毛細(xì)管電泳CapillaryElectrophoresisCE的學(xué)習(xí)課件

毛細(xì)管電泳CapillaryElectrophoresisCE的學(xué)習(xí)課件第1頁(yè)/共21頁(yè)第十三章毛細(xì)管電泳

（CapillaryElectrophoresis，CE）第一節(jié)概述

早在一百多年以前，較原始的電泳實(shí)驗(yàn)，是在一個(gè)U形一管中進(jìn)行的，管中盛有溶液，兩端置有電極，加上幾百伏電壓后，首次實(shí)驗(yàn)了對(duì)毒素和抗毒素的分離。1909年，L.Michaelis提出“電泳”這一術(shù)語(yǔ)，他的實(shí)驗(yàn)是用于測(cè)定蛋白質(zhì)的等電點(diǎn)。第2頁(yè)/共21頁(yè)

此后，許多的研究報(bào)告涉及氨基酸、肽類(lèi)、蛋白質(zhì)的分離。為了防止電泳完成了的溶液中，再次發(fā)生對(duì)流混合，曾使用了各種穩(wěn)定介質(zhì)，如瓊脂、纖維粉、玻璃絲、硅膠及丙烯酸胺；

為了防止熱擴(kuò)散而使用了一種內(nèi)徑小的管道，管道內(nèi)徑由3mm縮小至75μm。1981年，Jorgenson．和Lukacs

使用75μm內(nèi)徑的熔融石英毛細(xì)管，電泳分離氨基酸和肽。至此，出現(xiàn)了毛細(xì)管電泳（capillaryelectrophoresis，CE）技術(shù)。

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毛細(xì)管電泳，又稱高效毛細(xì)管電泳

（HighPerformancecapillaryelectrophoresis，HPCE），

它不同于經(jīng)典的區(qū)帶電泳，有如下特點(diǎn)：

（1）它是在內(nèi)徑（10～200）μm的石英毛細(xì)管中進(jìn)行的，在毛細(xì)管中的散熱較好，沿著管截面的溫度梯度很小，因此，可以提高加在毛細(xì)管兩端的電壓，所加電壓可高達(dá)幾十千伏。

（2）它不需要阻流介質(zhì)，但可使用凝膠作分子篩介質(zhì)。

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（3）可使用在柱檢測(cè)法，縮短分析時(shí)間，結(jié)合計(jì)算機(jī)處理數(shù)據(jù)，可實(shí)現(xiàn)自動(dòng)化操作。（4）靈敏度高，檢測(cè)限可達(dá)（10-13～10-15）mol，使用激光誘導(dǎo)的熒光檢測(cè)限可達(dá)（10-19～10-21）mol。（5）分辨率高，理論塔板數(shù)為幾十萬(wàn)至幾百萬(wàn)／米。（6）取樣量少，有時(shí)只需幾個(gè)納升（nL，10-9L），流動(dòng)相只需幾毫升。第5頁(yè)/共21頁(yè)第二節(jié)高效毛細(xì)管電泳的基本原理溶質(zhì)在毛細(xì)管區(qū)帶電泳過(guò)程中的傳遞

含離子的溶液，在電場(chǎng)中所發(fā)生的物理過(guò)程服從歐姆定律，當(dāng)有直流電通過(guò)溶液時(shí)，陰離子向陽(yáng)極遷極，陽(yáng)離子向陰極遷移，溶液的導(dǎo)電率取決于離于濃度和其遷移率(又稱淌度，即指溶質(zhì)在單位時(shí)間和單位電場(chǎng)強(qiáng)度下移動(dòng)的距離)。離子遷移率以μ表示，其大小受溶質(zhì)的電荷／離子大小比例所控制。

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在電場(chǎng)的影響下，帶電荷的質(zhì)點(diǎn)受到的力Fe，等于其凈電荷q與電場(chǎng)強(qiáng)度E的乘積，即Fe=q×E。電場(chǎng)強(qiáng)度E以每單位長(zhǎng)度所加的電壓U來(lái)表示，即E=U/L，其中L是毛細(xì)管長(zhǎng)度。Fe對(duì)正電荷為正值，對(duì)負(fù)電行為負(fù)值。電場(chǎng)力促使帶電質(zhì)點(diǎn)向兩極移動(dòng)，質(zhì)點(diǎn)在移動(dòng)過(guò)程中，也受到一種與電場(chǎng)力方向相反的阻滯力Fd，阻止其移動(dòng)，此阻滯力與質(zhì)點(diǎn)的電泳速度υ成正比，由下式結(jié)出第7頁(yè)/共21頁(yè)

Fd=f×υ

式中，f是質(zhì)點(diǎn)平移動(dòng)所受的摩擦阻力，對(duì)小的球狀物質(zhì)點(diǎn)，可用斯托克斯（Stokes）定律表示，即：

f=6πηr

式中，η是溶液的粘度，r是離子半徑。即摩擦阻力正比于溶液的粘度、質(zhì)點(diǎn)大小和其電泳速度。由于存在摩擦阻力，一種帶電質(zhì)點(diǎn)在電場(chǎng)中運(yùn)動(dòng)，被加速到一有限速度，此速度取決于Fe和Fd，這一有限速度稱為電泳速度，υep。當(dāng)促進(jìn)力與阻滯力達(dá)到平衡時(shí)，則

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υep＝q·E／f

將上述表達(dá)式合并，作為電泳遷移率（或電泳淌度）μep。表示式，則

μep＝υep／E＝q士／6πηr

電泳遷移率定義為：一種質(zhì)點(diǎn)在每單位電場(chǎng)強(qiáng)度下的穩(wěn)態(tài)速度。

第9頁(yè)/共21頁(yè)μep

值的大小，取決于分子的凈電荷數(shù)及其摩擦性質(zhì)，（分子大小和形狀）以及所用介質(zhì)的介電常數(shù)ε和粘度η。因而，對(duì)于每一種質(zhì)點(diǎn)，在電場(chǎng)作用下的遷移均具有特定的速度。對(duì)于大分子或膠體，其關(guān)系可表示為第10頁(yè)/共21頁(yè)HPCE分離，幾乎都是在熔融石英毛細(xì)管中完成的，熔融石英是一種高度交聯(lián)的SiO2聚合物，具有很好的抗拉強(qiáng)度。石英毛細(xì)管表面含有許多硅酸基（Si—OH），在一定的條件下可離解。使表面帶有負(fù)電荷。由于表面帶負(fù)電，因此，帶負(fù)電荷的離子被表面排斥，而帶正電均離子則被毛細(xì)管壁吸引。

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在毛細(xì)管壁的陰離子，與來(lái)自主體溶液中的陽(yáng)離子在石英一溶液界面上形成雙電層。由于靜電場(chǎng)的作用，靠近表面的那些抗衡離子是不遷移的，因此構(gòu)成所謂稠密層。由于熱運(yùn)動(dòng)關(guān)系，離表面遠(yuǎn)的離子構(gòu)成可遷移層或擴(kuò)散層，因?yàn)樵陔p電層內(nèi)離子的立體分布，就形成一種電勢(shì)梯度.第12頁(yè)/共21頁(yè)

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當(dāng)在毛細(xì)管兩端加有電場(chǎng)時(shí)；擴(kuò)散層內(nèi)可遷移的陽(yáng)離子向陰極移動(dòng)。由于離子是被水化的，因此，在緩沖液中的液體也隨遷移著的陽(yáng)離子一道，向陰極移動(dòng)，形成一種液流，稱之為電滲流（electroosmoticflow，EOF），它是一種電泳驅(qū)動(dòng)力。在雙電層內(nèi)，EOF總是向雙電層內(nèi)抗衡離子方向遷移，穿過(guò)雙電層的電勢(shì)下降的程度受電滲流速度所控制。電滲流的線速度υeo，可以定義為：第14頁(yè)/共21頁(yè)

Zeta電勢(shì)可表示為：

ξ=4πδρ/ε式中，ρ是毛細(xì)管表面電荷密度；δ為雙電層厚度。按近代電解質(zhì)理論，δ等于1／K，因此式可寫(xiě)為：第15頁(yè)/共21頁(yè)第三節(jié)在CZE分離中的遷移時(shí)間、效率及分辨率

在電滲流存在下，離子的遷移速度可表示為：

υ=（μ±μeo）U/Lt

式中，Ld是毛細(xì)管總長(zhǎng)度；U是外加電壓。離子的遷移時(shí)間為t，則

t=Lt×Ld/（μ±μeo）·U

式中，Lt為進(jìn)樣端到檢測(cè)器之間的毛細(xì)管長(zhǎng)度，或稱為遷移長(zhǎng)度。分離效率n可表示為第16頁(yè)/共21頁(yè)

式中，D為溶質(zhì)的平均擴(kuò)散系數(shù)。由上式可見(jiàn)，如果熱影響阿忽略不計(jì)的話，增大電壓，可增加分離效率。

按Gidding方程[5]，分辨率R只可定義為第17頁(yè)/共21頁(yè)μ1和μ2兩溶質(zhì)的電泳遷移率，而μ是它們的平均電泳遷移率。

在許多情況下，電滲流速度比許多質(zhì)點(diǎn)的電泳速度要快，因此，在毛細(xì)管中的所有溶質(zhì)將朝一個(gè)方向遷移，不管它們帶多少正電荷，都將先被檢出，繼之中性質(zhì)點(diǎn)被檢出，最后帶負(fù)電荷的質(zhì)點(diǎn)被檢出。如下圖所示。第18頁(yè)/共21頁(yè)第19頁(yè)/共21頁(yè)第四節(jié)HPCE儀器的基本結(jié)構(gòu)

HPCE儀器的基本結(jié)構(gòu)如下頁(yè)圖所示。充滿緩沖液的毛細(xì)管，兩端分別浸入盛有緩沖液的儲(chǔ)瓶中，之后通以30kV的電壓，整個(gè)帶電管路置于一個(gè)安全保護(hù)盒內(nèi)以防高壓危險(xiǎn)，打開(kāi)有機(jī)玻璃盒時(shí)即自動(dòng)切斷電源。