2015年-4多重序列比對(duì)與Clustal應(yīng)用

2015年-4多重序列比對(duì)與Clustal應(yīng)用第一頁，共87頁。目錄多重序列方法基礎(chǔ)ClastalX應(yīng)用序列拼接與Bioedit應(yīng)用附：引物設(shè)計(jì)——PrimerPremier5.0軟件使用2023/4/152第二頁，共87頁。目的：發(fā)現(xiàn)多個(gè)序列的共性發(fā)現(xiàn)與結(jié)構(gòu)和功能相關(guān)的保守序列片段計(jì)算目標(biāo)：通過對(duì)多個(gè)序列的編輯處理，得到一個(gè)得分最高（或代價(jià)最?。┑男蛄袑?duì)比排列，從而分析各序列之間的相似性和差異。計(jì)算思路：在兩兩比對(duì)的基礎(chǔ)上逐步優(yōu)化多序列比對(duì)第一節(jié)多重序列比對(duì)方法2023/4/153第三頁，共87頁。有k個(gè)序列s1,s2,...,sk，每個(gè)序列由同一個(gè)字母表中的字符組成，k>2。通過插入空位操作，使得各序列達(dá)到一樣的長度。1、多重序列的編輯操作2023/4/154第四頁，共87頁。二重比對(duì)打分函數(shù)：

p(a,a)=1p(a,b)=0ab p(a,-)=p(-,b)=-1

多重比對(duì)的打分函數(shù)：p(a1,a2,…,ak)=?期望： 函數(shù)在形式上應(yīng)該簡單 具有統(tǒng)一的形式 不隨序列的個(gè)數(shù)而發(fā)生形式變化2、多重序列比對(duì)的打分函數(shù)s=AGCACACAt=ACACACTA2023/4/155第五頁，共87頁。SP評(píng)價(jià)模型－得分函數(shù)

（Sum-of-Pairs逐對(duì)加和）按照每個(gè)比對(duì)的列進(jìn)行打分，然后加和2023/4/156第六頁，共87頁。按照每個(gè)比對(duì)的列進(jìn)行打分，然后加和SP評(píng)價(jià)模型－得分函數(shù)

（Sum-of-Pairs逐對(duì)加和）逐對(duì)計(jì)算p(1,2)，p(1,3)，...，p(1,8)，p(2,3)，p(2,4)，...，p(2,8)，...，p(7,8)的所有得分-6-6-5-4-2-2-1=-26

p(a,a)=0;p(-,-)=0Others=-1得分函數(shù)：2023/4/157第七頁，共87頁。其中，c1,c2,…,ck是一列中的k個(gè)字符，

p是關(guān)于一對(duì)字符相似性的打分函數(shù)。逐對(duì)加和SP（sum-of-pairs）函數(shù)

2023/4/158第八頁，共87頁。另一種計(jì)算方式：先處理每一個(gè)序列對(duì) 在處理序列對(duì)時(shí)，逐個(gè)計(jì)算字符對(duì)，最后加和則SP得分模型的計(jì)算公式如下：是一個(gè)多重比對(duì)ij是由推演出來的序列si

和sj的兩兩比對(duì)注意：并非序列si

和sj的最優(yōu)比對(duì)2023/4/159第九頁，共87頁。3、多重比對(duì)的動(dòng)態(tài)規(guī)劃算法

回顧：二重比對(duì)動(dòng)態(tài)規(guī)劃算法tsACACACTA0-1-2-3-4-5-6-7-8A-110-1-2-3-4-5-6G-2010-1-2-3-4-5C-3-11110-1-2-3A-4-2021210-1C-5-3-1132321A-6-4-2024333C-7-5-3-113543A-8-6-4-2024552023/4/1510第十頁，共87頁。三重序列的比對(duì)VSN-S-SNA----AS2023/4/1511第十一頁，共87頁。Si,jSi,j-1Si-1,jSi-1,j-1

二重序列比對(duì)的矩陣元素算法三個(gè)前趨點(diǎn)當(dāng)前點(diǎn)2023/4/1512第十二頁，共87頁。

前趨節(jié)點(diǎn)的個(gè)數(shù)等于2k-1當(dāng)前點(diǎn)：(1,1,1)前趨點(diǎn)：(0,0,0)(0,0,1)(0,1,0)(1,0,0)(0,1,1)(1,0,1)(1,1,0)2023/4/1513第十三頁，共87頁。對(duì)于k個(gè)序列的比對(duì)，則構(gòu)成K維超晶格假設(shè)以k維數(shù)組A存放超晶格，則計(jì)算過程如下：

a[0,0,…,0]=0a[i]=max{a[i-b]+SP-score(Column(s,i,b))}ifbj=1ifbj=0其中：i表示當(dāng)前點(diǎn)

b表示與i的距離2023/4/1514第十四頁，共87頁。問題： 計(jì)算量巨大 時(shí)間復(fù)雜度為O(2ki=1,...,k

si)

↓ O(2kNk)2023/4/1515第十五頁，共87頁。4、多重序列比對(duì)的簡化方法星形比對(duì)在給定的若干序列中，選擇一個(gè)核心序列，通過該序列與其它序列的兩兩比對(duì)形成所有序列的多重比對(duì)。樹形比對(duì)k個(gè)待比對(duì)的序列→具有k個(gè)葉節(jié)點(diǎn)的樹，每個(gè)葉節(jié)點(diǎn)對(duì)應(yīng)一個(gè)序列多重序列比對(duì) →兩兩序列比對(duì) →合并兩個(gè)比對(duì)（比對(duì)的比對(duì)）DoCompleteAlignment (Clustal、Bioedit)2023/4/1516第十六頁，共87頁。目前使用最廣泛的多重序列比對(duì)程序是ClustalW、ClustalXCLUSTAL網(wǎng)址ClustalW2(retired)

ClustalOmegaClustal計(jì)算步驟：輸入多個(gè)序列>>>快速的序列兩兩比對(duì)，計(jì)算序列間的距離，獲得一個(gè)距離矩陣。>>>鄰接法(NJ)構(gòu)建一個(gè)樹（引導(dǎo)樹）>>>根據(jù)引導(dǎo)樹，漸進(jìn)比對(duì)多個(gè)序列2023/4/1517第十七頁，共87頁。EBIMultipleSequenceAlignment2023/4/1518第十八頁，共87頁。第二節(jié)ClustalX2.0使用2023/4/1519第十九頁，共87頁?？梢暂敵鰹?ps格式以便于后期編輯不支持中文路徑2023/4/1520第二十頁，共87頁。比對(duì)菜單完全比對(duì)：先兩兩比對(duì)，根據(jù)距離生成向?qū)洌缓蠛喜⒈葘?duì)選擇部分序列進(jìn)行比對(duì)2023/4/1521第二十一頁，共87頁。完全比對(duì)結(jié)果一致性比例2023/4/1522第二十二頁，共87頁。參數(shù)設(shè)置菜單2023/4/1523第二十三頁，共87頁。多重比對(duì)參數(shù)設(shè)置2023/4/1524第二十四頁，共87頁。輸出設(shè)置2023/4/1525第二十五頁，共87頁。比對(duì)質(zhì)量信息顯示低分值片段；顯示特殊殘基；2023/4/1526第二十六頁，共87頁。Clustal的Profile比對(duì)模式2023/4/1527第二十七頁，共87頁。Profile比對(duì)結(jié)果2023/4/1528第二十八頁，共87頁。Profile比對(duì)應(yīng)用例：結(jié)構(gòu)比對(duì)的保守模式與序列比對(duì)的保守模式進(jìn)行比較2023/4/1529第二十九頁，共87頁?；蚪M測(cè)序策略（1）鳥槍法

直接從已測(cè)序的小片段中尋找彼此重疊的測(cè)序克隆，然后依次向兩側(cè)鄰接的序列延伸.ABCABCABCABC小片段測(cè)序計(jì)算機(jī)拼裝第三節(jié)序列組裝及Bioedit應(yīng)用2023/4/1530第三十頁，共87頁。

先將染色體打成比較大的片段(幾十-幾百Kb),利用分子標(biāo)記將這些大片段排成重疊的克隆群(Contig),分別測(cè)序后拼裝.這種策略叫基于克隆群(contig-based)的策略.ABCABC大片段contig小片段測(cè)序拼裝基因組測(cè)序策略（2）克隆法2023/4/1531第三十一頁，共87頁?；蚪M測(cè)序的最終環(huán)節(jié)－序列組裝（Assembly）方法：含有相同序列的短序列能相互重疊，按重疊序列將片段連接可以形成更大的疊連群（Contig）。2023/4/1532第三十二頁，共87頁。

定義： 給定一組取自特定字母表的字符串集合F，尋找一個(gè)最短的字符串s，使得F中的每一個(gè)字符串都是s的一個(gè)連續(xù)子串。這里，集合F的字符串相當(dāng)于待組裝的序列片段，而s則是序列片段組裝的結(jié)果。

Input

AnswerACCGT--ACCGT--CGTGC----CGTGCTTACTTAC-----TACCGT-TACCGT-- TTACCGTGC多重比對(duì)1、片段組裝問題實(shí)質(zhì)－多重序列比對(duì)2023/4/1533第三十三頁，共87頁。（1）堿基錯(cuò)誤

Input

AnswerACCGT--ACCGT--CGTGC----CGTGCTTACTTAC-----TGCCGT-TGCCGT-- TTACCGTGC2、片段組裝需要考慮的問題2023/4/1534第三十四頁，共87頁。（2）不知道片段的方向

2023/4/1535第三十五頁，共87頁。（3）存在重復(fù)區(qū)域2023/4/1536第三十六頁，共87頁。（4）缺少覆蓋

連續(xù)疊連群目標(biāo)DNA片段不連續(xù)區(qū)域

連續(xù)疊連群2023/4/1537第三十七頁，共87頁。如果一個(gè)多重比對(duì)的最弱連接的交疊長度至少為t，稱這個(gè)多重序列比對(duì)是t-contig。如果能夠根據(jù)序列片段集合F構(gòu)造一個(gè)t-contig，稱F允許一個(gè)t-contig。多重連續(xù)區(qū)模型：給定一個(gè)片段集合F和一個(gè)整數(shù)t（0），將F分割為最小數(shù)目的子集Ci，1ik，每個(gè)Ci允許一個(gè)t-contig。

目標(biāo)序列序列碎片不連續(xù)區(qū)域最小重疊區(qū)：t-contig2023/4/1538第三十八頁，共87頁。

設(shè)F={GTAC，TAATG，TGTAA}

(a)t=3;(b)t=2;(c)t=12023/4/1539第三十九頁，共87頁。設(shè)f=GCGATAG,g=CAGTCGCTGATCGTACG,

則最佳的子序列比對(duì)如下

-----GC-GATAG---- CAGTCGCTGATCGTACG設(shè)是一個(gè)介于0和1之間的數(shù)，稱串f是在誤差下S的近似子串，如果

ds(f,S)

f

重建模型：給定一個(gè)字符串集合F，構(gòu)造一個(gè)t-contig，并求一個(gè)最短的字符串S，使得對(duì)于所有屬于F的字符串f，下式成立：

min(ds(f,S),ds(f’,S))

f

其中f’

是f的反向互補(bǔ)串。3、序列組裝的計(jì)算模型2023/4/1540第四十頁，共87頁。實(shí)例：利用Bioedit進(jìn)行序列組裝Homosapienschromosome3cloneRP11-588H7map3p,completesequence

原始序列1cgcggaattctaatgccatctgctggatacactggtacaagacaggcccgtgtcacagta61agactgtgatggtgtgtcaatactcaaagaactggatctgaaacagaaaagggctcacaa121aacactgaactaaattatactgttaagagg2023/4/1541第四十一頁，共87頁。假定測(cè)序結(jié)果（構(gòu)造三個(gè)序列）>seq1cgcggaattctaatgccatctgctggatacactggtacaagacaggcccgtgtcacagtaagactgtgatggtgtgtcaatactcaaagaactggatctgaaacagaaaagggctcacaa>seq2taatgccatctgctggatacactggtacaagacaggcccgtgtcacagtaagactgtgatggtgtgtcaatactcaaagaactggatctgaaacagaaaagggctcacaaAacactgaac>seq3actggtacaagacaggcccgtgtcacagtaagactgtgatggtgtgtcaatactcaaagaactggatctgaaacagaaaagggctcacaaaacactgaactaaattatactgttaagagg2023/4/1542第四十二頁，共87頁?！癇ioedit軟件拼接結(jié)果”2023/4/1543第四十三頁，共87頁。CAP3序列拼接程序

2023/4/1544第四十四頁，共87頁。Bioedit基本應(yīng)用利用Bioedit分析pUC19質(zhì)粒（登錄號(hào)：L09137，下載保存）Bioedit的其它應(yīng)用2023/4/1545第四十五頁，共87頁。用Bioedit打開文件“L09137.fasta”序列名稱序列內(nèi)容2023/4/1546第四十六頁，共87頁。序列基本信息的統(tǒng)計(jì)分析2023/4/1547第四十七頁，共87頁。基本信息，包括“ATCG”含量2023/4/1548第四十八頁，共87頁。生成質(zhì)粒圖…2023/4/1549第四十九頁，共87頁。生成的質(zhì)粒圖2023/4/1550第五十頁，共87頁。給質(zhì)粒改名“pUC19c”雙擊2023/4/1551第五十一頁，共87頁?！皃UC19C”質(zhì)粒2023/4/1552第五十二頁，共87頁。增加質(zhì)粒特征和酶切位點(diǎn)……

PARENTFeaturesofpUC19c(2686bp)residuesource1-1372074-2210pBR322138-2372252-2351pBR322238-3951461-1304(c)Lac-Operon396-45257-1(c)polylinkerofM13mp19455-6821298-1071(c)Lac-Operon683-26862352-4355pBR322Conflict(cfl)andMutations(mut):pUC19csourcemut1308AG2977pBR322linkedtoincreasedcopynumbermut1942AG3611pBR322mut2243TC3912pBR322FEATURE1629-2417789-1(c)Ap-R;b-lactamasePOLYLINKERHindIII-SphI-PstI-SalI-XbaI-BamHI-SmaI-KpnI-SacI-EcoRI在L09137中有對(duì)序列特征的描述：2023/4/1553第五十三頁，共87頁。插入特征2023/4/1554第五十四頁，共87頁。插入lacZα2023/4/1555第五十五頁，共87頁。通過“addfeatures”插入多克隆位點(diǎn)（396-452）2023/4/1556第五十六頁，共87頁。標(biāo)注限制性酶切位點(diǎn)2023/4/1557第五十七頁，共87頁。2023/4/1558第五十八頁，共87頁。附：引物設(shè)計(jì)——PrimerPremier5.0軟件使用

引物是人工合成的兩段寡核苷酸序列，一個(gè)引物與感興趣區(qū)域一端的一條DNA模板鏈互補(bǔ)，另一個(gè)引物與感興趣區(qū)域另一端的另一條DNA模板鏈互補(bǔ)?！?’3’5’5’SenseprimerAntisenseprimer2023/4/1559第五十九頁，共87頁。引物的重要性在整個(gè)PCR體系中,引物占有十分重要的地位。PCR的特異性要求引物與靶DNA特異結(jié)合，不與其他非目的DNA結(jié)合，PCR的靈敏性要求DNA聚合酶能對(duì)引物進(jìn)行有效的延伸，可見引物設(shè)計(jì)好壞與PCR結(jié)果密切相關(guān)。2023/4/1560第六十頁，共87頁。引物設(shè)計(jì)原則引物長度堿基分布的均衡性Tm值引物二級(jí)結(jié)構(gòu)引物3’端引物5’端引物的內(nèi)部穩(wěn)定性引物的保守性與特異性擴(kuò)增區(qū)域的二級(jí)結(jié)構(gòu)2023/4/1561第六十一頁，共87頁。引物長度一般為15-30個(gè)核苷酸，在做長片段PCR或做某些特殊的PCR時(shí)應(yīng)使用較長的引物，但最多不超過50個(gè)核苷酸。2023/4/1562第六十二頁，共87頁。堿基分布的均衡性同一堿基連續(xù)出現(xiàn)不應(yīng)超過5個(gè)GC含量一般40-60%GC含量太低導(dǎo)致引物Tm值較低，使用較低的退火溫度不利于提高PCR的特異性GC含量太高也易于引發(fā)非特異擴(kuò)增。2023/4/1563第六十三頁，共87頁。引物Tm值一般要求：55℃-65℃。計(jì)算：對(duì)于低于20個(gè)堿基的引物，Tm值可根據(jù)Tm=4(G+C)+2(A+T)來粗略估算對(duì)于較長引物，Tm值則需要考慮熱動(dòng)力學(xué)參數(shù)，從“最近鄰位”的計(jì)算方式得到，這也是現(xiàn)有的引物設(shè)計(jì)軟件最常用的計(jì)算方式。Tm=△H/(△S+R*ln(C/4))+16.6log([K+]/(1+0.7[K+]))-273.15

2023/4/1564第六十四頁，共87頁。引物二級(jí)結(jié)構(gòu)引物二聚體盡可能避免兩個(gè)引物分子之間3’端有較多堿基互補(bǔ)發(fā)夾結(jié)構(gòu)尤其是要避免引物3’端形成發(fā)夾結(jié)構(gòu)，否則將嚴(yán)重影響DNA聚合酶的延伸。2023/4/1565第六十五頁，共87頁。引物3’端引物的延伸從3’端開始，因此3’端的幾個(gè)堿基與模板DNA均需嚴(yán)格配對(duì)，不能進(jìn)行任何修飾，否則不能進(jìn)行有效的延伸，甚至導(dǎo)致PCR擴(kuò)增完全失敗?？紤]到密碼子的簡并性，引物3’端最后一個(gè)堿基最好不與密碼子第三個(gè)堿基配對(duì)。2023/4/1566第六十六頁，共87頁。引物5’端引物5’端可以有與模板DNA不配對(duì)堿基，在5’端引入一段非模板依賴性序列。5’端加上限制性核酸內(nèi)切酶位點(diǎn)序列（酶切位點(diǎn)5’端加上適當(dāng)數(shù)量的保護(hù)堿基）。5’端的某一位點(diǎn)修改某個(gè)堿基，人為地在產(chǎn)物中引入該位點(diǎn)的點(diǎn)突變以作研究。5’端標(biāo)記放射性元素或非放射性物質(zhì)（如生物素、地高辛等）。2023/4/1567第六十七頁，共87頁。

引物的內(nèi)部穩(wěn)定性過去認(rèn)為，引物3’端應(yīng)牢牢結(jié)合在模板上才能有效地進(jìn)行延伸，故3’端最好為G或C。現(xiàn)在的觀點(diǎn)認(rèn)為，引物的5’端應(yīng)是相對(duì)穩(wěn)定結(jié)構(gòu)，而3’端在堿基配對(duì)的情況下最好為低穩(wěn)定性結(jié)構(gòu)，即3’端盡可能選用A或T，少用G或C。僅僅3’端幾個(gè)堿基與非特異位點(diǎn)上的堿基形成的低穩(wěn)定性結(jié)構(gòu)是難以有效引發(fā)引物延伸的。如果3’端為富含G、C的結(jié)構(gòu)，只需3’端幾個(gè)堿基與模板互補(bǔ)結(jié)合，就可能引發(fā)延伸，造成假引發(fā)。2023/4/1568第六十八頁，共87頁。引物的保守性與特異性保守性：通用引物——檢測(cè)同一類病原微生物盡可能多的型別特異性：避免非特異性擴(kuò)增2023/4/1569第六十九頁，共87頁。擴(kuò)增區(qū)域的二級(jí)結(jié)構(gòu)模板DNA的某些區(qū)域具有高度復(fù)雜的二級(jí)結(jié)構(gòu)，在選擇引物時(shí)，應(yīng)使擴(kuò)增區(qū)域盡可能避開這些區(qū)域。擴(kuò)增區(qū)域的自由能（△G0）小于58.61kJ/mol引物Tm值與PCR產(chǎn)物Tm值相差一般不超過30℃Tmproduct=81.5+16.6log([K+]/(1+0.7[K+]))+0.41(%G+%C)-500/length2023/4/1570第七十頁，共87頁。引物與PCR引物濃度：一般為0.1-0.5umol/L引物濃度(uM)=nOD×33/（A×312＋C×288＋G×328＋T×303-61）/VH2OVH2O(單位：L)退火溫度最適退火溫度（TaOpt）=0.3×(Tmofprimer)+0.7×(Tmofproduct)–25一般采用較引物Tm值低5℃作為PCR退火溫度。2023/4/1571第七十一頁，共87頁。引物設(shè)計(jì)軟件PrimerPremier5.0Oligoprimer3ThePrimerGeneratorNetPrimer2023/4/1572第七十二頁，共87頁。簡并引物設(shè)計(jì)根據(jù)氨基酸序列來設(shè)計(jì)引物DNA引物

PremierPrimer5提供了8種生物遺傳密碼使用的偏好選擇1、纖毛蟲大核（CiliateMacronuclear）2、無脊椎動(dòng)物線粒體（InvertebrateMitochondrion）3、支原體（Mycoplasma）4、植物線粒體（PlantMitochondrion）5、原生動(dòng)物線粒體（ProtozoanMitochondrion）6、一般標(biāo)準(zhǔn)（Standard）7、脊椎動(dòng)物線粒體（VertebrateMitochondrion）8、酵母線粒體（YeastMitochondrion）2023/4/1573第七十三頁，共87頁。PrimerPremier5.0使用介紹(1)PreimerPremier啟動(dòng)界面Loadsequence2023/4/1574第七十四頁，共87頁?；拘畔equencenameOriginalsequenceUsethesetwobuttontotranslatetheDNAseqtoaproteinseqoraproteinseqtoaDANseq8種密碼子偏好Chooseafunction2023/4/1575第七十五頁，共87頁。引物設(shè)計(jì)界面FirstyoucandesigntheprimermanuallySensestrandoranti-sensestrandUsefulinformationoftheprimer2023/4/1576第七十六頁，共87頁。引物搜索選項(xiàng)設(shè)定引物類型搜索模式5’引物位置范圍3’引物位置范圍產(chǎn)物大小范圍引物長度2023/4/1577第七十七頁，共87頁。搜索結(jié)果28對(duì)引物引物分值100分為滿分每對(duì)引物的信息雙擊選中一對(duì)引物2023/4/1578第七十八頁，共87頁。引物信息回到主窗口引物及產(chǎn)物信息是否出現(xiàn)hairpin,dimer,falseprimingandcrossdimer2023/4/1579第七十九頁，共87頁。引物編輯2023/4/1580第八十頁，共87頁。引物編輯EditprimerhereAnalysistheeditresultAccepttheeditresultReturntothemainwindow2023/4/1581第八十一頁，共87頁。其他問題加入酶切位點(diǎn)序列

5’-ATGGGATTGGCGTAAACTCAG-3’5’-GGATCCATGGGATTGGCGTAAACTCAG-3’BamHI酶切位點(diǎn)5‘端加入幾個(gè)保護(hù)堿基2023/4/1582第八十二頁，共87頁。2023/4/15復(fù)旦大學(xué)圖書館文獻(xiàn)檢索教研室primer3輸入序列2023/4/1583第八十三頁，共87頁。2023/4/151cctgcgtccccgccccgcgcagccgccgcgctcctgcgctccgaggtccgaggttcccga61gatgaaggtctggctgctgcttggtcttctgctggtgcacgaagcgctggaggatgttac121tggccaacaccttcccaagaacaagcgtccaaaagaaccaggagagaatagaatcaaacc181taccaacaagaaggtgaagcccaaaattcctaaaatgaaggacagggactcagccaattc241agcaccaaagacgcagtctatcatgatgcaagtgctggataaaggtcgcttccagaaacc301cgccgctaccctgagtctgctggcggggcaaactgtagagcttcgatgtaaagggagtag361aattgggtggagctaccctgcgtatctggacacctttaaggattctcgcctcagcgtcaa421gcagaatgagcgctacggccagttgactctggtcaactccacctcggcagacacaggtga481attcagctgctgggtgcagctctgcagcggctacatctgcaggaaggacgaggccaaaac541gggctccacctacatcttttttacagagaaaggagaactctttgtaccttctcccagcta601ct