(diǎn)深度和視場(chǎng)寬度等。其中最重要的是分辯率。各種能力都有一定的限界，既相互作用，又相互制約，改善和提高了某種能力，同時(shí)降低了某些能力，只能顧其主要，兼顧其它，綜合籌統(tǒng)。1、數(shù)片孔徑(numerialaperture)

數(shù)片孔徑(N．A．)也叫鏡口率，是物鏡和被檢樣品之間的介質(zhì)的折射率(n)與物鏡所接受的光錐頂角(亦稱孔徑角)的一半α(半孔徑角)正弦的乘積。其公式如下：N．A．=n·sinα

物鏡的數(shù)值孔徑愈大，顯微鏡的能力愈強(qiáng)，數(shù)值孔徑與分辯率成正比，與焦點(diǎn)深度成反比．物鏡的數(shù)值孔徑的N．A．值刻在物鏡殼上，如40／0．65表示40倍的物鏡，數(shù)值孔徑為0．65。物鏡的數(shù)值孔徑隨前透鏡直徑的減少而增大。顯微鏡物鏡的前透鏡口徑愈小，數(shù)值孔徑愈大，放大倍數(shù)愈高，價(jià)格愈高。2、分辯率(resolvingpower)

物鏡分辯力是指分辯被檢樣品微細(xì)結(jié)構(gòu)的能力。尋常以能明了地分辯兩個(gè)物體點(diǎn)的最短距離來表示。其公式如下：R=0.61×λ/N．A．

R：分辯率；λ：照射光線波長；N．A．：物鏡數(shù)值孔徑

分辯率以分辯兩個(gè)點(diǎn)的最短距離表示，R值愈小，分辯能力愈大。物鏡的分辯率與照明光線的波長成反比，與物鏡的數(shù)值孔徑成正比。

照明光線波長愈短，物鏡的數(shù)值孔徑愈大，顯微鏡的分辯率亦愈大。

物鏡的分辯力即顯微鏡的分辯率，目鏡與顯徽鏡的分辯力無關(guān)，它只把物像其次次放大，使眼睛便于觀測(cè)。目鏡只能將物鏡已經(jīng)分辯的影像進(jìn)行放大，無法觀測(cè)到未被物鏡分辯的細(xì)節(jié)。在光學(xué)成像過程中，目鏡不起初始造像作用，僅作放大而已。3、放大率(magnification)

顯微鏡最終形成的物體放大影像，對(duì)被檢物體的大小比例稱為放大率，即像高比物高。放大倍數(shù)以長度計(jì)算，而不是以面積或體積計(jì)算。

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顯微鏡的總放大率(Mt)應(yīng)為：

Mt=Mob×Me×Mph

Mt：總放大率；Mob：物鏡放大率；Me：目鏡放大率；Mph：攝影透鏡放大率

一般鏡檢觀測(cè)時(shí)，攝影附加透鏡的放大倍率不計(jì)算在內(nèi)，因它未參予造像，顯微鏡分辯微細(xì)結(jié)構(gòu)的能力，不取決于總放大率，而歸于物鏡的分辯率。顯微鏡的總放大率，絕非愈高愈好，有其適量范圍：最低和最高界限。適合的總放大率是所用物鏡數(shù)值孔徑的500～1000倍。在此范圍稱作有效放大率。例如：使用40／0．65物鏡時(shí)，應(yīng)選配適合的目鏡倍數(shù)范圍。

首先計(jì)算出有效放大倍率：

0．65×500～0．65×1000=325—650再用物鏡放大倍率除以有效放大率：325÷40～650÷40=8～16

求得的數(shù)值是應(yīng)選配的目鏡放大倍率的范圍，即要選用8×～16×的目鏡。

總之，總放大率超過物鏡數(shù)值孔徑的1000倍時(shí)，微細(xì)結(jié)構(gòu)分辯不清，為空的放大，低于500倍時(shí)由于放大率過低，肉眼難以分辯。4、焦點(diǎn)深度(depthoffocus)

當(dāng)顯微鏡對(duì)被檢樣品的某一點(diǎn)或平面準(zhǔn)焦時(shí)，影像的明了范圍，不局限于這一點(diǎn)或面，在某上下的一定距離或深度內(nèi)也是明了的。這段明了的距離或深度，就叫做焦點(diǎn)深度，簡稱焦深，焦深長表示明了的上下范圍或深度大，焦深短，明了的上下限界短。顯微鏡的焦深可變，它與物鏡的數(shù)值孔徑和總放大率相關(guān)。焦深與物鏡的數(shù)值孔徑和總放大率成反比，收縮孔徑。影像的焦深加大，提高物鏡的數(shù)值孔徑，明了深度變小，總放大率提高，焦深度小，總放大率降低，焦深加大。使用同一物鏡，配用倍率的目鏡，其焦深隨目鏡倍率加大而減少。

三、試驗(yàn)用品：

(一)材料：草履蟲，洋蔥內(nèi)表皮，紫鴨趾草等花粉，菠菜葉。

(二)用品：普通光學(xué)顯微鏡，暗視野顯微鏡。相差顯微鏡，熒光顯微鏡，載玻片，蓋玻片，吸管，鑷子，剪刀等。

四、試驗(yàn)方法：

l、觀測(cè)草履蟲的外形、運(yùn)動(dòng)、纖毛、食物泡等。

取少許棉花纖維或擦鏡紙纖維，放于載玻片上，在其上滴一滴草履蟲懸液，然后加蓋玻片觀測(cè)。

2、洋蔥表皮細(xì)胞和菠菜葉的細(xì)胞核、葉綠體的觀測(cè)在載玻片上滴一滴水，撕洋蔥鱗莖內(nèi)表皮或菠菜下表皮一小塊放于其中，使其展開，然后加蓋片觀測(cè)。

3、紫鴨趾草花粉外形、表面突起的觀測(cè)

在載玻片上滴一滴水，取紫鴨趾草雄蕊在其中沾幾下，然后蓋片觀測(cè)。

五、作業(yè)：

1、談?wù)勅绾翁岣唢@微鏡的分辯力。

2、根據(jù)試驗(yàn)結(jié)果，把所能觀測(cè)到內(nèi)容的材料符號(hào)填在表內(nèi)適當(dāng)?shù)奈恢谩?/p>

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其形態(tài)、大小如何、分布位置。

(二)線料體的活體染色

l、用植物細(xì)胞觀測(cè)線粒體的活體染色

(1)用鑷子撕取洋蔥鱗莖內(nèi)表皮一小塊(約lcm2)，放在載玻片上用1/5000詹納斯

綠B染色約30分鐘。

(2)吸出染液，滴加Ringer氏液，蓋片、鏡檢，注意觀測(cè)線粒體分布及所呈形

狀。

2、用動(dòng)物細(xì)胞觀測(cè)線粒體的活體染色。

(1)取鼠肝邊緣較薄的肝組織一小塊，放入盛有Ringer氏液的表面皿中洗去血液。(2)將肝組織洗凈后吸去血液，參與1／5000詹納斯綠B染液染色30分鐘，注意不

可將組織塊完全吞噬。

(3)染色后撕開組織塊，這樣溶液中就會(huì)有一些細(xì)胞或細(xì)胞群。

(4)用吸管吸取溶液，放在載玻片的Ringer氏液中。墊兩根短頭發(fā)，加蓋玻片，即

可鏡檢。

(5)用油鏡觀測(cè)活染色的線粒體標(biāo)本，要不斷地來回轉(zhuǎn)動(dòng)細(xì)調(diào)焦螺旋，使蓋玻片上

下漸漸移動(dòng)。使材料總是得到氧氣，線粒體的染色才顯得十明顯了。3、人口腔粘膜上皮細(xì)胞線粒體的超活染色觀測(cè)（1）取清潔載玻片放在37℃恒溫水浴鍋的金屬板上，滴2滴1／5000詹納斯綠B溶

液。

(2)用牙簽取口腔上皮細(xì)胞，將刮下的粘液狀物放入載玻片的染液滴中，染色10一15分鐘(注意不能枯燥)，蓋上蓋片，吸去多余的溶液，即可鏡檢。（三）臺(tái)盼藍(lán)染色鏊別死活細(xì)胞。

抽取小鼠腹腔水細(xì)胞涂于清白載玻片上，滴加l％臺(tái)盼藍(lán)1滴，蓋上蓋玻片于顯微鏡下觀測(cè)。

五、作業(yè):

l、所觀測(cè)到的液泡大小是否有區(qū)別，染色深度是否一樣，并繪圖加以說明。

2、所觀測(cè)到線粒體分布在細(xì)胞何處．呈什么顏色，其形狀如何，繪圖加以說明。3、比較線粒體在動(dòng)、植物中的分布、顏色，其形狀如何?

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試驗(yàn)五植物細(xì)胞骨架的光學(xué)顯微觀測(cè)

一、試驗(yàn)?zāi)康模?/p>

觀測(cè)光學(xué)顯微鏡下細(xì)胞骨架的結(jié)構(gòu)，了解顯示植物細(xì)胞骨架的方法及其原理。

二、試驗(yàn)原理：

細(xì)胞骨架是指在細(xì)胞中支持和連接細(xì)胞各組分，以及與細(xì)胞運(yùn)動(dòng)有關(guān)的結(jié)構(gòu)，它包括微管、中間纖維、微絲。當(dāng)用適當(dāng)濃度的TritonX一100處理時(shí)，可將細(xì)胞內(nèi)大部分蛋白質(zhì)抽提掉，但細(xì)胞骨架系統(tǒng)的蛋白質(zhì)卻仍被保存，經(jīng)過固定和考馬斯亮藍(lán)R250染色，從而在光鏡下觀測(cè)到細(xì)胞骨架的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)。

三、試驗(yàn)用品：

(一)器材：顯微鏡、50ml燒杯、滴管、容量瓶、載玻片、蓋玻片、鑷子。(二)試劑：

1、M一緩沖液：50mmol／L瞇唑，50mmol／LkCl：，0.5mmol／LMgCl2，

lmmol／LEGTA(乙二醇雙(a一氨基乙酸)醚四乙酸)0．1mmoL／LEDTA，lmmol／L巰基乙醇或DTT(二硫蘇糖醇)。2、6mmol／LPH6．8磷酸緩沖液。

3、1％TritonX一100，用M一緩沖液配。

4、0.2％考馬斯亮藍(lán)R250，其溶劑是甲醇46.5ml，冰乙酸7ml，蒸餾水46.5ml。5、3％戊二醛，用6mmol／L磷酸緩沖液(PH6．8)配制。6、5％、7％、95％乙醇。

7、叔丁醇、正丁醇、二甲苯、樹膠。(三)材料：洋蔥鱗莖。

四、試驗(yàn)方法：

(一)取洋蔥鱗莖內(nèi)表皮細(xì)胞(約lcm2大小)若干片溫于裝有PH6．8磷酸緩沖液

的50ml燒杯中，使其下沉。

(二)吸去磷酸緩沖液，用1％TritonX一100處理20—30分鐘。(三)吸去TritonX—loo，用M一緩沖液洗3次，，每次10分鐘。．(四)3％戊二醛固定0.5—1小時(shí)，(對(duì)照組開始處理)。(五)PH6.8磷酸緩沖液洗3次，每次10分鐘。(六)用0．2％考馬斯亮藍(lán)R250染色20—30分鐘。

(七)用蒸餾水洗1—2次，材料置于載玻片上，加蓋玻片，即可鏡檢。

(八)如作永久制片，可使樣品，順序通過如下試劑：50％乙醇，70％乙醇。95％

乙醇，95％乙醇和叔丁醇混合液(1：1)，每次5一10分鐘，或正丁醇→正丁醇二→甲苯二→甲苯，每次5—10分鐘。然后撈取樣品，平展于載玻片上，中性樹膠封固。

五、作業(yè)

I、比較對(duì)照組和處理組的細(xì)胞骨架結(jié)構(gòu)有何不同？2、繪制細(xì)胞骨架圖。

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試驗(yàn)六胞間連絲的觀測(cè)

一、試驗(yàn)?zāi)康模?/p>

觀測(cè)植物細(xì)胞的胞間連絲，了解其意義。

二、試驗(yàn)原理：

高等植物細(xì)胞之間通過胞間連絲相互連接，完成植物細(xì)胞間的通訊連結(jié)，胞間連絲穿越細(xì)胞壁，由相互連接的相鄰的細(xì)胞質(zhì)膜共同組成的直徑為20—40nm的管狀結(jié)構(gòu)，中央是由內(nèi)質(zhì)網(wǎng)延伸形成的鏈管結(jié)構(gòu)，胞間連絲的形成是在細(xì)胞分裂時(shí)由GB內(nèi)質(zhì)網(wǎng)小泡形成胞間層，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)穿過胞間層形成胞間連絲，在細(xì)胞生長過程中胞間連絲的數(shù)目還會(huì)增加。

三、試驗(yàn)用品:

(一)器材：顯微鏡，載玻片，蓋玻片，解剖刀，刀片，鑷子，剪刀。(二)試劑：0.5％的蕃紅水溶液。

(三)材料：紅辣椒，玉米籽粒，洋蔥。

四、試驗(yàn)方法:

(一)紅辣椒表皮細(xì)胞臨時(shí)制片。

取一小塊紅辣椒，用刀片防備刮除果肉，留下一層極薄的表皮，放于載玻片上，封片觀測(cè)、鏡檢時(shí)光線不要太亮。（二）玉米種子糊粉層臨時(shí)制片

將玉米種子在水中浸泡一天，用鑷子剝?nèi)ケ砥ぢ冻龊蹖?，這時(shí)可以用攝子輕撕糊粉層放于水中，或制作徒手切片。刀口與糊粉層平行，切極薄片，封片觀測(cè)。(三)洋蔥內(nèi)表皮細(xì)胞觀測(cè)

撕洋蔥內(nèi)表皮一小塊，0.5％番紅染色2—3分鐘，沖洗，封片觀測(cè)，多余的水用吸水紙吸干。

五、作業(yè)

繪各種材料的胞間連絲圖。

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試驗(yàn)七鑒定RNA的細(xì)胞化學(xué)方法一Branchet反應(yīng)

一、試驗(yàn)?zāi)康模?/p>

通過試驗(yàn)了解Branchet反應(yīng)的原理及操作方法，觀測(cè)DNA、RNA在細(xì)胞內(nèi)分布的主要位置。

二、試驗(yàn)原理：

Branchet反應(yīng)是鑒定細(xì)胞內(nèi)的RNA的一種標(biāo)準(zhǔn)方法，主要是利用核酸分子上的負(fù)電荷(PO43-)與帶正電荷的堿性染料結(jié)合形成鹽鍵而在原位沉淀顯色，所以它可以同時(shí)染出RNA和DNA。

Unna試劑中的甲基綠(methylgreen)和DNA親和力高，派若寧(Pyroin)和RNA親合力高。因此DNA可被染成蘭綠色，而RNA被染成紅色，通過觀測(cè)細(xì)胞內(nèi)不同顏色所分布的位置，可初步判斷DNA和RNA在細(xì)胞內(nèi)的分布狀況。

三、試驗(yàn)用品:

(一)材料：蠶豆根尖石臘切片(二)試劑：

l、Unna染色劑：

甲液：5％Pyronin水溶液6ml2％methglgreen水溶液6ml蒸餾水16ml乙液：1M醋酸鹽緩沖液(PH4.8)16ml

甲乙兩液分別置4~C冰箱備用，用時(shí)兩液混勻。2、5％三氯醋酸

3、0.1％RNase的醋酸緩沖液(PH4．8)4、二甲苯

5、乙醇(70％，85％，95％，100％)