動(dòng)物細(xì)胞工程

動(dòng)物細(xì)胞工程第一章動(dòng)物細(xì)胞工程概論一、動(dòng)物細(xì)胞工程的概念1.動(dòng)物細(xì)胞工程的定義動(dòng)物細(xì)胞工程是應(yīng)用細(xì)胞生物學(xué)和分子生物學(xué)的技術(shù)方法對(duì)動(dòng)物細(xì)胞進(jìn)行各種操作并使其在體外生長(zhǎng)、增殖、分化以生產(chǎn)有用產(chǎn)品或引向成體化（產(chǎn)生新型生物個(gè)體）的技術(shù)體系，是生物技術(shù)（生物工程）的重要組成部分。狹義細(xì)胞工程指對(duì)細(xì)胞個(gè)體進(jìn)行的各種操作，廣義的細(xì)胞工程包括對(duì)細(xì)胞、組織、器官所進(jìn)行的各種操作。2.動(dòng)物細(xì)胞工程研究的主要內(nèi)容以狹義細(xì)胞工程為主，兼顧組織、器官工程等內(nèi)容的研究。(1)狹義細(xì)胞工程：研究體外分離、培養(yǎng)、增殖、分化動(dòng)物細(xì)胞的條件以及保存、操作及利用動(dòng)物細(xì)胞的工藝技術(shù)體系。(2)組織工程：研究體外培養(yǎng)、增殖動(dòng)物組織的條件以及保存、操作及利用動(dòng)物組織的工藝技術(shù)體系。(3)器官工程：研究體外培養(yǎng)、增殖器官的條件以及保存、操作及利用動(dòng)物器官的工藝技術(shù)體系。(4)動(dòng)物胚胎工程：研究動(dòng)物胚胎生產(chǎn)、保存、操作及移植的工藝技術(shù)體系。3.動(dòng)物細(xì)胞工程研究的意義(1)是動(dòng)物繁殖的重要技術(shù)手段加快動(dòng)物繁殖速度：A.體外受精生產(chǎn)胚胎B.胚胎移植生產(chǎn)動(dòng)物(2)是人類(lèi)輔助生殖技術(shù)的重要組成部分體外受精—胚胎移植技術(shù)，可以克服雄性不育和雌性不孕；(3)是動(dòng)物遺傳育種的重要技術(shù)手段對(duì)精子或卵子進(jìn)行遺傳操作，或利用細(xì)胞融合、胚胎嵌合技術(shù)可以使若干個(gè)動(dòng)物性狀進(jìn)行有機(jī)組合，產(chǎn)生新的生物個(gè)體；(4)生產(chǎn)藥物直接培養(yǎng)細(xì)胞或組織，從細(xì)胞或組織代謝物中直接獲得藥物;對(duì)細(xì)胞進(jìn)行遺傳操作，生產(chǎn)轉(zhuǎn)基因動(dòng)物，利用轉(zhuǎn)基因動(dòng)物生產(chǎn)藥物（生物反應(yīng)器）；(5)保存珍惜動(dòng)物資源由于動(dòng)物克隆技術(shù)的成功，保存細(xì)胞、組織、胚胎，就意味著保存一個(gè)生命個(gè)體，保存細(xì)胞、組織、胚胎，就意味著保存一個(gè)生物種群(6)提供人類(lèi)器官移植的材料人類(lèi)器官移植發(fā)展很快，目前可以進(jìn)行心臟、肝、腎臟移植，可以進(jìn)行皮膚、角膜、骨髓細(xì)胞移植。三、動(dòng)物細(xì)胞工程講授的主要內(nèi)容 1.動(dòng)物細(xì)胞、組織培養(yǎng)2.動(dòng)物細(xì)胞融合3.動(dòng)物細(xì)胞重組4.向細(xì)胞內(nèi)引入高分子物質(zhì)5.動(dòng)物細(xì)胞冷凍保存6.動(dòng)物胚胎工程四、動(dòng)物細(xì)胞工程實(shí)驗(yàn)（實(shí)習(xí)）內(nèi)容1.實(shí)驗(yàn)儀器設(shè)備的識(shí)別與使用2.動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)用液的制備3.動(dòng)物胎兒成纖維細(xì)胞分離與培養(yǎng)4.動(dòng)物細(xì)胞常規(guī)檢查和生物學(xué)檢測(cè)5.培養(yǎng)細(xì)胞的凍存與復(fù)蘇五、動(dòng)物細(xì)胞工程研究取得的重要進(jìn)展1.精液采集、精液冷凍與人工授精技術(shù)的成熟和發(fā)展，為充分發(fā)揮利用雄性動(dòng)物生殖潛力奠定了基礎(chǔ)；2.雌性動(dòng)物卵母細(xì)胞體外成熟培養(yǎng)技術(shù)的成功，使人們?cè)隗w外完成動(dòng)物生殖過(guò)程成為可能；3.體外受精與胚胎移植技術(shù)的成功，產(chǎn)生了試管嬰兒，試管牛，試管豬，試管山羊，試管兔；4.細(xì)胞核移植技術(shù)的成功，使人們克隆高等哺乳動(dòng)物的夢(mèng)想得以實(shí)現(xiàn)體細(xì)胞核移植、胚胎細(xì)胞核移植、胚胎干細(xì)胞核移植技術(shù)的成功，為克隆動(dòng)物和轉(zhuǎn)基因動(dòng)物生產(chǎn)提供了技術(shù)支撐；5.胚胎干細(xì)胞與組織干細(xì)胞成功分離、體外擴(kuò)增與誘導(dǎo)分化研究的成功，為人類(lèi)醫(yī)學(xué)發(fā)展提供了寶貴的材料；胚胎干細(xì)胞，胰腺干細(xì)胞，神經(jīng)干細(xì)胞，骨髓干細(xì)胞，皮膚干細(xì)胞，角膜干細(xì)胞6.轉(zhuǎn)基因細(xì)胞（細(xì)胞轉(zhuǎn)染基因）技術(shù)的成功，為轉(zhuǎn)基因動(dòng)物的生產(chǎn)創(chuàng)造了條件；7.胚胎嵌合技術(shù)一種或兩種動(dòng)物胚胎共同生長(zhǎng)發(fā)育形成一個(gè)生物個(gè)體的技術(shù)，即在一個(gè)生物體內(nèi)，含有來(lái)源于兩個(gè)不同胚胎的細(xì)胞和組織；8.細(xì)胞融合技術(shù)將兩種或兩種以上的細(xì)胞融合，形成一個(gè)具有新性狀的細(xì)胞，這種技術(shù)稱(chēng)為細(xì)胞融合技術(shù)。細(xì)胞融合技術(shù)為單克隆抗體及其它藥物生產(chǎn)，創(chuàng)造了條件；9.細(xì)胞重組技術(shù)一方面，細(xì)胞核與細(xì)胞質(zhì)互換，研究細(xì)胞質(zhì)對(duì)細(xì)胞核基因表達(dá)及組織發(fā)育的影響，另一方面，利用細(xì)胞核移植技術(shù)生產(chǎn)克隆動(dòng)物與胚胎，為轉(zhuǎn)基因動(dòng)物生產(chǎn)創(chuàng)造條件。第二章

動(dòng)物細(xì)胞與組織培養(yǎng)概論一、培養(yǎng)的基本概念動(dòng)物組織細(xì)胞1.組織培養(yǎng)（Tissueculture）組織培養(yǎng)是指從動(dòng)物體內(nèi)取出組織模擬體內(nèi)生理環(huán)境，在無(wú)菌、適當(dāng)溫度和一定營(yíng)養(yǎng)條件下，使動(dòng)物組織生存、生長(zhǎng)并維持其結(jié)構(gòu)與功能的過(guò)程。2.細(xì)胞培養(yǎng)（Tissueculture）細(xì)胞培養(yǎng)是指從動(dòng)物體內(nèi)取出組織，分離獲得細(xì)胞，并模擬體內(nèi)生理環(huán)境，在無(wú)菌、適當(dāng)溫度和一定營(yíng)養(yǎng)條件下，使動(dòng)物細(xì)胞生存、生長(zhǎng)，增殖并維持其結(jié)構(gòu)與功能的過(guò)程。3.器官培養(yǎng)（organculture）器官培養(yǎng)是指從動(dòng)物體內(nèi)取出器官，模擬體內(nèi)生理環(huán)境，在無(wú)菌、適當(dāng)溫度和一定營(yíng)養(yǎng)條件下，使動(dòng)物器官生存、生長(zhǎng)并維持其結(jié)構(gòu)與功能的過(guò)程。二、動(dòng)物組織細(xì)胞培養(yǎng)的作用

1.可以長(zhǎng)時(shí)間觀察和研究活細(xì)胞的生命活動(dòng)；2.理化環(huán)境可以人工控制；3.遺傳性狀均一；4.對(duì)外界環(huán)境刺激反應(yīng)靈敏；5.省費(fèi)用；6.為動(dòng)物繁殖新技術(shù)提供理論依據(jù)和技術(shù)支撐；7.是動(dòng)物遺傳育種的重要技術(shù)手段；8.為醫(yī)學(xué)移植提供材料：細(xì)胞、組織、器官；9.利用細(xì)胞培養(yǎng)，生產(chǎn)生物制品（藥物如疫苗，抗體）；10.保存珍惜動(dòng)物遺傳資源；11.研究生命科學(xué)奧秘三、動(dòng)物細(xì)胞在體外培養(yǎng)過(guò)程中發(fā)生的變化1.環(huán)境不同2.細(xì)胞與細(xì)胞聯(lián)系不緊密3.細(xì)胞容易發(fā)生突變4.細(xì)胞群落結(jié)構(gòu)趨于單一性5.體外培養(yǎng)的細(xì)胞與體內(nèi)細(xì)胞相比較，基因組及遺傳物未發(fā)生改變，但遺傳物質(zhì)的表達(dá)發(fā)生了改變。6.形態(tài)發(fā)生一系列變化（2小時(shí)）（1）從分離到附著球形（圓形）→扁平狀（延展細(xì)胞）→極性細(xì)胞（紡錘形、三角形，多角形）（2）細(xì)胞器和細(xì)胞核集中于細(xì)胞中央，胞質(zhì)外周包裹透明狀膠體（細(xì)胞骨架）（3）活細(xì)胞形態(tài)在光學(xué)顯微鏡下，細(xì)胞均質(zhì)而透明，結(jié)構(gòu)不明顯，在相差顯微鏡下，可以看到細(xì)胞輪廓和內(nèi)部結(jié)構(gòu)，細(xì)胞中含有一個(gè)或兩個(gè)細(xì)胞核核仁。（4）弱（死）細(xì)胞形態(tài)細(xì)胞輪廓增強(qiáng)，細(xì)胞質(zhì)中出現(xiàn)顆粒脂滴和空泡。7.培養(yǎng)細(xì)胞對(duì)生存環(huán)境要求更嚴(yán)格，更脆弱，由于缺少保護(hù)機(jī)制和解毒機(jī)制，細(xì)胞需要無(wú)毒、無(wú)污染的環(huán)境。四、體外培養(yǎng)細(xì)胞的類(lèi)型1.根據(jù)培養(yǎng)細(xì)胞生長(zhǎng)是否需要支持物，細(xì)胞分為兩種類(lèi)型（1）貼附型細(xì)胞：在體外培養(yǎng)過(guò)程中，需要附著在支持物上的細(xì)胞，被稱(chēng)為貼附型細(xì)胞。如成纖維型細(xì)胞，上皮型細(xì)胞，游走型細(xì)胞（可以移動(dòng)），多型細(xì)胞（神經(jīng)細(xì)胞，難以確定穩(wěn)定狀態(tài)）。（2）懸浮細(xì)胞：在體外培養(yǎng)過(guò)程中，不需要支持物，需要懸浮在培養(yǎng)液中的的細(xì)胞，被稱(chēng)為懸浮細(xì)胞。如紅細(xì)胞，白細(xì)胞。2.根據(jù)培養(yǎng)細(xì)胞生物學(xué)特性，將培養(yǎng)細(xì)胞分為：神經(jīng)細(xì)胞、上皮細(xì)胞、脂肪細(xì)胞、血細(xì)胞（紅細(xì)胞、白細(xì)胞）、淋巴細(xì)胞、心肌細(xì)胞、骨骼細(xì)胞、生殖細(xì)胞五、組織培養(yǎng)細(xì)胞的生長(zhǎng)和增殖過(guò)程1.體外培養(yǎng)細(xì)胞不同代數(shù)指數(shù)期細(xì)胞生長(zhǎng)規(guī)律（1）原代培養(yǎng)期從動(dòng)物體內(nèi)取出新鮮組織，分離獲得細(xì)胞，細(xì)胞在體外初次培養(yǎng)生長(zhǎng)至第一傳代期，細(xì)胞開(kāi)始分裂，指數(shù)期細(xì)胞數(shù)量較少，大多數(shù)為異質(zhì)細(xì)胞（不同類(lèi)型細(xì)胞），為2倍體。（2）傳代期當(dāng)原代細(xì)胞在體外培養(yǎng)，密度達(dá)到最大，出現(xiàn)片層時(shí)，將細(xì)胞群消化分離成單個(gè)細(xì)胞或多個(gè)細(xì)胞，在體外培養(yǎng)生長(zhǎng)至飽和密度的過(guò)程，傳代期可以持續(xù)進(jìn)行數(shù)十代。處于傳代期細(xì)胞指數(shù)期細(xì)胞數(shù)量最大，細(xì)胞生長(zhǎng)分裂速度最高。（3）衰退期有限細(xì)胞系細(xì)胞開(kāi)始衰老，分裂增殖能力下降，指數(shù)期細(xì)胞數(shù)量下降的過(guò)程。2.同代數(shù)細(xì)胞分裂增殖規(guī)律（1）滯留期細(xì)胞質(zhì)收縮，呈球形，細(xì)胞開(kāi)始懸浮于培養(yǎng)液，隨后，附著性細(xì)胞活細(xì)胞開(kāi)始附著，具有代謝與運(yùn)動(dòng)能力，但不分裂。（2）指數(shù)增長(zhǎng)期細(xì)胞分裂旺盛，細(xì)胞分裂速度增加，細(xì)胞數(shù)量快速增加，細(xì)胞活力最大，細(xì)胞相互連接形成片層。（3）平臺(tái)期由于密度增大，細(xì)胞相互之間密切接觸產(chǎn)生抑制效應(yīng)導(dǎo)致細(xì)胞分裂速度減小，死亡速度增加，細(xì)胞數(shù)量處于穩(wěn)定時(shí)期，細(xì)胞數(shù)量達(dá)到最大。細(xì)胞有活力但分裂停止。（4）衰老期由于密度制約，養(yǎng)分供應(yīng)不足，細(xì)胞衰老死亡數(shù)量增加，細(xì)胞分裂速度減慢，細(xì)胞數(shù)量開(kāi)始減少。3.單個(gè)細(xì)胞生長(zhǎng)過(guò)程（1）A間期（2）G1期：DNA合成前期（3）S期：DNA合成期（4）G2期DNA合成后期，細(xì)胞分裂前期（5）M期：細(xì)胞分裂期（有絲分裂前、中、后、末期）4.培養(yǎng)細(xì)胞生長(zhǎng)特點(diǎn)（1）貼附、伸展大多數(shù)哺乳類(lèi)動(dòng)物細(xì)胞在動(dòng)物體內(nèi)生長(zhǎng)分裂發(fā)育過(guò)程中，需要附著在基質(zhì)上，體外培養(yǎng)的許多細(xì)胞，也趨向于附著在細(xì)胞支持物上，如細(xì)胞附著在膠原蛋白、玻璃或塑料上。（2）接觸抑制在一般情況下，體外培養(yǎng)的細(xì)胞在生長(zhǎng)過(guò)程中發(fā)生分裂和增殖，正常細(xì)胞不斷運(yùn)動(dòng)，其外周細(xì)胞膜呈現(xiàn)一些特征性觸褶運(yùn)動(dòng)，當(dāng)兩個(gè)細(xì)胞相互靠近時(shí)，另一個(gè)細(xì)胞停止運(yùn)動(dòng)并向另一個(gè)方向離開(kāi)，當(dāng)一個(gè)細(xì)胞被其他細(xì)胞包圍不能運(yùn)動(dòng)時(shí)，細(xì)胞膜觸褶運(yùn)動(dòng)和分裂增殖將會(huì)受到抑制。（3）密度依賴(lài)性任何細(xì)胞分裂增殖，都需要一定的細(xì)胞密度，細(xì)胞密度過(guò)小，對(duì)細(xì)胞分裂增殖不利。細(xì)胞密度過(guò)大，對(duì)細(xì)胞增殖也不利。細(xì)胞密度對(duì)細(xì)胞分裂增殖的不可缺少的作用稱(chēng)為細(xì)胞密度的依賴(lài)性。在細(xì)胞生活過(guò)程中，細(xì)胞個(gè)體之間存在著形態(tài)的和機(jī)能的聯(lián)系，如上皮細(xì)胞之間存在橋粒，細(xì)胞之間存在著能量、物質(zhì)和信息交換。（4）細(xì)胞基質(zhì)（ExtracellularMatrix：ECM）細(xì)胞基質(zhì)對(duì)于細(xì)胞生長(zhǎng)、分裂、增殖與分化具有重要的作用。體外培養(yǎng)細(xì)胞和定向誘導(dǎo)細(xì)胞分化時(shí)，必須考慮細(xì)胞基質(zhì)的作用。六、體外培養(yǎng)細(xì)胞生存的必須條件1.環(huán)境無(wú)污染，無(wú)毒環(huán)境無(wú)污染、無(wú)毒是保證培養(yǎng)細(xì)胞生存的首要條件。環(huán)境無(wú)污染，是指在細(xì)胞培養(yǎng)過(guò)程中，培養(yǎng)液、培養(yǎng)器皿以及操作各個(gè)環(huán)節(jié)無(wú)細(xì)菌、病毒以及衣原體等有害物質(zhì)進(jìn)入。環(huán)境無(wú)毒是指在細(xì)胞培養(yǎng)過(guò)程中，培養(yǎng)液、培養(yǎng)器皿以及操作各個(gè)環(huán)節(jié)無(wú)有毒有害物質(zhì)進(jìn)入培養(yǎng)系統(tǒng)。2.溫度體外培養(yǎng)的細(xì)胞只有保持在一定的恒溫條件下，才能分裂、增殖和生長(zhǎng)，環(huán)境溫度過(guò)低或過(guò)高，都不利于細(xì)胞的生長(zhǎng)。一般情況下，促使細(xì)胞快速增殖的環(huán)境溫度為動(dòng)物的體液溫度，對(duì)于哺乳類(lèi)動(dòng)物，體外培養(yǎng)細(xì)胞的理想溫度是35℃～37℃，鳥(niǎo)類(lèi)動(dòng)物培養(yǎng)細(xì)胞理想溫度是38.5℃。3.CO2和O25%CO2對(duì)于大多數(shù)哺乳類(lèi)動(dòng)物細(xì)胞來(lái)說(shuō)是適宜的。4.pH值大多數(shù)細(xì)胞適宜于在7.2—7.4條件下生長(zhǎng)，PH值低于6.8，高于7.6，對(duì)細(xì)胞分裂增殖都不利。5.滲透壓大多數(shù)細(xì)胞生長(zhǎng)需要一定的滲透壓，滲透壓對(duì)于保持細(xì)胞膜的完整性以及維持細(xì)胞正常的代謝，具有重要作用。大多數(shù)培養(yǎng)細(xì)胞所需要的滲透壓為260～320mmol/l。七、細(xì)胞體外培養(yǎng)所需的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)1.糖類(lèi)主要為單糖如葡萄糖2.氨基酸精氨酸、胱氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、賴(lài)氨酸、蛋氨酸、苯丙氨酸、蘇氨酸、色氨酸、組氨酸、酪氨酸、纈氨酸、谷氨酰胺。3.維生素維生素A，維生素B，維生素C，維生素D，維生素E，維生素K，生物素4.促生長(zhǎng)因子與激素促進(jìn)細(xì)胞分裂、增殖與分化的蛋白質(zhì)、類(lèi)固醇類(lèi)物質(zhì)5.礦物質(zhì)K、Na、Ca、Mg、P、S，F(xiàn)e、Cu、Zn、Se、Cr、Mn、Mu6.水用于細(xì)胞培養(yǎng)的水，需要無(wú)毒、無(wú)菌，一般用二蒸水或四蒸水。八、與細(xì)胞工程有關(guān)的術(shù)語(yǔ)1.細(xì)胞株（cell細(xì)胞strain）：形態(tài)均一，生長(zhǎng)增殖比較穩(wěn)定，生物性狀穩(wěn)定獨(dú)特的一群細(xì)胞。2.細(xì)胞系（cellline）：形態(tài)均一，生長(zhǎng)增殖比較穩(wěn)定，生物性狀穩(wěn)定獨(dú)特的一群細(xì)胞，能不斷的經(jīng)過(guò)傳代而擴(kuò)增。有限細(xì)胞系與細(xì)胞株概念類(lèi)似，可以進(jìn)行有限次傳代而保持細(xì)胞生物學(xué)特性穩(wěn)定。無(wú)限細(xì)胞系是指細(xì)胞可以經(jīng)過(guò)無(wú)限次數(shù)傳代而保持細(xì)胞生物學(xué)特性穩(wěn)定。3.克隆細(xì)胞系：由一個(gè)經(jīng)過(guò)鑒定的細(xì)胞系中的單個(gè)細(xì)胞演變、篩選而產(chǎn)生的一群細(xì)胞，稱(chēng)為克隆細(xì)胞系。4.二倍體細(xì)胞：細(xì)胞群含有兩套染色體。當(dāng)培養(yǎng)細(xì)胞中二倍體細(xì)胞占細(xì)胞總數(shù)的75%以上時(shí)，細(xì)胞群可以認(rèn)為是二倍體培養(yǎng)細(xì)胞。5.單倍體細(xì)胞：細(xì)胞群含有一套染色體，一般為動(dòng)物的生殖細(xì)胞，包括精子和卵子。6.細(xì)胞克隆：一個(gè)細(xì)胞經(jīng)過(guò)培養(yǎng)形成結(jié)構(gòu)與功能完全相同的無(wú)數(shù)細(xì)胞的過(guò)程，稱(chēng)為細(xì)胞克隆。7.細(xì)胞核型：一個(gè)細(xì)胞的染色體按照一定順序排列的圖譜稱(chēng)為細(xì)胞核型。8.初代培養(yǎng)：直接從動(dòng)物體內(nèi)取出的細(xì)胞經(jīng)過(guò)的第一次培養(yǎng)。9.繼代培養(yǎng)：當(dāng)細(xì)胞生長(zhǎng)使細(xì)胞密度處于飽和狀態(tài)時(shí)，對(duì)細(xì)胞進(jìn)行分離，接種和再培養(yǎng)過(guò)程，稱(chēng)為細(xì)胞繼代培養(yǎng)。細(xì)胞繼代培養(yǎng)的主要目的是為細(xì)胞增殖創(chuàng)造有利條件以擴(kuò)大細(xì)胞數(shù)量。九、影響細(xì)胞體外培養(yǎng)效果的因素1.細(xì)胞來(lái)源幼齡易于成年易于老年，分化程度低的細(xì)胞易于分化程度高的細(xì)胞；2.培養(yǎng)條件培養(yǎng)液（DMEM、RPMI1640、MEM-F12)、培養(yǎng)溫度、添加物(EGF、IGF、HGF）；3.貼附底物明膠、成纖維細(xì)胞（小鼠、人）；4.分離方法機(jī)械、酶（tripsin、dispase、EDTA）；5.消化分離時(shí)間第三章動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)的基本設(shè)施與條件一、細(xì)胞工程操作的基本環(huán)節(jié)1.器械、器皿消毒、滅菌以及無(wú)菌操作2.溶液配制、過(guò)濾（滅菌）、保存以及溶液孵育3.細(xì)胞分離、培養(yǎng)4.細(xì)胞操作5.細(xì)胞冷凍保存6.細(xì)胞移植以及細(xì)胞使用二、細(xì)胞工程常用的儀器與設(shè)備1.準(zhǔn)備室的實(shí)驗(yàn)設(shè)備儀器：洗刷設(shè)備、蒸餾水儀、干燥箱、高壓滅菌鍋等；

2.層流室的實(shí)驗(yàn)設(shè)備儀器：無(wú)菌操作間、超凈工作臺(tái)、相差顯微鏡、細(xì)胞培養(yǎng)箱、離心機(jī)、離心管、移液器、培養(yǎng)皿、培養(yǎng)瓶、培養(yǎng)板過(guò)濾器等；3.稱(chēng)量室的實(shí)驗(yàn)設(shè)備儀器：天平、攪拌器、試劑柜等；4.動(dòng)物材料準(zhǔn)備室的實(shí)驗(yàn)設(shè)備儀器：手術(shù)器械等；

5.儲(chǔ)備室的實(shí)驗(yàn)設(shè)備儀器：冰箱、液氮罐等細(xì)胞冷凍設(shè)備，細(xì)胞冷凍管等。第四章動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)液一、培養(yǎng)液概念與種類(lèi)1.概念是指在細(xì)胞培養(yǎng)過(guò)程中用于細(xì)胞和組織洗滌、培養(yǎng)的溶液。2.培養(yǎng)液的種類(lèi)（1）平衡鹽溶液：生理鹽水、PBS、RingerTyrode、earle、Hanks、Dulbecco、D-hanks等；（2）天然培養(yǎng)基：主要來(lái)自動(dòng)物體液或從組織中分離提取制備的溶液，包括血漿、血清、胚胎浸出液、鼠尾膠原、血清代用品等；（3）合成培養(yǎng)基：用人工方法合成的動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)基，包括DMEM、TCM199、MEM、Ham’sF12、RPMI-1640等。二、平衡鹽溶液1.作用：稀釋或灌注液體，緩沖系統(tǒng)，為細(xì)胞代謝提供水分和離子。2.主要成分：NaCl、CaCl2、KCl、MgCl2?6H2O、MgSO4?7H2O、NaHCO3、葡萄糖、NaH2PO4.2H2O、KH2PO4、Na2HPO4.H2O。3.配制方法：（1）稱(chēng)量溶解難溶藥品CaCl2、MgCl2?6H2O、MgSO4?7H2O分別稱(chēng)量，溶解；（2）稱(chēng)量溶解其他藥品并溶解；（3）將難溶溶液緩慢加入到易溶溶液中，并緩慢攪動(dòng)；（4）滅菌：不含有機(jī)物的易溶溶液，可以進(jìn)行高壓消毒，其它溶液可以采取過(guò)濾的方法去除雜質(zhì)和細(xì)菌。三、天然培養(yǎng)液1.血漿（1）作用為細(xì)胞生長(zhǎng)提供營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，為細(xì)胞附著提供支持物，對(duì)細(xì)胞進(jìn)行保護(hù)。（2）制備方法選擇健康動(dòng)物，用肝素抗凝采血，離心，取上清液，過(guò)濾，冷藏。2.血清（1）作用提供蛋白質(zhì)，提供金屬離子，提供激素、為細(xì)胞附著提供支持物。（2）種類(lèi)：兔血清、牛血清、羊血清。（3）制備方法選擇健康動(dòng)物，動(dòng)脈采血，置于含有生理鹽水的瓶?jī)?nèi)，室溫傾斜放置1-2小時(shí)，待血液凝集后置于4℃冰箱保存過(guò)夜，取上清液，離心（3000RPM）20-30分鐘，吸取血清，用之前，過(guò)濾。3.胚胎浸出液取胚胎，磨碎，加等量緩沖液，混勻、離心，取上清液，于-20℃保存。4.鼠尾膠原/明膠5.血清代用品水解乳蛋白四、合成培養(yǎng)基1.概念利用人工方法合成的用于培養(yǎng)細(xì)胞的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)。2.合成培養(yǎng)液的主要成分：氨基酸、維生素、碳水化合物（葡萄糖、核糖、脫氧核糖、丙酮酸鈉、醋酸鈉）、無(wú)機(jī)離子、其他成分（嘌呤、嘧啶、抗壞血酸、谷胱甘肽）3.劑型：（1）溶液（2）粉劑4.溶液配制（1）稱(chēng)量準(zhǔn)確稱(chēng)量藥品，置于燒杯中；（2）溶解加入無(wú)離子水，用磁力攪拌器攪拌，使其溶解；（3）定容將溶液倒入容量瓶中，加入少量無(wú)離子水洗滌燒杯中溶液3-4次，用無(wú)離子水定容。（5）過(guò)濾正壓過(guò)濾或負(fù)壓抽濾。（6）分裝在無(wú)菌條件下將溶液分裝于100毫升試劑瓶。（7）保存0-4℃保存五、其它常用溶液1.消化液(1）胰蛋白酶溶液①胰蛋白酶（trypsin）是一種乳黃色的粉末狀物質(zhì)，來(lái)自豬或牛胰腺組織，作用于賴(lài)氨酸和精氨酸形成的肽鍵，除去細(xì)胞之間粘蛋白及糖蛋白，破壞細(xì)胞與基質(zhì)之間的聯(lián)系，使細(xì)胞分離。②作用對(duì)象間質(zhì)較少的細(xì)胞軟組織，作用時(shí)間過(guò)長(zhǎng)，對(duì)細(xì)胞有損傷作用③溶液配制用無(wú)Ca2+、Mg2+緩沖液配制④工作條件35-37℃⑤終止作用用含有血清的培養(yǎng)基終止消化⑥貯存0℃以下保存⑦消毒抽濾（2）EDTA?2Na溶液①EDTA?2Na是一種白色結(jié)晶狀化學(xué)物質(zhì)，是Ca2+、Mg2+的螯合劑，作用于細(xì)胞液，與細(xì)胞液中Ca2+、Mg2+結(jié)合，破壞細(xì)胞之間的連接，使細(xì)胞解離。②作用對(duì)象作用于上皮組織細(xì)胞③溶液配制用無(wú)Ca2+、Mg2+緩沖液配制④工作條件35-37℃⑤終止作用加入培養(yǎng)液離心，漂洗。⑥貯存4℃-0℃以下保存。⑦消毒高壓（3）膠原蛋白酶溶液①膠原蛋白酶（collagenase）是一種乳黃色的粉末狀物質(zhì)，作用于間質(zhì)的脯氨酸多肽，使其水解，從而使細(xì)胞離散除去細(xì)胞之間粘蛋白及糖蛋白，破壞細(xì)胞與基質(zhì)之間的聯(lián)系，使細(xì)胞分離。②作用對(duì)象作用于膠原蛋白含量高的組織，作用時(shí)間過(guò)長(zhǎng)，對(duì)細(xì)胞有損傷作用③溶液配制用無(wú)Ca2+、Mg2+緩沖液配制④工作條件35-37℃⑤終止作用加入培養(yǎng)液離心，漂洗。⑥貯存4℃-0℃以下保存。⑦消毒過(guò)濾⑧收獲細(xì)胞多次進(jìn)行，每20-30分鐘一次。2.PH值調(diào)整液(1)NaHCO3溶液：7.4%，5.6%和3.7%三種，用37℃三蒸水溶解，定容，過(guò)濾，分裝。(2)10%醋酸溶液高壓滅菌、分裝。(3)Hepes溶液：緩沖溶液。高壓滅菌、分裝。3.L-谷氨酰胺按要求配制，過(guò)濾,分裝,保存。4.抗菌溶液（1）作用抑制微生物增殖(2)

種類(lèi)：①青霉素、鏈霉素②卡那霉素5.抗凝劑—肝素（1）取肝素注射液1支（12500IU），溶于25毫升生理鹽水，溶液濃度為500IU/毫升，使用濃度為10-20IU/毫升。（2）稱(chēng)量肝素0.2克，溶于100毫升生理鹽水，高壓滅菌，貯存，使用時(shí)按1%-2%添加。第五章動(dòng)物細(xì)胞及組織培養(yǎng)一、選取動(dòng)物與獲得材料1.選取動(dòng)物健康、無(wú)疾病，年齡、性別符合研究需要2.處理動(dòng)物注射藥物，如麻醉劑或其他需要藥品3.處死動(dòng)物或固定動(dòng)物4.消毒5.剖解皮膚-皮下組織—腹膜—器官，在對(duì)不同器官進(jìn)行操作時(shí)，應(yīng)該及時(shí)更換滅菌手術(shù)器械，防止污染。6.摘取器官7.洗滌用滅菌生理鹽水或PBS洗滌器官2-3次二、分離組織細(xì)胞1.離心分離法當(dāng)培養(yǎng)物為血液、羊水、腹水、胸水、精液等細(xì)胞懸液時(shí)，可以采用離心分離法，離心速度為500-1000RPM，離心時(shí)間為5-10分鐘。例如，分離白細(xì)胞的程序?yàn)椋海?）取抗凝血若干毫升；（2）按1：1比例加入無(wú)菌分層液后，800-1000RPM離心（3）無(wú)菌分離白細(xì)胞（4）加入BSS液，離心，棄上清液（5）底層為細(xì)胞所要細(xì)胞。2.機(jī)械分散法（1）切割分離法用眼科手術(shù)剪將組織塊切割成小塊，為1mm3，成糊狀為止，加入緩沖液，吹打，低速離心，去上清液，余下組織塊可以培養(yǎng)。（2）機(jī)械分離法對(duì)于動(dòng)物某些軟組織，如腦、胚胎以及腫瘤組織，可以采用剪碎、擠壓法分離細(xì)胞。3.消化分離法（1）切割分離用眼科手術(shù)剪將組織塊切割成小塊，為1mm3，成糊狀為止。（2）蛋白酶消化將適量消化酶溶液加入到組織小塊中，在適當(dāng)溫度（4℃、25℃、35℃）條件下處理若干時(shí)間。（3）終止消化加入含有血清培養(yǎng)液，混勻，離心。（4）洗滌加入緩沖液，懸浮細(xì)胞，離心。（5）懸浮細(xì)胞加入適量培養(yǎng)液，懸浮細(xì)胞。三、細(xì)胞計(jì)數(shù)（實(shí)驗(yàn)課講授）四、細(xì)胞接種1.

稀釋細(xì)胞至所需濃度；2.

將細(xì)胞按照一定數(shù)量置于培養(yǎng)液中，培養(yǎng)。五、從動(dòng)物組織初次細(xì)胞分離培養(yǎng)工藝體系1.切碎組織：用眼科剪將組織塊剪碎至糊狀，組織塊約為1mm3；2.消化組織：加入消化液，在一定條件下消化作用一定時(shí)間；3.過(guò)濾：將細(xì)胞過(guò)濾，組織塊重新消化；4.終止消化：加入一定量含有血清的培養(yǎng)液，終止消化；5.離心：將消化后細(xì)胞置于離心管，1000-1500RPM離心15-20min，棄上清液（加入適量培養(yǎng)液，懸浮細(xì)胞，再離心）；6.懸浮細(xì)胞：棄上清液，加入適量培養(yǎng)液，懸浮細(xì)胞；7.計(jì)數(shù)：用紅血球計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)；8.稀釋?zhuān)喊匆蠹尤脒m量培養(yǎng)液，稀釋細(xì)胞；9.接種：加入一定量細(xì)胞于含有培養(yǎng)液的培養(yǎng)皿或培養(yǎng)瓶中，震蕩細(xì)胞；10.培養(yǎng)：將培養(yǎng)皿（培養(yǎng)瓶）置于37-38℃，飽和濕度，含5%CO2培養(yǎng)箱中，培養(yǎng)；11.換液：每隔48-72小時(shí)更換1次溶液。六、動(dòng)物組織塊培養(yǎng)工藝體系1.切碎組織：用眼科剪將組織塊剪碎至糊狀，組織塊約為1mm3。2.洗滌：加入洗滌液，用移液管反復(fù)吹打在，靜置一定一定時(shí)間，棄去上清液。3.培養(yǎng)：將組織塊置于培養(yǎng)皿（培養(yǎng)瓶）中，加入細(xì)胞培養(yǎng)液，將培養(yǎng)皿（培養(yǎng)瓶）置于37-38℃，飽和濕度，含5%CO2培養(yǎng)箱中，培養(yǎng)。4.換液：每隔48-72小時(shí)更換1次溶液。七、細(xì)胞傳代培養(yǎng)1.棄培養(yǎng)液；2.洗滌：加入洗滌液，洗滌2-3次；3.消化細(xì)胞：加入消化液，在室溫條件下作用一定時(shí)4.終止消化：待細(xì)胞片層開(kāi)始脫落時(shí)，吸取消化液，加入適量含有血清的培養(yǎng)基，終止消化。5.洗滌細(xì)胞：用移液管吹打細(xì)胞，離心，棄上清液，加入培養(yǎng)液，再離心。6.懸浮細(xì)胞：加入一定量細(xì)胞培養(yǎng)液，吹打細(xì)胞，制作細(xì)胞懸浮液。7.接種細(xì)胞：將細(xì)胞接種到含有新鮮培養(yǎng)液的培養(yǎng)皿（培養(yǎng)瓶）中，置于37-38℃，飽和濕度，含5%CO2培養(yǎng)箱中，培養(yǎng)。8.換液：每隔48-72小時(shí)更換1次溶液。第六章動(dòng)物細(xì)胞組織保存一、動(dòng)物組織細(xì)胞保存的基本概念1.細(xì)胞組織冷凍保存的定義利用液氮（-196℃）、干冰（-79℃）或其它制冷設(shè)備作為冷源，將動(dòng)物組織細(xì)胞經(jīng)過(guò)冷凍保護(hù)劑處理，按照一定程序降溫，將細(xì)胞冷凍長(zhǎng)期保存在超低溫條件下，以達(dá)到長(zhǎng)期保存細(xì)胞組織的目的。2.冷凍細(xì)胞種類(lèi)：精液、卵母細(xì)胞、胚胎、組織、細(xì)胞、病毒、真菌3.冷凍保護(hù)劑在細(xì)胞冷凍過(guò)程中，添加于培養(yǎng)液或稀釋液中用于防止冷凍對(duì)細(xì)胞產(chǎn)生損傷的一類(lèi)物質(zhì)，包括甘油、DMSO、DMA、聚丙二醇。二、細(xì)胞冷凍保存原理1.低溫保存，延長(zhǎng)細(xì)胞壽命在低溫條件下，細(xì)胞代謝水平降低，消耗營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)數(shù)量減少，細(xì)胞生存壽命延長(zhǎng)；超低溫條件下，細(xì)胞代謝幾乎停止，可以長(zhǎng)期保存。在一定條件下解凍，冷凍保存的細(xì)胞仍然保存活力。2.在一般降溫情況下，細(xì)胞水分形成大的冰晶對(duì)細(xì)胞產(chǎn)生損傷在一般情況下，溫度下降至冰點(diǎn)以下，細(xì)胞中水分形成大的冰晶，產(chǎn)生兩種效應(yīng)，一種效應(yīng)是細(xì)胞中冰晶移動(dòng)，對(duì)細(xì)胞膜、質(zhì)膜和細(xì)胞器產(chǎn)生機(jī)械損傷，造成細(xì)胞死亡，另一種效應(yīng)是細(xì)胞中部分水分形成冰晶，造成細(xì)胞局部形成高滲環(huán)境，細(xì)胞局部脫水，造成細(xì)胞不可逆轉(zhuǎn)發(fā)生結(jié)構(gòu)變化，引起細(xì)胞死亡。3.冷凍保護(hù)劑的作用就在于在細(xì)胞冷凍過(guò)程中，冷凍保護(hù)劑滲透到細(xì)胞內(nèi)，與細(xì)胞中的水分結(jié)合，限制和干擾水分進(jìn)行晶格排列，降低冰點(diǎn)，抑制水形成冰晶的速度與體積；冷凍保護(hù)劑滲透到細(xì)胞內(nèi)，迫使部分水和鹽排出細(xì)胞外，減少電解質(zhì)濃度增加對(duì)細(xì)胞的損害。三、細(xì)胞組織冷凍工藝與技術(shù)1.配制冷凍保護(hù)液和稀釋液10%DMSO+10%小牛血清+80%培養(yǎng)液，保存在0-4℃冰箱中。2.處理組織細(xì)胞，獲得冷凍材料用胰蛋白酶消化單層細(xì)胞，用培養(yǎng)液中和酶的消化作用，離心，洗滌，獲得細(xì)胞。3.裝管向離心管中加入冷凍保護(hù)液，制成細(xì)胞懸液，裝管，標(biāo)記。（低溫操作）5.平衡將含有冷凍細(xì)胞懸液的冷凍保存管置于0-4℃冰箱中保存30分鐘，使冷凍保護(hù)劑逐步滲透入細(xì)胞內(nèi)。6.降溫將細(xì)胞冷凍管懸浮于-80℃液氮上面，過(guò)夜，使細(xì)胞溫度降低-80℃。7.冷凍保存將細(xì)胞冷凍管投入到液氮中，保存細(xì)胞。8.維護(hù)與管理注意經(jīng)常檢查液氮罐中是否有液氮，及時(shí)添加液氮。四、細(xì)胞解凍與細(xì)胞活力觀察1.溶化冷凍液從液氮中取出細(xì)胞冷凍管，迅速投入到37-39℃熱水中。待溶化后加入含有血清培養(yǎng)液。2.收集細(xì)胞1000rpm離心5分鐘，棄上清液3.洗滌再加入培養(yǎng)液，1000rpm離心5分鐘，棄上清液.4.制作細(xì)胞懸液加入培養(yǎng)液，用吸管吹打，制作細(xì)胞懸液。5.細(xì)胞活力檢測(cè)將0.5%臺(tái)盼藍(lán)按體積比1：1的比例加入到細(xì)胞懸液中，混勻，1分鐘后制片，觀察，計(jì)算200個(gè)細(xì)胞中的活細(xì)胞與死細(xì)胞數(shù)，計(jì)算細(xì)胞活力。五、細(xì)胞組織冷凍保存的意義1.為生物多樣性保護(hù)提供了有效方法：保存物種資源、保存遺傳（基因）資源2.為疾病治療保存了寶貴的材料：細(xì)胞組織作為醫(yī)用材料，利用冷凍方法長(zhǎng)期保存，克服時(shí)間和空間限制，為醫(yī)學(xué)治療提供充足的材料。3.為科學(xué)研究保存實(shí)驗(yàn)材料：細(xì)菌、病毒、真菌、組織、細(xì)胞4.為畜牧業(yè)生產(chǎn)中的家畜改良提供有效方法：精液冷凍—人工授精—胚胎移植—?jiǎng)游锟寺　D(zhuǎn)基因動(dòng)物生產(chǎn)5.

為動(dòng)物新品種引進(jìn)提供有效方法：活體引進(jìn)、胚胎引進(jìn)、精液引進(jìn)第七章細(xì)胞融合技術(shù)一、細(xì)胞融合的概念1.定義不同來(lái)源的兩種細(xì)胞經(jīng)過(guò)特殊處理使其原生質(zhì)、細(xì)胞膜、質(zhì)膜相互作用，融合形成一個(gè)新類(lèi)型細(xì)胞的過(guò)程，稱(chēng)為細(xì)胞融合。細(xì)胞融合也稱(chēng)為細(xì)胞雜交。2.細(xì)胞融合的意義（1）為遠(yuǎn)緣雜交提供有效手段創(chuàng)造細(xì)胞質(zhì)雜種；（2）擴(kuò)大遺傳變異范圍；（3）生產(chǎn)單克隆抗體；（4）為外源基因?qū)爰?xì)胞創(chuàng)造條件。3.細(xì)胞融合的對(duì)象：體細(xì)胞、種間雜交、種內(nèi)雜交4.細(xì)胞融合的基本原理：兩個(gè)不同來(lái)源的原生質(zhì)體或細(xì)胞經(jīng)過(guò)特殊處理，融合為一體，形成的新細(xì)胞包含兩種物種細(xì)胞的遺傳信息，具有兩種細(xì)胞的生物學(xué)性狀，可能產(chǎn)生雜交優(yōu)勢(shì)，形成一個(gè)新物種。5.細(xì)胞融合的基本過(guò)程：細(xì)胞相互靠近→細(xì)胞橋形成→細(xì)胞質(zhì)滲透→細(xì)胞核融合6.細(xì)胞融合的材料：原生植物質(zhì)體、微生物原生質(zhì)體、動(dòng)物細(xì)胞二、細(xì)胞融合技術(shù)1.

病毒法（1）選取病毒材料：仙臺(tái)病毒是一類(lèi)RNA病毒，為被膜病毒，病毒被膜由兩層磷脂分子層組成。仙臺(tái)病毒與細(xì)胞接觸，可以融解細(xì)胞膜并與細(xì)胞膜融合。仙臺(tái)病毒對(duì)細(xì)胞有害，可以破壞細(xì)胞結(jié)構(gòu)與功能，導(dǎo)致細(xì)胞死亡。（2）處理病毒：用紫外線照射或β-丙炔內(nèi)酯滅活病毒，使其喪失感染性，保留融合性。（3）細(xì)胞與病毒結(jié)合：將細(xì)胞與病毒混合，在0-4℃條件下保存10分鐘，使病毒與細(xì)胞黏結(jié)。（4）細(xì)胞與病毒融合：在37℃條件下保存10分鐘，病毒被膜與細(xì)胞膜融合，圍在病毒上的細(xì)胞膜以及病毒脫離細(xì)胞，細(xì)胞膜破裂，出現(xiàn)裂口。兩個(gè)破裂的細(xì)胞彼此在破裂處連接，融合成一個(gè)細(xì)胞。融合細(xì)胞變圓，形成一個(gè)新細(xì)胞。2.化學(xué)法（1）化學(xué)法融合所用的誘導(dǎo)劑：①脂溶性試劑：PEG（聚乙二醇）、二甲椏楓（DMSO）、甘油-醋酸酯②硝酸鹽：NaNO3，KaNO3，Ca（NO3）2③氯化物：NaCl，CaCl2，MgCl2，BaCl2④葡聚糖硫酸鹽葡聚糖硫酸鉀、葡聚糖硫酸鈉⑤Ca2+絡(luò)合物、PH誘導(dǎo)法（2）方法：①制備兩種細(xì)胞，制備細(xì)胞懸液，密度調(diào)節(jié)為105個(gè)/毫升。②混合兩種細(xì)胞將兩種細(xì)胞懸液混勻③配制融合劑將PEG加熱融化，加入磷酸鹽緩沖液，配制成濃度為55%的溶液。④融合將融合劑按1：3比例加入到兩種細(xì)胞懸液中，24℃培育10-20分鐘。加入高PH、高鈣離子溶液，混勻，靜置15分鐘。⑤洗滌加入磷酸鹽緩沖液，離心，棄上清液，重復(fù)2次。⑥培養(yǎng)細(xì)胞，檢查細(xì)胞融合率。3.物理法—電融合法（1）概念利用直流脈沖電流作用于細(xì)胞，使細(xì)胞膜表面的電荷與氧化還原電位發(fā)生瞬間改變，促使兩個(gè)細(xì)胞膜通透性瞬間增大而發(fā)生質(zhì)膜融合。（2）方法細(xì)胞置于融合室→兩個(gè)細(xì)胞分別于融合室兩端電極相連→用5-12mA電流刺激5MS→細(xì)胞膜瞬間穿孔→接成橋→形成囊泡→細(xì)胞融合。三、細(xì)胞融合工藝體系四、細(xì)胞融合技術(shù)的應(yīng)用1.

單克隆抗體的生產(chǎn)（1）原理應(yīng)用細(xì)胞融合技術(shù)，將能產(chǎn)生抗體的細(xì)胞與永生化細(xì)胞融合，產(chǎn)生一種能生產(chǎn)抗體的永生化新類(lèi)型細(xì)胞，大量生產(chǎn)抗體。（2）基本技術(shù)過(guò)程①免疫動(dòng)物：向動(dòng)物腹腔注射抗原，刺激動(dòng)物免疫系統(tǒng)（脾臟等）產(chǎn)生抗體，；②測(cè)定抗體效價(jià)：采動(dòng)物血，分離出血清，進(jìn)行血凝試驗(yàn)，測(cè)定免疫效價(jià)；③培養(yǎng)骨髓瘤細(xì)胞；④分離出能產(chǎn)生一定免疫能力的脾細(xì)胞；⑤將脾細(xì)胞與對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的骨髓瘤細(xì)胞融合，產(chǎn)生一種能生產(chǎn)抗體的永生化新細(xì)胞；⑥篩選新細(xì)胞，大量擴(kuò)增，生產(chǎn)抗體。2.

植物新品種培育（1）意義：通過(guò)誘導(dǎo)不同種間、屬間或科間原生質(zhì)體融合，①?gòu)V泛組合各種基因型，形成有性雜交無(wú)法獲得的新型雜種植株；②可將各種細(xì)胞器、基因片斷、病毒等外源性遺傳物質(zhì)導(dǎo)入原生質(zhì)體，引起細(xì)胞遺傳性的改變；③是研究細(xì)胞（璧、膜、質(zhì)）的一種手段。（2）基本技術(shù)過(guò)程①獲得原生質(zhì)；②純化原生質(zhì)沉降法、飄浮法等；③培養(yǎng)原生質(zhì)液體培養(yǎng)法、固體平板法、雙層培養(yǎng)法等；④選擇雜種細(xì)胞；⑤培育再生植株。第八章細(xì)胞核移植一、細(xì)胞核移植概念1.定義是指利用顯微操作技術(shù)將一種動(dòng)物細(xì)胞的細(xì)胞核(或整個(gè)細(xì)胞）移入同種或異種動(dòng)物的去核成熟卵內(nèi)，形成核質(zhì)雜種新細(xì)胞。包括胚胎細(xì)胞核移植、體細(xì)胞核移植和線粒體移植等。2.細(xì)胞核移植的意義（1）分割或消化早期胚胎進(jìn)行移植，能克隆多個(gè)子代個(gè)體；（2）為外源基因?qū)爰?xì)胞（或基因敲除）創(chuàng)造條件；（3）為進(jìn)一步研究細(xì)胞核質(zhì)關(guān)系奠定基礎(chǔ)；（4）加速動(dòng)物育種進(jìn)程避免自然條件下選種動(dòng)物育種周期和生育效率的限制。3.核移植發(fā)展史二、細(xì)胞核移植技術(shù)目前進(jìn)行的核移植研究有：早期胚胎細(xì)胞核移植、體細(xì)胞核移植、線粒體核移植、胚胎干細(xì)胞核移植等。主要技術(shù)要點(diǎn)：準(zhǔn)備供體和受體；卵母細(xì)胞去核與成熟；細(xì)胞分離出核；核移入去核卵母細(xì)胞；核移植胚胎早期培養(yǎng)。1.胚胎細(xì)胞核移植（1）概念未著床的早期胚胎分割或消化分散為單個(gè)細(xì)胞，與去染色體未受精的卵母細(xì)胞融合，體外發(fā)育成早期胚胎后，移入受體產(chǎn)生后代的技術(shù)，稱(chēng)為胚胎細(xì)胞核移植。因?yàn)槭菬o(wú)性繁殖，又稱(chēng)克隆。（2）技術(shù)路線（3）方法（以牛卵母細(xì)胞核移植為例）①牛卵母細(xì)胞的體外成熟培養(yǎng)A.獲取卵母細(xì)胞采牛、羊卵巢，放入37℃含雙抗生理鹽水中,6h內(nèi)運(yùn)回實(shí)驗(yàn)室。用35～37℃的加有雙抗滅菌生理鹽水清洗卵巢3次,用注射器吸卵巢表面直徑為2～5mm卵泡的卵泡液。將抽吸物緩慢注入檢卵杯中,靜置,檢卵。B.篩選卵丘卵母細(xì)胞復(fù)合體將檢出卵丘卵母細(xì)胞復(fù)合體級(jí)。A級(jí)：顆粒細(xì)胞層完整且緊密,一般為4～6層,胞質(zhì)均勻；B級(jí)：顆粒細(xì)胞層較少,一般為2～4層,胞質(zhì)均勻；C級(jí)：顆粒細(xì)胞層不全或?yàn)槁懵?。只選擇A，B級(jí)卵丘卵母細(xì)胞復(fù)合體用于成熟培養(yǎng)。C.卵母細(xì)胞成熟培養(yǎng)牛卵母細(xì)胞成熟培養(yǎng)條件為5%CO2，39℃，飽和濕度。成熟培養(yǎng)前2h制作微滴，上蓋石蠟油后置CO2培養(yǎng)箱中平衡。用培養(yǎng)液對(duì)牛卵母細(xì)胞進(jìn)行成熟培養(yǎng)D.卵母細(xì)胞成熟鑒定將培養(yǎng)19～22h的牛卵母細(xì)胞分別用D-hank液清洗3遍,放入含有0.3%透明質(zhì)酸酶的D-hank液內(nèi),培養(yǎng)箱中孵育10min，用150μm的毛細(xì)玻璃管輕輕吹打以除去顆粒細(xì)胞,鏡檢裸卵母細(xì)胞。若出現(xiàn)第一極體說(shuō)明卵母細(xì)胞已培養(yǎng)成熟，可以進(jìn)行顯微操作。②供體胚胎準(zhǔn)備采用顯微切割或胰酶消化的方法，將囊胚期前的胚胎分成幾份或成單個(gè)胚胎細(xì)胞。③卵母細(xì)胞去核顯微操作，盡可能將核去掉。去核操作后，培養(yǎng)箱內(nèi)孵育30min，形態(tài)結(jié)構(gòu)完整者用于構(gòu)建克隆胚胎。④胚胎細(xì)胞核移植顯微鏡下，利用注射針將移植胚胎直接注射到去核卵母細(xì)胞質(zhì)內(nèi)。⑤重構(gòu)胚激活直接注射后，將完整的克隆胚移入M199中洗三次，CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)30min，待成熟24~26時(shí)用化學(xué)方法激活重構(gòu)胚。⑥重構(gòu)胚體外培養(yǎng)將活化的重構(gòu)胚放入培養(yǎng)液中，在38.5℃，5％CO2，飽和濕度的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。48h后觀察卵裂情況。⑦重構(gòu)胚移植通過(guò)手術(shù)，將重構(gòu)胚移入受體母牛子宮，產(chǎn)犢。2.體細(xì)胞核移植（1）概念分離組織成單個(gè)細(xì)胞，將單個(gè)體細(xì)胞核（或整個(gè)細(xì)胞）與去核且未受精的成熟卵母細(xì)胞融合，體外發(fā)育成早期胚胎后，移入母體產(chǎn)生后代的技術(shù)，稱(chēng)為體細(xì)胞核移植。（2）技術(shù)路線三、克隆技術(shù)存在的問(wèn)題1.目前所得到的克隆動(dòng)物具有極大的偶然性和隨機(jī)性，技術(shù)尚不成熟。如，共克隆綿羊胚胎277枚，獲得1個(gè)“Dolly”。2.由于是無(wú)性繁殖，克隆后代一些隱性有害基因更易顯性，壽命、疾病易嚴(yán)重發(fā)生。如，“Dolly”僅活5歲，患嚴(yán)重關(guān)節(jié)炎。3.有性繁殖是自然進(jìn)化的結(jié)果，克隆是否本身就是倒退？4.有背于社會(huì)學(xué)和倫理學(xué)。第九章染色體工程一、染色體變異生物體遺傳信息主要集中在染色體上。通常，每種生物所含染色體的數(shù)目、結(jié)構(gòu)及組成是穩(wěn)定的。但是，有些情況下，生物體的染色體也發(fā)生改變，從而導(dǎo)致生物性狀發(fā)生改變，而且，一些形狀在物種進(jìn)化和新品種培育方面具有重要意義。染色體變異主要體現(xiàn)在：①染色體結(jié)構(gòu)變異，如易位、缺失、倒位、重復(fù)②染色體數(shù)目變異，如整倍體變異和非整倍體變異。染色體易位：指一個(gè)染色體的牟取段與另一非同源染色體區(qū)段發(fā)生互換；染色體缺失：染色體某一區(qū)段及其攜帶基因丟失；染色體倒位：染色體某一區(qū)段連同攜帶基因的順序發(fā)生180度倒轉(zhuǎn)；染色體重復(fù)：染色體上增加了形同的某區(qū)段。二、染色體工程概念1.定義是指利用物理、化學(xué)或生物的方法，有計(jì)劃地消減、添加或代換同種或異種染色體，從而達(dá)到定向改變遺傳性狀和選育新品種的一種技術(shù)。2.染色體工程的應(yīng)用意義（1）多倍體育種及單倍體育種能產(chǎn)生抗逆性強(qiáng)、經(jīng)濟(jì)性狀較好的后代；（2）雌核或雄核發(fā)育技術(shù)易產(chǎn)生純系動(dòng)植物，也為產(chǎn)生單姓種群提供了可能；（3）染色體顯微操作任意改變?nèi)旧w數(shù)目或片斷或轉(zhuǎn)移染色體；（4）染色體介導(dǎo)轉(zhuǎn)移基因獲得遺傳新性狀。三、多倍體育種1.概念染色體經(jīng)過(guò)自然或人工加倍，形成含有多個(gè)染色體組新品種的過(guò)程，稱(chēng)為多倍體育種。包括同源多倍體育種和異源多倍體育種。2.方法包括化學(xué)、物理和生物的方法。①化學(xué)法利用化學(xué)藥物阻止卵母細(xì)胞第二集體放出或受精卵進(jìn)行有絲分裂，從而產(chǎn)生三倍體或四倍體。如，秋水仙素能抑制細(xì)胞分裂中紡錘絲的形成，抑制有絲分裂；細(xì)胞松弛素能抑制肌動(dòng)蛋白聚合成微絲，抑制細(xì)胞質(zhì)分裂。②物理法通過(guò)溫度激變、機(jī)械創(chuàng)傷、電力輻射、高鹽高堿等方法產(chǎn)生多倍體。如：采用、冷熱休克法處理香魚(yú)均可獲得三倍體后代。③生物學(xué)法采用胚乳培養(yǎng)、體細(xì)胞雜交等技術(shù)產(chǎn)生多倍體后代。如：雌性草魚(yú)與雄性三角魴遠(yuǎn)緣雜交產(chǎn)生草魴三倍體雜種。3．應(yīng)用染色體多倍化能使植物植株活性與酶的差異性增強(qiáng)，新生的多倍體后代與原種相比抗逆性、光合效率等增強(qiáng)，誘導(dǎo)的多倍體動(dòng)物具有良好的生長(zhǎng)特性和生存力。①水產(chǎn)養(yǎng)殖方面如三倍體牡蠣、三倍體鮑與其二倍體原種相比，具有生長(zhǎng)快、個(gè)體大、抗病力強(qiáng)等特點(diǎn)。其技術(shù)路線是：先將正常二倍體誘導(dǎo)為四倍體，再與正常二倍體雜交獲得不育三倍體。②新型農(nóng)業(yè)食品如三倍體無(wú)籽西瓜。其技術(shù)路線是用秋水仙素處理普通二倍體西瓜幼苗，使其染色體數(shù)目加倍，形成同源四倍體西瓜，然后以四倍體西瓜為母本，二倍體西瓜為父本雜交，獲得三倍體無(wú)籽西瓜。③高品質(zhì)樹(shù)木培育如桑樹(shù)、毛白楊的三倍體后代均具有較強(qiáng)的生長(zhǎng)優(yōu)勢(shì)和抗病力。四、單倍體育種染色體數(shù)是正常體細(xì)胞染色體數(shù)一半的細(xì)胞，稱(chēng)單倍體細(xì)胞。由于單倍體只具有一套染色體，染色體上每個(gè)基因都能表現(xiàn)相應(yīng)的性狀，易產(chǎn)生突變，獲得純系，提高育種效率，創(chuàng)造新物種。誘導(dǎo)單倍體的方法有遠(yuǎn)緣雜交、輻射、細(xì)胞核置換等。五、雌核發(fā)育1.定義是一種通過(guò)抑制精子參與受精卵的發(fā)育，使胚胎僅在母體遺傳的控制下發(fā)育為后代的育種技術(shù)。2.技術(shù)路線采用物理或化學(xué)的方法使受精卵中尚未融合的精子染色體遺傳物質(zhì)失活或去掉，并進(jìn)行染色體加倍或阻止卵球第一次有絲分裂或第二極體外排，發(fā)育為單親純合雙倍體純系動(dòng)物。3.研究現(xiàn)狀進(jìn)展緩慢。后代畸形率高，近親繁殖易衰退。六、染色體切割及染色體分離1.染色體切割是利用微細(xì)玻璃針切割法或顯微激光切割法，獲得目的染色體的一種技術(shù)。2.染色體分離采用流式細(xì)胞儀分離目的染色體的方法。其原理是染料Hoechst特異染色A-T堿基，Chromomycin特異染著染C-G堿基，經(jīng)激光照射后，染色體成不同熒光帶，利用計(jì)算機(jī)可將發(fā)統(tǒng)一波長(zhǎng)的染色體收集在一起，實(shí)現(xiàn)染色體分離。七、染色體轉(zhuǎn)移是將與特定基因表達(dá)有關(guān)的染色體或染色體片斷轉(zhuǎn)入受體細(xì)胞，使該基因表達(dá)，并在細(xì)胞分裂中傳遞下去的技術(shù)。包括染色體介導(dǎo)轉(zhuǎn)移法、微細(xì)胞介導(dǎo)基因轉(zhuǎn)移法以及細(xì)胞核融合轉(zhuǎn)移法。第十章干細(xì)胞工程一、干細(xì)胞1.概念干細(xì)胞（stemcell,SC)是一類(lèi)具有無(wú)限自我更新能力的細(xì)胞，能夠產(chǎn)生至少一種類(lèi)型的、高度分化的子代細(xì)胞，能在體外大量擴(kuò)增、凍存而不失其原有特性。2.分類(lèi)（1）根據(jù)發(fā)生學(xué)來(lái)源，分為：胚胎干細(xì)胞：是從早期胚胎內(nèi)細(xì)胞團(tuán)或原始生殖細(xì)胞經(jīng)體外分化抑制培養(yǎng)篩選分離出來(lái)的具有發(fā)育全能性的細(xì)胞。它既可以象其它細(xì)胞一樣在體外培養(yǎng)、增值、冷凍、保存、操作和篩選，又可通過(guò)嵌合或核移植參與各種組織的發(fā)育，形成克隆動(dòng)物。成體干細(xì)胞：是存在于一種已經(jīng)分化組織中的未分化細(xì)胞，這種細(xì)胞能夠自我更新且能