微量克氏定氮法定量測定蛋白質(zhì)含量課件

微量克氏定氮法測定蛋白質(zhì)含量一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康恼莆瘴⒘靠耸隙ǖǘ繙y定蛋白質(zhì)含量的原理和操作技術(shù)。二、實(shí)驗(yàn)原理天然含氮有機(jī)化合物（如蛋白質(zhì)）與濃硫酸共熱時(shí)分解出氨，氨與硫酸反應(yīng)生成硫酸銨。在克氏定氮儀中加入強(qiáng)堿堿化消化液，使硫酸銨分解出氨。用水蒸氣蒸餾法將氨蒸入無機(jī)酸溶液中，然后再用標(biāo)準(zhǔn)酸溶液進(jìn)行滴定，滴定所用無機(jī)酸的量（mol）相當(dāng)于被測樣品中氨的量（mol），根據(jù)所測得的氨量即可計(jì)算樣品的含氮量。但是，這個(gè)反應(yīng)進(jìn)行得比較緩慢，通常需要加入硫酸鉀或硫酸鈉以提高反應(yīng)液的沸點(diǎn)，并加入硫酸銅作為催化劑，以加快反應(yīng)速度。以甘氨酸為例，其消化過程可表示如下：

CH3NH2COOH+3H2SO4→3CO2+3SO2+4H2O+NH3（1）2NH3+H2SO4→(NH4)2SO4

（2）(NH4)2SO4+2NaOH→2H2O+Na2SO4+2NH3

（3）

反應(yīng)（1）、（2）在克氏定氮燒瓶中完成。反應(yīng)（3）在克氏定氮儀內(nèi)進(jìn)行。濃堿可使消化液中的硫酸銨分解，游離出氨。借水蒸氣將產(chǎn)生的氨蒸餾到定量、定濃度的硼酸溶液中，氨與溶液中的氫離子結(jié)合生成銨離子，使溶液中氫離子濃度降低。然后用標(biāo)準(zhǔn)無機(jī)酸滴定至恢復(fù)溶液中原來氫離子濃度為止。最后根據(jù)所用標(biāo)準(zhǔn)酸的摩爾數(shù)計(jì)算出待測物中的總氮量。三、實(shí)驗(yàn)器材1．微量克氏定氮儀：參見圖5-1，1套/組。2．克氏定氮燒瓶：2只/組。3．取樣器：，5mL、1mL各1只/組。

五、實(shí)驗(yàn)操作①.消化：將兩個(gè)50mL的克氏定氮燒瓶編號（在燒瓶口附近），一只燒瓶內(nèi)加1.0mL蒸餾水，作為空白。另一只燒瓶內(nèi)加入1.0mL樣液（卵清蛋白液）。然后用取樣器各加濃硫酸2mL（取濃硫酸時(shí)勿濺到衣物和皮膚上，也不要灑到實(shí)驗(yàn)桌上），用藥勺加硫酸鉀－硫酸銅混合物約20mg（不必稱重，一點(diǎn)點(diǎn)即可），所有試劑要盡量加到克氏定氮燒瓶的底部。燒瓶口插上小漏斗（作冷凝用），燒瓶置通風(fēng)櫥內(nèi)的電爐上加熱消化，參見圖5-3，注意先啟動(dòng)抽風(fēng)機(jī)。消化時(shí)間為2～4h。在消化時(shí)可以同時(shí)進(jìn)行第二步。消化裝置a)蒸餾瓶的洗滌

參見圖5-6，將自來水由5經(jīng)7注入到蒸餾瓶夾層2（即蒸汽發(fā)生室）中，使水面達(dá)到蒸餾瓶頸部的轉(zhuǎn)彎處。把裝有蒸餾水的錐形瓶9置于冷凝器4下方，并將冷凝器下方的導(dǎo)管12下端插入錐形瓶液面以下，再將少量蒸餾水由漏斗3注入到蒸餾瓶的反應(yīng)室1中，把所有夾子夾緊，打開冷凝水。用酒精燈11將蒸餾瓶夾層2內(nèi)的水煮沸，然后移去火源，錐形瓶9中的蒸餾水就會(huì)從冷凝器下方的導(dǎo)管12倒流到蒸餾瓶的反應(yīng)室1內(nèi)，再倒流至蒸餾瓶的夾層2中，由廢液排出口8排出。按照上述方法將儀器洗滌2～3次。最后，反應(yīng)室1中的余液可以按下法清空：把所有夾子夾緊，將蒸餾瓶夾層2內(nèi)的水煮沸，先移去錐形瓶9，然后移去火源，反應(yīng)室1中余液將倒流至夾層2中，由7排出。以后每次在做下一次蒸餾之前都要先將蒸餾瓶洗滌2～3次，并將反應(yīng)室1清空。b)空白和樣品的蒸餾把裝有5.0mL的2%硼酸溶液的錐形瓶9置于冷凝器的下方，將冷凝器下方的導(dǎo)管12下端插入液面以下，錐形瓶內(nèi)須事先加入指示劑（注意此時(shí)的顏色，它將是后面滴定終點(diǎn)的顏色）。先將克氏燒瓶中消化好了的空白消化液由小漏斗3注入到蒸餾瓶的反應(yīng)室1中，用蒸餾水洗滌克氏燒瓶2次（每次約2mL），洗滌液皆由漏斗3注入反應(yīng)室1。用取樣器取40%氫氧化鈉溶液10mL，注入小漏斗（小漏斗必須始終保持口朝上的狀態(tài)），放松夾子，使其緩緩流入反應(yīng)室1。當(dāng)小漏斗內(nèi)仍有少量NaOH溶液時(shí)，立即夾緊夾子（以上操作勿將NaOH溶液濺到衣物和皮膚上，也不要灑到實(shí)驗(yàn)桌上）。再加約3mL蒸餾水于小漏斗內(nèi)，同樣緩緩放入反應(yīng)室，并留少量水在漏斗內(nèi)作水封。把所有夾子夾緊，打開冷凝水，開始用酒精燈加熱，將蒸餾瓶夾層2內(nèi)的水煮沸。注意，在樣品蒸餾的整個(gè)過程中，要保持火苗的穩(wěn)定，嚴(yán)禁中途移去火源，以防倒吸。從蒸餾瓶內(nèi)的水溶液沸騰開始計(jì)算時(shí)間，大約10min即可蒸餾完畢。將導(dǎo)管12的下端抽出液面，繼續(xù)蒸餾1min，使導(dǎo)管內(nèi)的余液落回錐形瓶9中，移開錐形瓶，用表面皿蓋好等待滴定。移去火源，反應(yīng)室1中的殘液將會(huì)倒流至夾層2中，由8排出。將蒸餾瓶洗滌2～3次，并將反應(yīng)室1清空，按空白蒸餾的方法進(jìn)行樣品蒸餾。改良式微量克氏定氮儀各部示意圖

④.再次將蒸餾瓶洗滌干凈，拆卸克氏定氮儀裝置，清洗所使用過的所有玻璃儀器，清洗取樣器套頭，整理好桌面上的儀器和試劑，并注意清潔自己的操作臺(tái)，請老師驗(yàn)收，實(shí)驗(yàn)報(bào)告當(dāng)場交給老師。計(jì)算樣品含氮量（％）＝0.014×（A-B）×100％A：滴定樣品用去的H