第七章 體液蛋白質(zhì)檢驗(yàn)

第七章體液蛋白質(zhì)檢驗(yàn)第1頁，共26頁，2023年，2月20日，星期一本章內(nèi)容概要第一節(jié)概述第二節(jié)血清總蛋白測定第三節(jié)血清清蛋白測定第四季血漿纖維蛋白原測定第五節(jié)血清粘蛋白測定第六節(jié)其他體液蛋白質(zhì)測定第七節(jié)血清蛋白電泳分析第2頁，共26頁，2023年，2月20日，星期一本章教學(xué)要求掌握血清總蛋白測定、血清清蛋白測定、醋酸纖維素薄膜電泳測定血清蛋白熟悉

血漿蛋白質(zhì)的測定方法及評價、血漿纖維蛋白原測定、聚丙烯酰胺凝膠電泳測定血清蛋白了解血漿蛋白質(zhì)的生理功能、血清粘蛋白測定、其他體液蛋白質(zhì)測定第3頁，共26頁，2023年，2月20日，星期一第一節(jié)概述機(jī)體蛋白質(zhì)：體液蛋白質(zhì)的檢測：

機(jī)體主要的生物大分子含量：人體固體成分的45%種類：10萬，3000~5000種/單細(xì)胞功能：生長，代謝、血凝、運(yùn)動、免疫、信息傳遞等疾病發(fā)生體液蛋白質(zhì)異常第4頁，共26頁，2023年，2月20日，星期一要判斷異常首先要清楚正常的血漿蛋白質(zhì)組成，功能及分類及特點(diǎn)一、血漿蛋白質(zhì)的組成、功能及分類組成：種類：1000種500種200種含量：μgmgg來源：肝臟是蛋白質(zhì)主要的加工廠第5頁，共26頁，2023年，2月20日，星期一功能：（1）營養(yǎng)作用，修補(bǔ)組織蛋白，供能；（2）維持血漿膠體滲透壓：白蛋白維持75%~80%的血漿滲透壓，作用是促使組織液回流入血，維持血管內(nèi)外的水平衡；（3）運(yùn)輸作用：作為激素、維生素、脂類、代謝產(chǎn)物、離子、藥物等的載體；（4）作為PH緩沖系統(tǒng)的一部分：酸性或堿性蛋白質(zhì)，血漿PH7.35-7.45；（5）體液免疫防御系統(tǒng)：作為免疫球蛋白與補(bǔ)體等免疫分子；（6）參與凝血與纖維蛋白溶解；除Ⅳ因子外均可（7）催化作用：酶的本質(zhì)；（8）其他生理功能：代謝調(diào)控作用，作為底物，酶或中間產(chǎn)物抑制或激活組織蛋白酶第6頁，共26頁，2023年，2月20日，星期一分類：依據(jù)來源、分離方法和生理功能來源肝生成：絕大多數(shù)血漿蛋白質(zhì)其他組織細(xì)胞生成：免疫球蛋白和蛋白類激素第7頁，共26頁，2023年，2月20日，星期一分離方法鹽析法：白蛋白/球蛋白（pH7.0半飽和的硫酸銨溶液）電泳法：醋酸纖維素薄膜電泳：6種瓊脂糖凝膠電泳：13種聚丙烯酰胺凝膠電泳：30種SDS聚丙烯酰胺凝膠等電雙向電泳：300種分辨率增高---+纖維蛋白原醋酸纖維素薄膜第8頁，共26頁，2023年，2月20日，星期一二、血漿蛋白質(zhì)的測定方法及評價測定依據(jù)：蛋白質(zhì)測定一般利用蛋白質(zhì)以下的結(jié)構(gòu)或性質(zhì)1、元素組成測定：含N穩(wěn)定；2、重復(fù)的肽鏈結(jié)構(gòu)：具有多個肽鍵；3、酪氨酸和色氨酸與Folin-酚試劑反應(yīng)顯色或UV吸收；4、與色素結(jié)合的能力：與染料以離子鍵或共價鍵連接；5、沉淀后借濁度測定：光度計(jì)測定；6、光折射測定：折射儀測定。第9頁，共26頁，2023年，2月20日，星期一方法化學(xué)法

凱氏定氮法－參考方法，雙縮脲法(推薦)，酚試劑法，比濁法物理法

電泳法、紫外分光光度法染料結(jié)合法免疫化學(xué)法第10頁，共26頁，2023年，2月20日，星期一根據(jù)蛋白質(zhì)平均含氮量16%計(jì)算蛋白濃度凱氏定氮法－參考標(biāo)準(zhǔn)方法(0.05mgN0.3gpro)消化

用濃硫酸將蛋白質(zhì)消化為硫酸銨；（耗時）

蒸餾

用堿性溶液堿化消化液并蒸餾揮發(fā)；

吸收

用酸性溶液（硼酸）吸收氣態(tài)氨（使[H+]

）滴定

用已標(biāo)定的無機(jī)酸滴（使[H+]恢復(fù)），計(jì)算總氮量定蛋白（總氮量-非蛋白氮）×6.25=蛋白含量原理：第11頁，共26頁，2023年，2月20日，星期一評價：優(yōu)點(diǎn)：準(zhǔn)確度高，精密度高，靈敏度高，是公認(rèn)的參考方法。缺點(diǎn)：操作復(fù)雜，費(fèi)時，不適合常規(guī)檢測，血清各蛋白含氮量會有所變化尤其是疾病時。

應(yīng)用：標(biāo)準(zhǔn)蛋白的標(biāo)定及校正其它常規(guī)方法（參考方法）第12頁，共26頁，2023年，2月20日，星期一雙縮脲法原理：

蛋白質(zhì)中的肽鍵（-CONH-）在堿性溶液中能與Cu2+作用而產(chǎn)生紫紅色絡(luò)合物，其顏色的深淺與蛋白質(zhì)的濃度成正比，而與蛋白質(zhì)的分子量及氨基酸成分無關(guān)。條件：至少含兩個肽鍵（-CONH-）基團(tuán)才能和Cu2+形成絡(luò)合物,氨基酸及二肽無反應(yīng),三肽以上才能反應(yīng)。

雙縮脲生成

加熱＋NH322H－180022222N端C端第13頁，共26頁，2023年，2月20日，星期一評價：優(yōu)點(diǎn)：簡便，準(zhǔn)確，重復(fù)性好，10g-120g/L線性好，特異性與精密度好，批內(nèi)CV%＜2%，顯色穩(wěn)定。缺點(diǎn)：靈敏度較差，對蛋白質(zhì)含量低的體液標(biāo)本不適合。

應(yīng)用：常規(guī)推薦方法。手工或上機(jī)使用。第14頁，共26頁，2023年，2月20日，星期一酚試劑法原理：

蛋白質(zhì)分子中的酪氨酸殘基和色氨酸殘基能夠和酚試劑中的磷鎢酸-磷鉬酸反應(yīng)生成藍(lán)色化合物，Lowry改良法：在酚試劑中加入Cu2+（75%呈色），提高了呈色的靈敏度，為雙縮脲法的100倍左右。第15頁，共26頁，2023年，2月20日，星期一評價及應(yīng)用：優(yōu)點(diǎn)：操作簡單，改良法靈敏度高（10μg-60μg），適合測定蛋白含量少的標(biāo)本。缺點(diǎn)：各種蛋白質(zhì)酪氨酸和色氨酸比例不同，只適合測定單一蛋白質(zhì)。受一些藥物干擾。

第16頁，共26頁，2023年，2月20日，星期一比濁法原理：

評價及應(yīng)用：優(yōu)點(diǎn)：簡便不需特殊儀器。缺點(diǎn)：濁度形成的干擾因素多（加試劑方法，反應(yīng)溫度，蛋白絮狀沉淀等）

某些酸類（磺基水楊酸等）和血清蛋白質(zhì)結(jié)合產(chǎn)生沉淀，測其濁度，與標(biāo)準(zhǔn)對比，可求蛋白含量。第17頁，共26頁，2023年，2月20日，星期一電泳法醋酸纖維素薄膜電泳或瓊脂凝膠電泳可將血清蛋白質(zhì)分為清蛋白、α1、α2、β、γ-球蛋白無部分。評價特異性好，了解蛋白質(zhì)全貌的有價值方法電泳技術(shù)操作繁瑣、費(fèi)時、不易自動化第18頁，共26頁，2023年，2月20日，星期一紫外分光光度法

蛋白質(zhì)分子中的酪氨酸和色氨酸等芳香族氨基酸可使蛋白質(zhì)溶液在280nm處有一吸收峰?？捎糜跍y定蛋白質(zhì)但需避免核酸干擾。（1）Lowry-Kalcker公式蛋白質(zhì)濃度（mg/ml）=1.45A280-0.74A260

（2）Warburg-Christian公式蛋白質(zhì)濃度（mg/ml）=1.55A280-0.76A260

原理：第19頁，共26頁，2023年，2月20日，星期一評價及應(yīng)用：優(yōu)點(diǎn)：敏感而簡便，可保留蛋白生物活性，常用與較純的酶和免疫球蛋白。需紫外分光光度計(jì)及石英比色皿。缺點(diǎn)：各種蛋白質(zhì)中芳香族氨基酸含量和比例不同；在280nm測定易受尿酸和膽紅素的干擾；導(dǎo)致準(zhǔn)確性和特異性受影響。措施：在220-225nm波長區(qū)域，用0.15mol/l的NaCl稀釋1000-2000倍可消除干擾。第20頁，共26頁，2023年，2月20日，星期一染料結(jié)合法

在酸性環(huán)境下，帶正電的蛋白質(zhì)（-NH3+)與染料的陰離子產(chǎn)生顏色反應(yīng)，使染料的吸收峰改變，可既而用分光光度法比色測定。原理：常用染料：氨基黑，考馬斯亮藍(lán)等評價及應(yīng)用：優(yōu)點(diǎn)：操作簡便，重復(fù)性好，靈敏度高，且干擾因素少。缺點(diǎn)：特異性不高；不同蛋白質(zhì)和染料的結(jié)合力不一致，標(biāo)準(zhǔn)物不易確定。

第21頁，共26頁，2023年，2月20日，星期一免疫化學(xué)法原理：血漿蛋白質(zhì)具有抗原性，利用抗原和抗體的高度特異性反應(yīng)，形成抗原-抗體復(fù)合物，再經(jīng)過顯色的深淺測定濃度有免疫比濁法、免疫擴(kuò)散法、免疫沉淀法、免疫電泳法優(yōu)點(diǎn)：定量測定個別蛋白質(zhì)，特異性好、靈敏度高缺點(diǎn)：成本高第22頁，共26頁，2023年，2月20日，星期一第二節(jié)血清總蛋白測定原理第23頁，共26頁，2023年，2月20日，星期一

這種紫紅色絡(luò)合物在540nm處的吸光度值與蛋白質(zhì)的含量在10~120g/L范圍內(nèi)呈正比關(guān)系，與經(jīng)過同樣處理的蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)液比較，即可求出蛋白含量。540nm↑條件：至少含兩個肽鍵（-CONH-）基團(tuán)才能和Cu2+形成絡(luò)合物,氨基酸及二肽無反應(yīng),三肽以上才能反應(yīng)。第24頁，共26頁，2023年，2月20日，星期一參考范圍：成人60－80g/L臨床意義：總蛋白升高：總蛋白降低：①丟失過多②吸收不足、消耗增加③白蛋白合成減少