第十一講蛋白質(zhì)的分離與純化二

第十一講蛋白質(zhì)的分離與純化二第1頁，共37頁，2023年，2月20日，星期一一、問答題（每題5分共30分）：蛋白質(zhì)工程的基本途徑或主要步驟什么是構(gòu)型、構(gòu)型，二者的主要差別。Anfinsen原理及其意義。紫外可見吸收光譜和熒光光譜。什么是核磁共振（NMR）？實(shí)現(xiàn)核磁共振的兩種方法是什么？什么是化學(xué)位移？1970年IUPAC規(guī)定，衡量化學(xué)位移的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)是什么？規(guī)定其化學(xué)位移常數(shù)是多少？表示化學(xué)位移物理量的符號(hào)和單位的符號(hào)各是什么？蛋白質(zhì)工程期中考試（20140514）分析第2頁，共37頁，2023年，2月20日，星期一二、簡述題（每題10分共40分）蛋白質(zhì)一級(jí)結(jié)構(gòu)、二級(jí)結(jié)構(gòu)、超二級(jí)結(jié)構(gòu)、結(jié)構(gòu)域和三級(jí)結(jié)構(gòu)及其主要作用力？它們之間的相互關(guān)系怎樣？如何理解蛋白質(zhì)工程的含義（狹義和廣義理解），其主線是什么？什么是基因突變技術(shù)，包括哪兩大類技術(shù)？舉例說明這兩大類技術(shù)包括哪些方法。預(yù)測蛋白質(zhì)三級(jí)結(jié)構(gòu)的方法有哪些？描述一種你熟悉的蛋白質(zhì)高級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測方法的操作流程。第3頁，共37頁，2023年，2月20日，星期一三、方案設(shè)計(jì)（10分） 某種微生物合成的蛋白酶與人體消化液中的蛋白酶的結(jié)構(gòu)和功能很相似，但對(duì)熱穩(wěn)定性較差，進(jìn)入人體后容易失效，現(xiàn)要將此酶開發(fā)成一種片劑，臨床治療消化不良，通過蛋白質(zhì)工程手段能否提高蛋白質(zhì)的穩(wěn)定性，請(qǐng)您試設(shè)計(jì)兩套改造方案，簡述改造方案依據(jù)的原理。提示和要求：一套方案采用分子生物學(xué)修飾，另一套采用化學(xué)修飾。四、論述題（20分）：論述蛋白質(zhì)一級(jí)結(jié)構(gòu)測定的基本程序以及主要方法和原理。第4頁，共37頁，2023年，2月20日，星期一概述常見色譜技術(shù)介紹第四節(jié)精制分離—液相色譜技術(shù)第5頁，共37頁，2023年，2月20日，星期一1、液相色譜（Liquidchromatography）？利用不同物質(zhì)在固定性和流動(dòng)相中的分配特性不同，對(duì)物質(zhì)的分離的技術(shù)。（理解）依據(jù)物質(zhì)的理化特性（如：分子大小、形狀、分子極性、電荷等）不同，在固定性和流動(dòng)相中的分配系數(shù)不同流動(dòng)相為平推流流動(dòng)相流過固定相時(shí)，兩相之間分配平衡很快不同物質(zhì)的流動(dòng)速度不同而實(shí)現(xiàn)分離。又稱為層析（平推流）特點(diǎn)（四高）高效率、高純度、高精度、高自動(dòng)化程度——現(xiàn)代化色譜技術(shù)——高效液相色譜一、概述第6頁，共37頁，2023年，2月20日，星期一1850年，德國化學(xué)家Runge將古羅馬時(shí)期分析染料與色素的方法進(jìn)行改進(jìn)，發(fā)展成為紙色譜。1903年，俄國植物學(xué)家

Tsweet在華沙生物學(xué)會(huì)議上發(fā)表分離植物色素的論文，1906年，Tsweet首次提出“色譜法”和“色譜圖”的概念。 “色譜法”（Chromotography）“色譜圖”（Chromatogram）1941年，英國生物化學(xué)家Martin與英國化學(xué)家Synge（獲諾貝爾獎(jiǎng)）創(chuàng)立液液分配色譜，以水份飽和硅膠為固定相，含乙醇的氯仿為流動(dòng)相分離乙酰氨基酸。1970年中期，微處理機(jī)技術(shù)用于液相色譜，提高了液相色譜的自動(dòng)化水平和分析精度。80年代，色譜聯(lián)用技術(shù)發(fā)展迅速，逐漸出現(xiàn)了色譜—光譜聯(lián)用、色譜—質(zhì)譜聯(lián)用、二維色譜（色譜—色譜）等技術(shù)。1990年以后，生物工程和生命科學(xué)的迅速發(fā)展，為高效液相色譜技術(shù)提出了更多、更新的分離、純化、制備的課題，促進(jìn)了高效液相色譜技術(shù)的發(fā)展。2、液相色譜法的發(fā)展第7頁，共37頁，2023年，2月20日，星期一在色譜技術(shù)中，液相色譜（Liquidchromatography）是最早（1903年）發(fā)明的，但其初期發(fā)展比較慢。液相色譜普及之前，紙色譜、氣相色譜和薄層色譜是色譜分析的主流。20th60S’，將較為成熟的氣相色譜理論與技術(shù)應(yīng)用于液相色譜，使液相色譜迅速發(fā)展。特別是填料（色譜柱）制備技術(shù)、檢測技術(shù)和高壓輸液泵性能的不斷改進(jìn)，使液相色譜分析實(shí)現(xiàn)了高效化和高速化。1969年，液相色譜儀商品化。從此，這種分離效率高、分析速度快的液相色譜被稱為高效液相色譜法（HPLC）更加微量、快速、高效、廣泛。新進(jìn)展：微柱—HPLC、無孔色譜短柱—HPLC、毛細(xì)管—HPLC2、液相色譜的發(fā)展第8頁，共37頁，2023年，2月20日，星期一吸附層析adsorptionchromatography分子篩層析molecularsievechromatography離子交換層析ionexchangechromatography親和層析affinitychromatography分配色譜—液-液色譜疏水色譜—疏水作用等電點(diǎn)聚焦色譜—pI高效液相色譜—高度自動(dòng)化的液相色譜3、液相色譜的類型第9頁，共37頁，2023年，2月20日，星期一1、吸附分離色譜？（1）概念：利用固相吸附劑對(duì)不同物質(zhì)的吸附力不同，進(jìn)行物質(zhì)分離的液相色譜技術(shù)。（2）原理：通過范德華力，流動(dòng)相中的分子與固定相（吸附劑）吸附、再解吸附進(jìn)入流動(dòng)相（洗脫劑）。不同物質(zhì)在固相和液相之間分配系數(shù)或解離平衡不同。通過連續(xù)的吸附—解吸附—再吸附過程將物質(zhì)分離。

二、常見色譜介紹第10頁，共37頁，2023年，2月20日，星期一（3）影響因素？吸附劑、溶劑、被分離物質(zhì)的性質(zhì)“三方面”吸附劑：凡能對(duì)其它物質(zhì)具有吸附作用的固體物質(zhì)。吸附劑選擇原則：根據(jù)：吸附劑性質(zhì)、溶劑的性質(zhì)、被分離對(duì)象的性質(zhì)——選擇。表面積大、顆粒均勻、吸附選擇性好、穩(wěn)定性強(qiáng)、成本低廉。如何理解——選擇原則？（三者之間相互影響關(guān)系）：極性強(qiáng)的吸附劑易吸附極性強(qiáng)的物質(zhì)，非極性強(qiáng)的吸附劑易吸附非極性強(qiáng)的物質(zhì)。為了便于解吸附，對(duì)于極性大的分離物，選擇極性較小的吸附劑，反之亦然。極性吸附劑、分離弱極性物質(zhì)、弱極性溶劑洗脫；分離強(qiáng)極性物質(zhì)、用強(qiáng)極性溶劑理想吸附劑和溶劑的選擇：依據(jù)原則，依靠經(jīng)驗(yàn)和多次試驗(yàn)。常用吸附劑：硅膠、氧化鋁、活性炭、硅酸鎂、聚酰胺、硅藻土、羥基磷灰石等硅膠的硅醇基（分離中性和酸性成分）氧化鋁：多孔Al2O3，分三種：酸性氧化鋁、中性氧化鋁、堿性氧化鋁活性炭：非極性吸附劑、常用于脫色和脫臭等吸附過程第11頁，共37頁，2023年，2月20日，星期一層析方式（2種）：

柱層析：羥基磷灰石（HA），[Ca3(PO4)3OH2]，酸性蛋白質(zhì)、酶、核酸、病毒等生命大分子。硅膠：含硅醇基團(tuán)（-Si-OH），氨基酸、甾體激素、皂苷類、類脂和色素等等。（分離并洗脫）薄層層析：（只分離不洗脫），例如：硅膠薄層層析和聚酰胺薄膜薄層層析

硅膠薄層層析：硅膠板分類（4類），硅膠H（純硅膠），能用腐蝕性強(qiáng)的顯色劑；硅膠G（10%-15%煅石膏和5%淀粉的硅膠）；硅膠CMC（含羧甲基纖維素）；硅膠HF254(含熒光劑的硅膠H)。

硅膠板的制備：玻璃板，硅膠制備（加溶劑碾磨），鋪板，活化和合格檢查：約1mg蘇丹黃、蘇丹紅和靛酚藍(lán)混合物乙酸乙酯溶液點(diǎn)樣，苯：展層劑，Rf：蘇丹黃>蘇丹紅>靛酚藍(lán)，蘇丹黃Rf約0.5，蘇丹紅和靛酚藍(lán)Rf之差在0.1—0.2。分析程序：點(diǎn)樣，展層，顯色。第12頁，共37頁，2023年，2月20日，星期一聚酰胺薄膜薄層層析：如：DNS—氨基酸分析，DNS-Cl（二甲氨基萘磺酰氯），靈敏度10-9—10-10mol/L。DNS-Cl和氨基酸或多肽在特定條件下反應(yīng)。DABTH-氨基酸的薄層層析分析蛋白質(zhì)序列。Edman降解試劑DABITC（4-N,N-二甲氨基偶氮苯-4’-異硫氰酸酯）進(jìn)行微量蛋白質(zhì)序列分析（2—10nmol肽樣品）。第13頁，共37頁，2023年，2月20日，星期一單向紙層析第14頁，共37頁，2023年，2月20日，星期一雙向紙層析第15頁，共37頁，2023年，2月20日，星期一薄層層析硅膠G板薄層層析第16頁，共37頁，2023年，2月20日，星期一2、凝膠色譜：凝膠過濾、排阻色譜或分子篩層析 以具有篩孔的介質(zhì)為固定相，依據(jù)分子大小進(jìn)行物質(zhì)分離的液相色譜技術(shù)。原理：分子在固相篩孔中自由擴(kuò)散、滲透，不同尺寸的分子在篩孔中的分配系數(shù)不同，導(dǎo)致分子流動(dòng)速度不同。流動(dòng)相流動(dòng)過程中，物質(zhì)在凝膠內(nèi)和凝膠外很快達(dá)到分配平衡。分子量大，排阻大，分子量小，排阻小，物質(zhì)按分子量的大小流出分離柱。分子排阻范圍為：0~100%。（排阻率為0和100的物質(zhì)不能分離。Why？）如何理解？第17頁，共37頁，2023年，2月20日，星期一凝膠色譜示意圖分配系數(shù)（Kav

）：分離組分在凝膠內(nèi)水和外水體積中的比例關(guān)系。

Kav=(Ve-V0)/ViVt=Vo+Vi+Vg，

Vt、Vo、Vi和Vg分別為：床體積、外水體積、內(nèi)水體積和介質(zhì)的體積。

Ve：分離組分流出的體積。分離物質(zhì)的大小，0<Kav<1，Kav=0或Kav=1，不能分離。第18頁，共37頁，2023年，2月20日，星期一凝膠種類和性質(zhì)：種類：浮石、瓊脂、瓊脂糖、聚乙烯醇、聚丙烯酰胺、葡聚糖凝膠等：常用種類和商品名稱（根據(jù)分類對(duì)象選擇凝膠材料）交聯(lián)葡聚糖（SephadexG10—G200）；AmershamBiosciences交聯(lián)瓊脂糖（SepharoseCL-4B,CL-6B）SephacrylS系列（聚丙烯酰胺-葡聚糖）Superdes系列（高交聯(lián)瓊脂糖-葡聚糖）Bio-BeadsS-X系列（苯乙烯-二乙烯苯）Bio-GelP系列（聚丙烯酰胺）Bio-RadBio-GelA系列（瓊脂糖）TSKgelSW系列（硅膠）TSKgelToyopearlHW系列，親水性聚乙烯醇ToyoSodaTSKgelPW系列親水性聚乙烯TSKgelCW-35纖維素Cellulofine纖維素Chisso第19頁，共37頁，2023年，2月20日，星期一操作程序：凝膠選擇和處理（型號(hào)和粒度、凝膠用量、凝膠處理）凝膠柱的制備（柱選擇：徑長比約為：1:25—1:100，裝柱、柱鑒定）平衡層析柱加樣和洗脫（加樣、洗脫、樣品收集，檢測）凝膠柱的再生和保存應(yīng)用：分離純化、脫鹽和濃縮、去熱源物質(zhì)分析檢測（定性、定量、分子量）。Kav=-blgMr+c第20頁，共37頁，2023年，2月20日，星期一（3）離子交換色譜：理解：依據(jù)電荷大小進(jìn)行物質(zhì)分離的液相色譜技術(shù)。原理：固相介質(zhì)上結(jié)合有一定的離子基團(tuán)。結(jié)合陽離子基團(tuán)，稱陰離子交換劑，其反離子為陰離子（如：Cl-）。在適當(dāng)?shù)臈l件下，反離子與分離物中的陰離子交換。在不同鹽濃度或pH值下，將帶不同電荷的物質(zhì)洗脫下來。洗脫方式：洗脫劑分類：鹽梯度洗脫；pH梯度洗脫。洗脫梯度分類：連續(xù)梯度；不連續(xù)梯度。第21頁，共37頁，2023年，2月20日，星期一離子交換劑分類（2種）交換劑分類I（根據(jù)交換劑所帶電荷：2大類）陽離子交換劑：交聯(lián)陰離子基團(tuán)，與陽離子交換。如：羧甲基（-O-CH2-COO-）陰離子交換劑：交聯(lián)陽離子基團(tuán)，與陰離子交換。如：氨基乙基（-O(CH2)2-NH3+）交換劑分類II（根據(jù)基質(zhì)的組成和性質(zhì)：2大類）疏水性離子交換劑（親水性較小的合成樹脂，如苯乙烯與二乙烯苯的聚合物）陽離子交換劑—帶負(fù)電荷，電荷強(qiáng)弱（強(qiáng)酸型、中強(qiáng)型和弱酸型），反離子為正電荷離子陰離子交換劑—帶正電荷，電荷強(qiáng)弱（強(qiáng)陰性、中陰性和弱陰性），反離子為負(fù)電荷離子螯合離子交換劑—具有絡(luò)合一些金屬離子、排斥另外一些離子的能力，選擇性更高親水性離子交換劑（親水性較大的合成物質(zhì)，纖維素、葡聚糖、交聯(lián)瓊脂糖等）陽離子交換劑陰離子交換劑第22頁，共37頁，2023年，2月20日，星期一常用固定相介質(zhì)DEAE（二乙基胺基乙基）—CelluloseDE-32DEAE—CelluloseDE-52DEAE-SephadexA-50（25）DEAE-SepharosCL-6bDEAE-Bio-GelACM（羧甲基）-CelluloseDE-52CM-CelluloseCM-SephadexC-25(50)離子交換劑的選擇依據(jù)物質(zhì)在溶液中的電荷性質(zhì)物質(zhì)的吸附特性（疏水、親水）實(shí)踐和經(jīng)驗(yàn)蛋白質(zhì)分離第23頁，共37頁，2023年，2月20日，星期一

離子交換色譜操作程序

洗脫方式：梯度洗脫——連續(xù)梯度和非連續(xù)梯度洗脫應(yīng)用：物質(zhì)分離、測定等電點(diǎn)（PI）凝膠預(yù)處理裝住平衡上樣洗脫再生第24頁，共37頁，2023年，2月20日，星期一（4）親和層析 利用分子間特異性可逆結(jié)合對(duì)物質(zhì)進(jìn)行特異性分離的液相色譜技術(shù)。原理：具有特異性親和力的兩個(gè)分子中，一個(gè)固定在不溶性的基質(zhì)上，對(duì)另一個(gè)分子進(jìn)行分離。（次級(jí)作用力相互作用的分子）固定在基質(zhì)上的分子稱配體，共價(jià)鍵與基質(zhì)相連，構(gòu)成固定相。流動(dòng)相中的分子被特異性地與固定相吸附，使物質(zhì)彼此分離。如：酶—抑制劑、抗原—抗體、A蛋白—Ag、配體—配基、過渡金屬離子（Cu、Ni、Zn、Co等）與O、S、N等供電子基團(tuán)形成配位鍵，可與蛋白質(zhì)表面組氨酸的咪唑基、半胱氨酸的巰基、色氨酸的吲哚基發(fā)生親和作用。如Ni柱分離帶有組氨酸標(biāo)簽的工程蛋白。操作程序：制備固相吸附劑（選擇凝膠、專一性合成、分析鑒定）→裝柱→平衡→上樣吸附→清洗→解析分離→柱再生→平衡解析劑：低pH、高鹽、競爭性洗脫劑、鹽酸胍、尿素等變性劑等。（次級(jí)鍵）柱再生：高濃度鹽、尿素等溶液等應(yīng)用：物質(zhì)分離、測定活性第25頁，共37頁，2023年，2月20日，星期一親和層析原理和程序——理解第26頁，共37頁，2023年，2月20日，星期一（5）疏水性相互作用色譜

利用疏水作用將不同物質(zhì)分離的液相色譜技術(shù)。原理：利用表面偶聯(lián)疏水性基團(tuán)的基質(zhì)作為固相疏水吸附劑，流動(dòng)相中蛋白質(zhì)等大分子組分與疏水固定相發(fā)生疏水作用，依據(jù)分離物組分與固相吸附劑疏水作用的差異。分離物質(zhì)按疏水作用由小到大的順序分離開來。特點(diǎn)：疏水吸附劑：含有苯基、辛基、丁基、醚基等疏水基團(tuán)。高鹽溶液中，蛋白吸附能力強(qiáng)，高鹽上樣，降低鹽度將蛋白洗脫分離。成本高，僅用于實(shí)驗(yàn)室小規(guī)模分離。第27頁，共37頁，2023年，2月20日，星期一（6）反向色譜：利用表面非極性的基質(zhì)為固定相，極性有機(jī)溶劑（包括水）為流動(dòng)相，進(jìn)行物質(zhì)分離的色譜技術(shù)。特點(diǎn)：固定相表面完全被非極性基團(tuán)覆蓋，具有強(qiáng)的疏水性。固定相吸附劑：如：以硅膠為載體，硅烷化連接C4、C8、C18烷基或苯基。 典型代表：反相C18柱—常用C18硅烷化的硅膠為吸附劑，極性很小。極性流動(dòng)相：其典型代表：甲醇和乙腈。類別：制備型色譜和分析型色譜應(yīng)用：物質(zhì)的分離和檢測（定性和定量分析）當(dāng)今液相色譜最主流的分離模式適于所有能夠溶于極性或弱極性溶劑中的有機(jī)物質(zhì)的分離。第28頁，共37頁，2023年，2月20日，星期一（7）分配色譜（也稱液—液色譜）

利用分離組分在固定相與流動(dòng)相之間溶解度的差異來實(shí)現(xiàn)分離的色譜技術(shù)。原理：分配色譜的固定相是液相溶劑，依靠圖布、鍵合、吸附等手段分布于色譜柱或者載體表面。本質(zhì)上是組分分子在固定相和流動(dòng)相之間不斷達(dá)到溶解平衡的過程。依據(jù)溶解度的不同，將組分分離。分類：正相色譜（normalphase）：是由極性固定相和非極性（或弱極性）流動(dòng)相所組成的液相色譜體系。吸附色譜也屬正相色譜。

極性鍵合固定相：

鍵合具有二醇基、醚基、氰基、氨基等極性基團(tuán)分子的載體。反相色譜（reversedphase）：

由非極性固定相和極性流動(dòng)相所組成的液相色譜體系，與正相體系的極性正好相反。非極性鍵合固定相：鍵合烷基、苯基等非極性有機(jī)分子。第29頁，共37頁，2023年，2月20日，星期一（8）高效液相色譜

高效液相色譜是色譜的一個(gè)重要分支，以液體為流動(dòng)相，采用高壓輸液系統(tǒng)，將不同極性的單一溶劑或不同比例的混合溶劑或緩沖液等流動(dòng)相泵入裝有固定相的色譜柱，在層析柱內(nèi)各組分彼此分離，依次進(jìn)入檢測器進(jìn)行檢測，從而實(shí)現(xiàn)對(duì)試樣進(jìn)行分析和制備的色譜技術(shù)。特點(diǎn)：高柱效、高精度、高靈敏度（微量）、高分辨率

——快速全自動(dòng)分析第30頁，共37頁，2023年，2月20日，星期一

主要由4部分組成：高壓輸液系統(tǒng)、進(jìn)樣系統(tǒng)、分離系統(tǒng)（主體）和檢測系統(tǒng)。其它輔助裝置：如梯度洗脫，脫氣、自動(dòng)進(jìn)樣及數(shù)據(jù)處理等。根據(jù)色譜柱和分離的原理不同，高效液相色譜分為多種類型（8.1）液相色譜儀組成高效液相色譜儀的結(jié)構(gòu)示意圖

排阻色譜離子交換色譜吸附層析親和層析分配色譜疏水色譜

反向色譜聚焦色譜1234第31頁，共37頁，2023年，2月20日，星期一

工作流程：高壓泵將貯液器中流動(dòng)相溶劑經(jīng)過進(jìn)樣器送入色譜柱，通過檢測器的出口流出，注入欲分離樣品，流動(dòng)相將樣品貯液器（上樣環(huán)）的樣品帶入色譜柱進(jìn)行分離，分離組分依先后順序進(jìn)入檢測器，記錄儀將檢測器送出的信號(hào)記錄下來，由此得到液相色譜圖。8.2液相色譜儀工作流程光合細(xì)菌色素HPLC分析HPLC（USA，Angilent1100）上樣操作流程第32頁，共37頁，2023年，2月20日，星期一小結(jié)：要求掌握液相色譜概念、原理和基本操作流程高效液相色譜的原理和操作流程

排阻色譜離子交換色譜吸附層析親和層析

分配色譜疏水色譜反向色譜聚焦色譜第33頁，共37頁，2023年，2月20日，星期一1、純化方案的設(shè)計(jì)（1）目的：從混合組分中提取純化目的組分，設(shè)計(jì)方案，指導(dǎo)分離過程進(jìn)行。（2）依據(jù)：分離物質(zhì)的性質(zhì)和特點(diǎn)，結(jié)合分離純化方法的特點(diǎn)，對(duì)分離方法進(jìn)行比較分析，選擇出一種或幾種方法的組合。（3）原則：各種分離方法各有特色，操作程序簡繁不一；考慮分離對(duì)象的特性和結(jié)構(gòu)，以及取材的特點(diǎn)；分離方案不是僵化的，在實(shí)驗(yàn)中，對(duì)方案進(jìn)行不斷修正、調(diào)節(jié)、完善