氨基酸發(fā)酵的學習課件

氨基酸發(fā)酵的學習課件第1頁/共52頁第9章氨基酸發(fā)酵第2頁/共52頁氨基酸制備最早是在1820年用蛋白質酸水解開始的，1850年化學合成氨基酸研究成功，1956年發(fā)酵生產(chǎn)谷氨酸。氨基酸是重要營養(yǎng)物質，具有重要的生理功能，近年來隨著氨基酸工業(yè)的發(fā)展，氨基酸在食品、醫(yī)藥、農(nóng)業(yè)、化妝品等領域得到廣泛應用，因此氨基酸的生產(chǎn)具有重要的意義。

第3頁/共52頁食品工業(yè)中，甘氨酸、丙氨酸具有甜味，天冬氨酸、谷氨酸具有酸味，谷氨酸鈉、天冬氨酸鈉具有鮮味，賴氨酸、蛋氨酸等是人體必需氨基酸。醫(yī)藥工業(yè)中，多種復合氨基酸制劑可通過輸液治療營養(yǎng)或代謝失調；精氨酸藥物用于治療由氨中毒造成的肝昏迷；絲氨酸藥物用作疲勞恢復劑；蛋氨酸、胱氨酸用于治療脂肪肝；L-谷氨酸與L-谷氨酰胺用于治療腦出血后的記憶力障礙等。第4頁/共52頁

化妝品生產(chǎn)中，胱氨酸用于護發(fā)素，絲氨酸用于面霜中；谷氨酸、甘氨酸、丙氨酸與脂肪酸形成的表面活性劑，具有清洗、抗菌等功能，用于護膚品、洗發(fā)劑中。在農(nóng)業(yè)中，苯丙氨酸和丙氨酸可用于治療蘋果瘡痂?。桓拾彼峥芍瞥沙輨?。賴氨酸、蛋氨酸添加在飼料中，能加速家畜、家禽的生長，改善肉的質量。第5頁/共52頁

從20世紀初期，氨基酸實現(xiàn)工業(yè)化生產(chǎn)以來，氨基酸生產(chǎn)大體有蛋內(nèi)質水解法、化學合成法、微生物發(fā)酵法和酶法四種生產(chǎn)方法。蛋白質水解法：早期味精生產(chǎn)、復合氨基酸；化學合成法：DL-蛋氨酸、甘氨酸、DL-丙氨酸；酶法：L-丙氨酸、L-色氨酸、L-絲氨酸；微生物發(fā)解法：生產(chǎn)60%以上的氨基酸，包括直接發(fā)酵法和添加前體發(fā)酵法。前三種方法成本高，工藝復雜，難以達到工業(yè)化生產(chǎn)目的。第6頁/共52頁9.1谷氨酸的發(fā)酵生產(chǎn)谷氨酸發(fā)酵規(guī)模、產(chǎn)量最大。谷氨酸除用于制造味精外，還可以用來治療神經(jīng)衰弱以及配制營養(yǎng)注射劑等。我國是世界最大味精生產(chǎn)大國。第7頁/共52頁谷氨酸發(fā)酵工藝流程第8頁/共52頁1．谷氨酸生產(chǎn)原料包括碳源、氮源、無機鹽和生長因子等。發(fā)酵原料選擇要考慮：菌體生長繁殖的營養(yǎng)需求、有利于谷氨酸大量積累、產(chǎn)品提取容易、生產(chǎn)周期短及價格便宜。第9頁/共52頁（1）碳源：是構成菌體和合成谷氨酸的碳骨架以及能量來源。一般都是淀粉原料，如玉米、小麥、甘薯、大米等。淀粉先水解成葡萄糖，然后經(jīng)中和、脫色再投放到發(fā)酵罐。也可用糖蜜原料作碳源，糖蜜因富含生物素，發(fā)酵前需除去或破壞生物素。第10頁/共52頁（2）氮源：是合成菌體蛋白質、核酸及谷氨酸的原料。氮源比碳源對谷氨酸發(fā)酵影響更大，約85％的氮源被用于合成谷氨酸，15％用于合成菌體。一般發(fā)酵工業(yè)碳氮比為100:(0.2~2.0)，谷氨酸發(fā)酵的碳氮比為100:(15~21)。目前多用尿素作為氮源，分批流加，流加時溫度不易過高(不超過45℃)，否則游離氨過多，使初始pH過高，抑制菌體生長。第11頁/共52頁（3）無機鹽：是微生物維持生命活動不可缺少的物質。其中磷酸鹽在谷氨酸發(fā)酵中非常重要，是谷氨酸發(fā)酵過程必需的，但濃度不能過高，否則會轉向纈氨酸發(fā)酵。（4）生長因子：谷氨酸生產(chǎn)菌都是生物素缺陷型，生物素為其生長因子。第12頁/共52頁2．谷氨酸生產(chǎn)菌及其擴大培養(yǎng)（1）谷氨酸生產(chǎn)菌目前谷氨酸發(fā)酵菌種有谷氨酸棒桿菌、乳糖發(fā)酵短桿菌、黃色短桿菌、嗜氨小桿菌、球形節(jié)桿菌。報道的谷氨酸生產(chǎn)菌中，除芽孢桿菌外，雖然它們屬于不同的屬種，但都有一些共同特點，如菌體為球形、短桿至棒狀、無鞭毛、不運動、不形成芽孢、呈革蘭氏陽性、需要生物素做生長因子、在通氣條件下培養(yǎng)產(chǎn)生谷氨酸。第13頁/共52頁（2）擴大培養(yǎng)(二級種子培養(yǎng)流程)：斜面菌種

→

一級種子培養(yǎng)

→

二級種子培養(yǎng)

→發(fā)酵罐。第14頁/共52頁3．谷氨酸發(fā)酵機制及工藝控制（1）谷氨酸生物合成途徑：葡萄糖經(jīng)糖酵解(EMP途徑)和己糖磷酸支路(HMP途徑)生成丙酮酸，再氧化成乙酰CoA，然后進入三羧酸循環(huán)，再通過乙醛酸循環(huán)、CO2固定作用，生成α-酮戊二酸，α-酮戊二酸在谷氨酸脫氫酶的催化及有NH4+存在的條件下，生成谷氨酸。第15頁/共52頁谷氨酸發(fā)酵過程中，生物素缺乏時，菌種生長十分緩慢；生物素過量時，則轉為乳酸發(fā)酵；生物素亞適量條件下，谷氨酸產(chǎn)量高。影響谷氨酸代謝途徑的因素第16頁/共52頁（2）谷氨酸發(fā)酵工藝控制①接種量：一般為0.6％~l.7％。由發(fā)酵培養(yǎng)基成分、谷氨酸菌種種類性質、種齡等確定。②溫度控制：前期32±6℃，后期可提高到34℃~37℃。③pH值：前期pH偏低，則菌體生長旺盛，長菌不產(chǎn)酸；pH偏高，菌體生長緩慢，發(fā)酵時間長。一般前期pH值控制在7.5~8.0較為合適，發(fā)酵中、后期將pH值控制在7.0~7.6，常采用氨水流加法或尿素流加法調節(jié)pH。第17頁/共52頁④通風量：長菌階段，若供氧過量，在生物素限量的情況下，抑制菌體生長，表現(xiàn)為耗糖慢，長菌慢，所以發(fā)酵前期以低通風量為宜；發(fā)酵階段，供氧不足，發(fā)酵主產(chǎn)物由谷氨酸變?yōu)槿樗幔园l(fā)酵中、后期以高通風量為宜。第18頁/共52頁4．谷氨酸的提取工藝主要根據(jù)其兩性電解質性質、溶解度和吸附劑的作用以及谷氨酸的成鹽作用等。目前常用方法有等電點法、離子交換法、鋅鹽法、納濾膜等。第19頁/共52頁（1）等電點法提取谷氨酸①原理：谷氨酸分子含有兩個酸性羧基和一個堿性氨基，酸性條件下，即pH＜3.22時，α-羧基的電離受抑制，谷氨酸主要以陽離子形式存在，帶正電荷；當pH＞3.22時，谷氨酸主要以陰離子形式存在，帶負電荷；當pH＝3.22時（即等電點pI），谷氨酸凈電荷為零，呈電中性，溶解度最小，從溶液中析出，通過過濾、離心等可提取出谷氨酸。第20頁/共52頁谷氨酸晶體有兩種，分別是α-型和β-型。α-型晶軸長短接近，晶體粗壯，顆粒大，易沉淀分離，是理想晶體。β-型晶軸長短不一，針狀或鱗片狀，晶粒微細，不易沉淀析出，所以操作中，需控制條件以利于形成α-型。第21頁/共52頁等電點提取谷氨酸工藝流程第22頁/共52頁5．味精的生產(chǎn)味精化學名稱為谷氨酸鈉，是通過對谷氨酸的進一步加工制得的具有特別鮮味的調昧品。（1）味精的生產(chǎn)工藝流程：在谷氨酸生產(chǎn)基礎上通過中和、脫色和除鐵等處理，制得谷氨酸鈉晶體。第23頁/共52頁谷氨酸制味精的工藝流程第24頁/共52頁（2）味精生產(chǎn)工藝控制：①中和：將谷氨酸加水溶解，用碳酸鈉或氫氧化鈉中和。應使谷氨酸一鈉(單鈉鹽)生成量最大，中和時，應先加谷氨酸后加堿，開啟攪拌，溫度控制在65℃左右(低于70℃)，中和液濃度21°Bé~24°Bé，pH5.6~6.8，控制pH不超過7，否則形成二鈉鹽。第25頁/共52頁②中和液的脫色與除鐵：脫色及除鐵后，液體透光率達到90％以上，二價鐵離子濃度低于5mg·L-1?？捎没钚蕴棵撋?，Na2S或離子交換樹脂除鐵。③中和液的濃縮和結晶：減壓濃縮，加入晶種誘導結晶。④味精的干燥及包裝：干燥后經(jīng)化驗，含量符合國家標準后，配入精鹽，真空抽取至混合器混合15min，放出即為成品。第26頁/共52頁9.2賴氨酸的發(fā)酵生產(chǎn)賴氨酸是一種必需氨基酸，可以促進兒童發(fā)育，增強體質，補充適量L-賴氨酸，可大大提高蛋白質的利用率，L-賴氨酸被廣泛用于食品強化劑、飼料添加劑及醫(yī)療保健、滋補飲料等方面，是一個具有廣泛市場的氨基酸產(chǎn)品。目前全世界產(chǎn)量已達10萬噸，而且還呈上升趨勢，其中日本占世界產(chǎn)量的60％，我國賴氨酸生產(chǎn)水平還有待提高。第27頁/共52頁賴氨酸生產(chǎn)工藝流程游離的賴氨酸容易吸收空氣中二氧化碳，制得賴氨酸晶體比較困難，一般工業(yè)賴氨酸產(chǎn)品以賴氨酸鹽酸鹽形式生產(chǎn)。第28頁/共52頁1．賴氨酸的生產(chǎn)原料及菌種碳源一般是玉米、山芋等淀粉原料水解后制得，也可利用糖蜜。碳源濃度不宜過高，否則對菌體生長不利，賴基酸轉化率降低。賴氨酸是二氨基堿性氨基酸，所以發(fā)酵時添加的氮源相對于其他氨基酸要多。常用氮源是硫酸銨和氯化銨。賴氨酸生產(chǎn)菌有兩大類：一類是細菌，多以谷氨酸生產(chǎn)菌為出發(fā)菌通過誘變制得；另一類是酵母菌，但產(chǎn)量較細菌低。第29頁/共52頁2．賴氨酸生產(chǎn)工藝控制（1）賴氨酸的生物合成途徑賴氨酸合成途徑與其他氨基酸不同，依微生物種類不同而異。細菌賴氨酸生物合成途徑需天冬氨酸經(jīng)過反應合成二氨基庚二酸，進而合成賴氨酸，不同細菌生物合成調節(jié)機制不同；酵母賴氨酸合成途徑需天冬氨酸經(jīng)過反應合成α-氨基已二酸，再合成賴氨酸。第30頁/共52頁（2）賴氨酸發(fā)酵工藝控制①賴氨酸發(fā)酵工藝條件：控制溶解氧濃度對賴氨酸發(fā)酵很重要，供氧不足，將導致乳酸積累，并可能導致賴氨酸生產(chǎn)受到不可逆抑制，該抑制作用和細胞膜透性有關。因為供氧不足使細胞體內(nèi)的賴氨酸和磷脂含量增加，而發(fā)酵液中賴氨酸含量很低。發(fā)酵時，前期溫度為32℃，中后期為34℃。pH控制在6.5~7.5，最適pH為7.0，可通過補加尿素或氨水來控制其pH值。第31頁/共52頁②培養(yǎng)基中蘇氨酸、蛋氨酸的控制：賴氨酸生產(chǎn)菌都是高絲氨酸缺陷型，蘇氨酸和蛋氨酸是賴氨酸生產(chǎn)菌的生長因子，在發(fā)酵過程中，如果培養(yǎng)基中兩者含量豐富，就會只長菌，而不產(chǎn)或少產(chǎn)賴氨酸，所以在發(fā)酵時，將蘇氨酸和蛋氨酸控制在亞適量，以提高賴氨酸產(chǎn)量。第32頁/共52頁③發(fā)酵中生物素控制：賴氨酸生產(chǎn)菌多由谷氨酸生產(chǎn)菌誘變而來，都是生物素缺陷型，培養(yǎng)基中限量添加生物素，會導致發(fā)酵轉向谷氨酸方向，大量積累谷氨酸。如果培養(yǎng)基中添加過量生物素，會使細胞內(nèi)合成的谷氨酸對谷氨酸脫氫酶發(fā)生抑制作用，則抑制谷氨酸合成，從而轉向天冬氨酸，大量積累賴氨酸。第33頁/共52頁④發(fā)酵時物質的添加某些物質對賴氨酸產(chǎn)量的影響第34頁/共52頁3．賴氨酸的提取其下游加工包括發(fā)酵液預處理、提取、精制三個階段。（1）發(fā)酵液頂處理發(fā)酵液中加入絮凝劑(明礬等)絮凝后過濾除菌體，也可高速離心進行固-液分離，回收菌體進一步加工利用，濾液用鹽酸調節(jié)pH4.0后備用。（2）賴氨酸提取方法：有沉淀法、有機溶劑抽提法、離子交換、電滲析四種方法。工業(yè)上多采用離子（強酸性）交換法來提取。第35頁/共52頁賴氨酸是堿性氨基酸，等電點為9.59。在pH2.0左右被強酸性陽離子交換樹脂所吸附；在pH7.0~9.0時被弱酸性陽離子交換樹脂所吸附。強酸性陽離子交換樹脂的氫型對賴氨酸的吸附比銨型容易得多，但是銨型能選擇性地吸附賴氨酸和其他堿性氨基酸，不吸附中性和酸性氨基酸，同時在用氨水洗脫賴氨酸后樹脂不必再生。所以多選銨型強酸性陽離子交換樹脂。第36頁/共52頁第37頁/共52頁①樹脂的處理過程：732#陽離子樹脂水洗1mol/L的NaOH處理水洗至pH6.0水洗至pH8.01Mol/L的HCl處理1Mol/L的氨水處理水洗至pH8.0銨型樹脂（待用）第38頁/共52頁②離子交換操作方式：用動態(tài)法離子交換柱交換操作方式，采用多柱串聯(lián)。③水洗：用水洗柱至呈中性，以除去可溶性和非可溶性雜質，以提高賴氨酸質量。④氨水洗脫：后面的洗脫液含賴氨酸少而含氨量高，并于洗脫用氨水中，以提高收集率。⑤濃縮結晶：真空濃縮除氨，用鹽酸調pH4.9，再減壓濃縮，5℃靜置結晶2天，得賴氨酸鹽酸鹽晶體粗品。第39頁/共52頁（3）賴氨酸的精制粗品50℃攪拌溶于去離子水，活性炭60℃保溫脫色1h，趁熱過濾，濾液冷卻后5℃結晶2天。濾取結晶真空干燥或熱風干燥，即得賴氨酸鹽酸鹽成品。第40頁/共52頁9.3其他氨基酸的發(fā)酵生產(chǎn)1．蘇氨酸發(fā)酵用于飼料工業(yè)、保健食品和醫(yī)藥工業(yè)。目前年產(chǎn)量約5萬噸。主要生產(chǎn)企業(yè)為日本味之素公司、德國德固賽公司、美同ADM公司、日本協(xié)和發(fā)酵工業(yè)公司等。它們的產(chǎn)量占全球份額的90％左右。其中，日本味之素公司占據(jù)全球市場60％以上的份額。制備方法有化學合成法、發(fā)酵法和蛋白質水解三種方法，其中以發(fā)酵法最為先進。由微生物發(fā)酵生成的蘇氨酸都是L-蘇氨酸。第41頁/共52頁目前作為蘇氨酸直接發(fā)酵生產(chǎn)菌主要有大腸桿菌、粘質沙雷氏桿菌和短桿菌三類。L-蘇氨酸發(fā)酵均采用基因工程菌生產(chǎn)，產(chǎn)酸約在8％~10％，對糖轉化率25％~30％，提取收率85％。第42頁/共52頁2．纈氨酸L-纈氨酸是人體必需氨基酸，同時又是三種支鏈氨基酸（纈氨酸、異亮氨酸、亮氨酸）之一。L-纈氨酸主要用于配制復合氨基酸制劑，特別是應用于高支鏈氨基酸輸液。近年來發(fā)現(xiàn)L-纈氨酸是一種高效免疫抗生素的原料，使用量猛增。目前只有日本兩家公司生產(chǎn)，年消耗量已達數(shù)干噸。第43頁/共52頁纈氨酸生物合成是：由丙酮酸生成α-乙酰乳酸，再經(jīng)還原脫水得到α-酮基異戊酸，最后生成纈氨酸。其中異亮氨酸與纈氨酸除氨基酸脫水酶外，其他酶是公共的，因此選育突變株應該是纈氨酸結構類似物突變株及異亮氨酸營養(yǎng)缺陷型突變株。第44頁/共52頁3．異亮氨酸、亮氨酸發(fā)酵異亮氨酸、亮氨酸分子中均有甲基側鏈。（1）異亮氨酸發(fā)酵：異亮氨酸有四種異構體，其中僅L-異亮氨酸能為動物所利用。微生物產(chǎn)生的異亮氨酸是L型的。異亮氨酸發(fā)酵方法有兩種：添加前體發(fā)酵法和直接發(fā)酵法。第45頁/共52頁①添加前體發(fā)酵法：合成途徑中關鍵酶是蘇氨酸脫水酶，該酶受異亮氨酸的反饋抑制，且異亮氨酸、纈氨酸的合成酶系還受異亮氨酸、纈氨酸、亮氨酸的多價阻遏，所以在發(fā)酵時添加D-蘇氨酸、α-氨基丁酸等前體，可以解除抑制作用和阻遏作用，大量積累異亮氨酸。②直接發(fā)酵法：應用了抗反饋調節(jié)突變株或營養(yǎng)缺陷型。第46頁/共52頁（2）亮氨酸發(fā)酵：直接前體是纈氨酸的中間體α-酮基異戊酸，其關鍵酶是α-乙酰乳酸合成酶和α-異丙基蘋果酸合成酶，前者受到纈氨酸反饋抑制和三種支鏈氨基酸的多價阻遏；后者受到亮氨酸的