植物基因工程基因工程原理與技術(shù)

植物基因工程基因工程原理與技術(shù)第1頁/共80頁目錄

第一節(jié)植物基因工程發(fā)展現(xiàn)狀第二節(jié)常見的植物受體類型一原生質(zhì)體二葉盤三花第三節(jié)植物基因工程載體的特點(diǎn)第四節(jié)植物基因工程載體的構(gòu)建第五節(jié)常見的植物轉(zhuǎn)基因方法一基因槍法二葉盤法三根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)法四沾花法第六節(jié)轉(zhuǎn)基因植物篩選與鑒定一PCR法與Southern法檢測(cè)外源基因的整合二RT-PCR與Nouthern檢測(cè)外源基因的表達(dá)第七節(jié)植物基因工程應(yīng)用舉例本章小結(jié)思考題第2頁/共80頁第一節(jié)植物基因工程發(fā)展現(xiàn)狀一、植物基因工程：

概念:植物基因工程，又稱轉(zhuǎn)基因或植物遺傳轉(zhuǎn)化，其研究的關(guān)鍵是從不同生物中提取外源基因片段及載體ＤＮＡ，經(jīng)過體外切割、拼接和重組，然后采取某種轉(zhuǎn)化方法，把重組后的帶有外源基因的載體ＤＮＡ引入植物細(xì)胞，并使其在植物細(xì)胞內(nèi)進(jìn)行復(fù)制和表達(dá)，以達(dá)到預(yù)期的改變受體植物細(xì)胞遺傳特性的目的，從而改良植物性狀，培育優(yōu)質(zhì)高產(chǎn)抗逆作物新品種。植物基因工程技術(shù)流程:第3頁/共80頁二、植物基因工程的發(fā)展現(xiàn)狀

20世紀(jì)60～70年代，人們仿效細(xì)菌轉(zhuǎn)化法開展了植物轉(zhuǎn)基因的嘗試。

1983年，第一株轉(zhuǎn)基因植株(Zambryski，1983)的獲得標(biāo)志著植物轉(zhuǎn)基因時(shí)代的到來。

1987年，Cornell大學(xué)的Sanford等發(fā)明了基因槍，同年Klein首次將其用于植物轉(zhuǎn)基因研究，克服了當(dāng)時(shí)農(nóng)桿菌介導(dǎo)的轉(zhuǎn)基因方法的受體種類和基因型的限制，開創(chuàng)了植物轉(zhuǎn)基因方法的新領(lǐng)域。目前，植物轉(zhuǎn)基因已成為植物分子生物學(xué)研究的強(qiáng)有力的實(shí)驗(yàn)手段；更是基因克隆、功能基因組研究必不可少的實(shí)驗(yàn)工具。近年來，遺傳轉(zhuǎn)化方法不斷創(chuàng)新，以轉(zhuǎn)化系統(tǒng)的原理不同大致可分為三類：①農(nóng)桿菌介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)移；②以原生質(zhì)體、細(xì)胞或組織為受體的直接轉(zhuǎn)移；如電激、微注射、PEG介導(dǎo)轉(zhuǎn)化原生質(zhì)體等，基因槍和超聲波法可把外源DNA直接導(dǎo)入帶壁的植物細(xì)胞，從而避免原生質(zhì)體再生植株的漫長(zhǎng)過程，使轉(zhuǎn)基因更為快速簡(jiǎn)易；③種質(zhì)系統(tǒng)的基因轉(zhuǎn)移(germlinetransformation)，如利用子房注射、種胚、體細(xì)胞胚及花粉等途徑導(dǎo)入外源基因。第4頁/共80頁三、國(guó)內(nèi)植物基因工程發(fā)展?fàn)顩r中國(guó)轉(zhuǎn)基因作物種植面積最大的是抗蟲棉，己經(jīng)建立了較為完善的棉花規(guī)?；D(zhuǎn)基因技術(shù)體系，培育出一批具有自主知識(shí)產(chǎn)權(quán)的優(yōu)質(zhì)、高產(chǎn)、多抗的轉(zhuǎn)基因棉花新品種。

中國(guó)培育的多個(gè)高抗病蟲轉(zhuǎn)基因水稻新品種，是繼抗蟲棉之后第一個(gè)具有較大影響和產(chǎn)業(yè)化前景的轉(zhuǎn)基因植物，居國(guó)際領(lǐng)先地位。中國(guó)培育的轉(zhuǎn)基因抗病小麥對(duì)黃萎病、赤霉病、白粉病有很好的防治效果。2003年中國(guó)培育出世界上第一個(gè)可用于大田生產(chǎn)的轉(zhuǎn)基因抗鹽堿楊樹新品種-中天楊，這一成果在楊樹抗鹽性轉(zhuǎn)基因體系及抗鹽新品種選育方面達(dá)到國(guó)際先進(jìn)水平，為中國(guó)和世界鹽堿地綠化找到了一條新途徑。中國(guó)己育成高含油量轉(zhuǎn)基因油菜超油1號(hào)、超油2號(hào)新品系，含油量分別達(dá)到47%0,53%，是目前世界上含油量最高的甘藍(lán)型油菜。2007年，中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)承擔(dān)的“高蛋白質(zhì)、高賴氨酸轉(zhuǎn)基因玉米自交系和雜交組合的選育”課題通過成果鑒定，并申請(qǐng)了國(guó)家發(fā)明專利，這項(xiàng)技術(shù)成果為優(yōu)質(zhì)玉米的培育探索了一條新途徑，具有潛在的巨大經(jīng)濟(jì)效益和社會(huì)效益。目前中國(guó)在轉(zhuǎn)基因作物研究方面與國(guó)際基本同步，在發(fā)展中國(guó)家中處于領(lǐng)先地位，植物轉(zhuǎn)基因技術(shù)的研究和應(yīng)用取得了很大的成績(jī)，在轉(zhuǎn)基因水稻、小麥、棉花、番茄、甜椒等作物的研究與應(yīng)用方面己達(dá)到國(guó)際領(lǐng)先水平。

第5頁/共80頁十五期間我國(guó)轉(zhuǎn)基因棉花研究與生產(chǎn)取得豐碩成果，一共培育出具有國(guó)際競(jìng)爭(zhēng)力并且通過商品化生產(chǎn)審批的轉(zhuǎn)基因棉花新品種55個(gè)，累計(jì)推廣1億多畝，創(chuàng)直接經(jīng)濟(jì)效益150億元；每畝增收節(jié)支150元左右；每年可減少化學(xué)農(nóng)藥用量2000公斤到3000萬公斤，相當(dāng)于我國(guó)化學(xué)殺蟲劑年生產(chǎn)量的7.5%；國(guó)產(chǎn)抗蟲棉的市場(chǎng)份額也由1998年的5%發(fā)展到2005年的70%以上，國(guó)產(chǎn)抗蟲棉在與國(guó)際抗蟲棉的市場(chǎng)競(jìng)爭(zhēng)中取得決定性勝利。

目前，中國(guó)的轉(zhuǎn)基因抗蟲棉已進(jìn)入印度、獨(dú)聯(lián)體、巴基斯坦、菲律賓、澳洲等市場(chǎng)。鄭愛中稱，中國(guó)的轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品也可以進(jìn)入美國(guó)，但尚未定出時(shí)間表。

第6頁/共80頁中國(guó)農(nóng)科院植物保護(hù)所所長(zhǎng)、植物病蟲害生物學(xué)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室主任吳孔明博士帶領(lǐng)他的團(tuán)隊(duì)，花費(fèi)了近十年的時(shí)間，以大量的數(shù)據(jù)和試驗(yàn)結(jié)果證明，在中國(guó)廣泛種植的Ｂｔ轉(zhuǎn)基因棉花除了可以自己“殺蟲”之外，還能保護(hù)周邊的農(nóng)作物免受棉鈴蟲危害，頗有“造福一方”的連帶效應(yīng)。吳孔明說：“這是轉(zhuǎn)基因棉對(duì)生態(tài)環(huán)境作用研究的一項(xiàng)新發(fā)現(xiàn)，同時(shí)對(duì)中國(guó)多作物混合種植體系研究也具有重要意義。”

2008《科學(xué)》雜志刊登中國(guó)科學(xué)家對(duì)轉(zhuǎn)基因棉花的研究成果第7頁/共80頁中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院棉花研究所等承擔(dān)的高科技項(xiàng)目“棉花工廠化轉(zhuǎn)基因技術(shù)體系”研究，日前通過專家鑒定。通過幾年努力，終于建成了高效、工廠化的棉花轉(zhuǎn)基因技術(shù)體系，年產(chǎn)轉(zhuǎn)基因棉花6000株以上，有效降低了棉花轉(zhuǎn)基因運(yùn)行成本。以該技術(shù)體系為支撐，已直接育成轉(zhuǎn)基因棉花新品種8個(gè)，累計(jì)推廣轉(zhuǎn)基因抗蟲棉3200多萬畝，從而使中國(guó)在這一高科技領(lǐng)域占有了一席之地。第8頁/共80頁四、植物基因工程存在的問題（1)多數(shù)植物存在轉(zhuǎn)化效率低、重復(fù)性差的問題，特別是一些重要糧食作物的轉(zhuǎn)基因效率還不高;（2)由于植物的基因組龐大，在轉(zhuǎn)基因過程中，一般是用選擇性標(biāo)記才能有效地獲得轉(zhuǎn)基因個(gè)體，而這種標(biāo)記對(duì)轉(zhuǎn)基因植物本身是不必要的累贅，由此帶來一定的生物安全問題;（3)人們還不能隨意地定位和導(dǎo)入所需的外源基因;（4)轉(zhuǎn)基因植株再生和鑒定難、操作周期長(zhǎng);（5)植物轉(zhuǎn)基因最常用的農(nóng)桿菌介導(dǎo)法和基因槍法，都依賴于組織培養(yǎng)，操作復(fù)雜，常會(huì)引起受體組織的突變，或轉(zhuǎn)化植株出現(xiàn)基因沉默。另外，還存在外源基因在轉(zhuǎn)基因植物中的遺傳穩(wěn)定性問題。第9頁/共80頁第二節(jié)常見的植物受體類型愈傷組織受體系統(tǒng)原生質(zhì)體種質(zhì)受體系統(tǒng)胚狀體受體系統(tǒng)直接分化芽受體系統(tǒng)第10頁/共80頁愈傷組織受體系統(tǒng)特點(diǎn)：①愈傷組織是由脫分化的分生細(xì)胞組成，易接受外源DNA，轉(zhuǎn)化率較高；②多種外植體都可經(jīng)組織培養(yǎng)誘導(dǎo)產(chǎn)生愈傷組織，可應(yīng)用于多種植物基因轉(zhuǎn)化；③愈傷組織可繼代擴(kuò)繁，因而由轉(zhuǎn)化愈傷組織可培養(yǎng)獲得大量的轉(zhuǎn)化植株；④從外植體誘導(dǎo)的愈傷組織常由多細(xì)胞形成，本身就是嵌合體，因而分化的不定芽嵌合體比例高，增加了轉(zhuǎn)基因再生植株篩選的難度；⑤愈傷組織所形成的再生植株無性系變異較大，轉(zhuǎn)化的目的基因遺傳穩(wěn)定性較差。愈傷組織可分為胚性和非胚性愈傷組織兩種類型，兩者在外觀上在內(nèi)部結(jié)構(gòu)上在超微結(jié)構(gòu)上均有所不同。第11頁/共80頁原生質(zhì)體

植物原生質(zhì)體(protoplast)是去除細(xì)胞壁后的“裸露”細(xì)胞，具全能性，能在適宜的培養(yǎng)條件下誘導(dǎo)出再生植株。由于原生質(zhì)體與外界環(huán)境之間僅隔一層薄薄的細(xì)胞膜，人們可利用一些物理或化學(xué)的方法改變細(xì)胞膜的通透性，使外源DNA進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)整合到染色體上并進(jìn)行表達(dá)，從而實(shí)現(xiàn)植物基因轉(zhuǎn)化。原生質(zhì)體呈單細(xì)胞狀態(tài)，每個(gè)植株都是單細(xì)胞起源的，每個(gè)原生質(zhì)體都有同等的再生機(jī)會(huì),而且避免形成“嵌合體“,是遺傳轉(zhuǎn)化研究的一個(gè)理想的受體。特點(diǎn)：①外源DNA易導(dǎo)人細(xì)胞，易于在相對(duì)均勻和穩(wěn)定的同等控制條件下進(jìn)行準(zhǔn)確的轉(zhuǎn)化和鑒定；②原生質(zhì)體培養(yǎng)的細(xì)胞，常分裂形成基因型一致的細(xì)胞克隆，因此由轉(zhuǎn)化原生質(zhì)體再生的轉(zhuǎn)基因植株嵌合體少；③可適用于各種轉(zhuǎn)化方法，主要有電擊法、PEG、脂質(zhì)體介導(dǎo)法和顯微注射法等；④原生質(zhì)體培養(yǎng)所形成的細(xì)胞無性系變異較強(qiáng)烈，遺傳穩(wěn)定性差；⑤原生質(zhì)體培養(yǎng)技術(shù)難度大，培養(yǎng)周期長(zhǎng)，植株再生頻率低。第12頁/共80頁種質(zhì)受體系統(tǒng)

以植物的生殖細(xì)胞如花粉粒、卵細(xì)胞或種子為受體細(xì)胞進(jìn)行基因轉(zhuǎn)化的系統(tǒng)稱為種質(zhì)系統(tǒng)。已建立了多種直接利用花粉粒、種子和卵細(xì)胞受精過程進(jìn)行基因轉(zhuǎn)化的方法，如花粉管通道法、花粉粒和種子浸泡法以及子房注射法等。優(yōu)點(diǎn)：①生殖細(xì)胞不僅具有全能性，而且接受外源遺傳物質(zhì)的能力強(qiáng)，導(dǎo)人外源基因成功率高；②生殖細(xì)胞是單倍體細(xì)胞，轉(zhuǎn)化的基因無顯隱性影響；③可以應(yīng)用于任何單胚珠、多胚珠的單子葉、雙子葉顯花植物；④直接針對(duì)成株操作，不需經(jīng)過細(xì)胞或原生質(zhì)體培養(yǎng)、誘導(dǎo)再生植株等費(fèi)時(shí)費(fèi)力的過程；⑤不受基因型的限制；⑥育種年限短；⑦除用總DNA外，同樣還可以應(yīng)用DNA重組分子進(jìn)行導(dǎo)入；⑧為遠(yuǎn)緣雜交不親合的植物之間的基因重組創(chuàng)造了條件；⑨方法簡(jiǎn)便。局限性：①只能限于開花植物，且只有花期可以轉(zhuǎn)育；②必須進(jìn)行大群體操作，以減少轉(zhuǎn)化操作對(duì)作物的影響和傷害；③導(dǎo)人總DNA片段的轉(zhuǎn)育株會(huì)帶有少量非目的性狀的DNA片段；④這種技術(shù)牽涉到植物雙受精過程，其機(jī)制更加復(fù)雜化，缺乏精密的理論依據(jù)。第13頁/共80頁胚狀體受體系統(tǒng)胚狀體(embryoid)是指經(jīng)細(xì)胞胚發(fā)生而形成的在形態(tài)結(jié)構(gòu)和功能上類似于有性胚的結(jié)構(gòu)，又稱為體細(xì)胞胚。

優(yōu)點(diǎn)：①再生能力強(qiáng)；②胚狀體具有兩極性，直接再生成完整植株；③可轉(zhuǎn)化的功能細(xì)胞多，即處于轉(zhuǎn)化感受態(tài)的細(xì)胞數(shù)量多；④細(xì)胞分裂的同步性好；⑤一般認(rèn)為胚狀體是由單細(xì)胞起源，因此獲得的轉(zhuǎn)化體嵌合體少；⑥轉(zhuǎn)化效率高，每次實(shí)驗(yàn)可進(jìn)行大量細(xì)胞的操作獲得較多數(shù)量的轉(zhuǎn)化體；⑦胚狀體發(fā)生途徑獲得的再生植株遺傳穩(wěn)定性好，變異少；⑧胚性細(xì)胞受體系統(tǒng)可長(zhǎng)期保存不影，向再生能力。

第14頁/共80頁直接分化芽受體系統(tǒng)直接分化芽是指外植體細(xì)胞不經(jīng)過愈傷組織階段而以組織培養(yǎng)直接分化形成不定芽(adventitiousbud)。特點(diǎn)：①直接分化芽是由未分化的細(xì)胞直接分化形成，體細(xì)胞無性系變異小;②該系統(tǒng)應(yīng)用于基因轉(zhuǎn)化時(shí)，操作簡(jiǎn)單、周期短；③不定芽的再生常起源于多細(xì)胞，所形成的再生植株也可出現(xiàn)較多的嵌合體。此外，由外植體誘導(dǎo)直接分化芽產(chǎn)生，技術(shù)難度大，不定芽量少，因此，基因轉(zhuǎn)化頻率低于其他幾種受體系統(tǒng)。第15頁/共80頁第三節(jié)植物基因工程載體的特點(diǎn)一、植物基因工程載體的種類和特性

章魚堿型

Ti質(zhì)粒胭脂堿型農(nóng)桿堿型農(nóng)桿菌素堿型質(zhì)粒載體農(nóng)桿堿型

Ri質(zhì)粒甘露堿黃瓜堿型植物基因工程載體單鏈RNA病毒．植物病毒載體單鏈DNA病毒雙鏈DNA病毒轉(zhuǎn)座子載體第16頁/共80頁

克隆載體中間黏粒載體中間克隆載體愈合載體中間載體基因標(biāo)記載體中間表達(dá)載體

Onc-卸甲載體基因工程載體卸甲載體

Onc+卸甲載體共整合載體一元載體轉(zhuǎn)化載體拼接末端載體雙元載體第17頁/共80頁不同類型載體在植物基因工程中所起作用不同：(1)Ti質(zhì)粒載體：存在于根癌農(nóng)桿菌中，通過傷口侵染植物，能使侵染部位產(chǎn)生瘤狀突起。

(2)Ri質(zhì)粒載體：存在于發(fā)根農(nóng)桿菌中，侵染植物后產(chǎn)生須狀根。

(3)植物病毒載體：具體又可分為3種，雙鏈DNA病毒、單鏈DNA病毒和單鏈RNA病毒。

(4)中間克隆載體：構(gòu)建中間表達(dá)載體的基礎(chǔ)質(zhì)粒，由大腸桿菌質(zhì)粒插入T-DNA片段及目的基因、標(biāo)記基因等構(gòu)建而成。

(5)中間表達(dá)載體：含有植物特異啟動(dòng)子的中間載體，功能是構(gòu)建轉(zhuǎn)化載體。

(6)卸甲載體：解除武裝的Ti質(zhì)?；騌i質(zhì)粒，功能也是構(gòu)建轉(zhuǎn)化載體。

(7)轉(zhuǎn)化載體：又稱工程載體，由中間表達(dá)載體和卸甲載體構(gòu)建而成，用于目的基因?qū)酥参锛?xì)胞。第18頁/共80頁二、植物基因工程質(zhì)粒載體的命名歸納為以下幾點(diǎn)：

(1)對(duì)天然存在的質(zhì)粒使用原有的命名，如ColEl和SCPl等。

(2)新發(fā)現(xiàn)或改造的質(zhì)粒命名規(guī)則：第1個(gè)小寫字母p表示質(zhì)粒(plasmid)，后面2個(gè)或3個(gè)大寫字母表示構(gòu)建該質(zhì)粒的研究人員的姓名、研究單位或?qū)嶒?yàn)室名稱，最后的數(shù)字表示構(gòu)建的一系列質(zhì)粒的編號(hào)。如pUCll8，p代表質(zhì)粒，UC代表美國(guó)加利福尼亞大學(xué)(Uniers-ityofCalifornia)的英文縮寫，118代表該質(zhì)粒的編號(hào)。

(3)質(zhì)粒中的缺失和其他類型重排的命名與細(xì)菌基因組中的缺失和重排的命名相同，如缺失了基因cad與asa的質(zhì)粒命名為pI258△(cad-asa-)。

(4)質(zhì)粒載體抗藥性的符號(hào)規(guī)定用大寫字母表示表型，用相同的3個(gè)小寫字母表示基因型。

第19頁/共80頁第四節(jié)植物基因工程載體的構(gòu)建1．農(nóng)桿菌載體系統(tǒng)2．病毒載體系統(tǒng)第20頁/共80頁1．農(nóng)桿菌載體系統(tǒng)①根癌誘導(dǎo)原理及Ti質(zhì)粒根癌農(nóng)桿菌誘導(dǎo)的腫瘤稱為冠癭，而發(fā)根農(nóng)桿菌則誘導(dǎo)發(fā)根。這些農(nóng)桿菌中含有大量質(zhì)粒，分別稱為腫瘤誘導(dǎo)質(zhì)粒(Ti質(zhì)粒)和發(fā)根誘導(dǎo)質(zhì)粒(Ri質(zhì)粒)，這兩種質(zhì)粒均可使宿主發(fā)病。這兩種病均是由Ti或Ri質(zhì)粒的一些特殊組分轉(zhuǎn)入植物細(xì)胞后與植物染色體進(jìn)行功能整合而引起的。后來的研究表明，在Ti質(zhì)粒中，只有一小部分，即T-DNA或稱轉(zhuǎn)移DNA，被轉(zhuǎn)入并整合到宿主植物核基因組中，而誘導(dǎo)形成冠癭瘤的(Chiton等，1977)。T-DNA含編碼章魚堿和胭脂堿合成所需酶的基因，即章魚堿合酶基因(ocs)和胭脂堿合酶(nos)基因。

第21頁/共80頁②Ti質(zhì)粒的構(gòu)成a．T-DNAb．毒性基因c．染色體基因：第22頁/共80頁③T-DNA轉(zhuǎn)移第23頁/共80頁④農(nóng)桿菌載體的構(gòu)建A．一元載體系統(tǒng)有兩種載體系統(tǒng)，即共整合載體(如pGV3850共合體)和末端拼接載體(split-endvector，SEV)系統(tǒng)。

中間載體與卸甲載體通過LIH基因同源重組形成SEV載體第24頁/共80頁

中間載體與卸甲載體通過pBR序列同源重組進(jìn)行共整合第25頁/共80頁B．雙元載體系統(tǒng)雙元載體系統(tǒng)由兩個(gè)能在根癌農(nóng)桿菌中自主復(fù)制的質(zhì)粒組成：一個(gè)是在T-DNA邊界之間帶有目的基因的穿梭載體(但更多是一個(gè)雙元載體)；一個(gè)是輔助(helper)Ti質(zhì)粒，該質(zhì)粒帶有vir基因，其產(chǎn)物有助于將DNA轉(zhuǎn)移到植物細(xì)胞。

雙元Ti載體系統(tǒng)，由質(zhì)粒A（輔助Ti質(zhì)粒）和質(zhì)粒B（雙元載體）共同組成

第26頁/共80頁標(biāo)準(zhǔn)雙元載體的組成成分：(1)多克隆位點(diǎn)；(2)在大腸桿菌和根癌農(nóng)桿菌中均有功能的廣譜宿主范圍的質(zhì)粒復(fù)制起始點(diǎn)(如RK2)；(3)細(xì)菌和植物中的選擇標(biāo)記；(4)T-DNA邊界序列(盡管只有右邊界序列是絕對(duì)必需的)。

雙元載體的優(yōu)點(diǎn)：1)．雙元載體不需要在活體內(nèi)進(jìn)行同源重組，而共整合載體需要在根癌農(nóng)桿菌中維持穩(wěn)定的重組過程。2).雙元載體只需要將一個(gè)完整的質(zhì)粒載體轉(zhuǎn)入靶細(xì)菌，使細(xì)菌的轉(zhuǎn)化過程更為有效、快捷(原來需要4～7d，現(xiàn)在只需2～3d)。3).在農(nóng)桿菌中，獲得帶有植物目的基因的雙元載體系統(tǒng)比較容易而且效率高。4)．在雙元載體系統(tǒng)中，雙元質(zhì)粒有兩個(gè)獨(dú)立的復(fù)制子，這樣拷貝數(shù)不會(huì)太多地受到Ti質(zhì)粒復(fù)制子的限制。正因?yàn)檫@一點(diǎn)，大多數(shù)情況下通過農(nóng)桿菌的小量制備就可確認(rèn)轉(zhuǎn)化成功與否，而若用共整合載體需進(jìn)行Southern雜交。第27頁/共80頁2．病毒載體系統(tǒng)目前，用于開發(fā)載體及轉(zhuǎn)化的病毒有三種，他們主要采用基因插入和基因取代的方法構(gòu)建載體：①花椰菜花葉病毒(Caulimoviruses)②雙聯(lián)體病毒③RNA病毒

第28頁/共80頁①花椰菜花葉病毒(Caulimoviruses)CaMV的基因組由一個(gè)8kb的松弛的環(huán)狀分子組成。基因組有兩個(gè)區(qū)域，一個(gè)是ORFⅡ，編碼昆蟲傳播因子；另一個(gè)是ORFⅦ，功能還不清楚。將這兩個(gè)區(qū)域缺失掉，用感興趣的基因取代之。Brisson等(1984)用CaMV載體在蕪青甘藍(lán)細(xì)胞中獲得了由細(xì)菌二氫葉酸還原酶基因編碼的外源蛋白。這一結(jié)果證明CaMV基因組確實(shí)能被改建成植物基因工程病毒載體并把外源基因轉(zhuǎn)入植物細(xì)胞。目前，用CaMV基因組構(gòu)建載體的基本路線是把外源基因整合到基因組某個(gè)特定的非功能區(qū)域或?qū)Σ《緩?fù)制沒有重要作用的ORF中，外源基因插入后不影響病毒基因組的侵染性。這種載體在細(xì)胞中的復(fù)制方式與野生型的CaMV相同，外源基因不能整合到寄主染色體上，已報(bào)道的克隆到CaMV載體中的基因都只有較短的核苷酸序列，插入位點(diǎn)都在ORFⅡ上，外源基因的表達(dá)多受病毒啟動(dòng)子的調(diào)節(jié)。第29頁/共80頁②雙聯(lián)體病毒雙聯(lián)體病毒組中的每個(gè)成員均需具備兩個(gè)元件，盡管這兩個(gè)元件不必存在于同一個(gè)分子上，但它們必須是任意有功能的雙聯(lián)體病毒載體系統(tǒng)的組成部分。這兩個(gè)元件就是一個(gè)復(fù)制起點(diǎn)和一個(gè)病毒復(fù)制必需蛋白。到目前為止，大多數(shù)雙聯(lián)體病毒載體都很簡(jiǎn)單，只缺失外殼蛋白編碼基因，可用報(bào)告基因或其他感興趣的基因取代。雙聯(lián)體病毒表達(dá)載體可以用于原生質(zhì)體、培養(yǎng)細(xì)胞、葉圓片及植物體等幾種不同系統(tǒng)中外源基因的轉(zhuǎn)移、擴(kuò)增及表達(dá)。第30頁/共80頁③RNA病毒

RNA病毒大致可分為三類:第一類為單鏈RNA病毒，包括兩種基本形式。一種形式是單一型病毒(monopartite)，其基因組RNA包括全部遺傳信息，當(dāng)作為一個(gè)單順反子被翻譯時(shí)通常很大，如煙草花葉病毒(TMV)。另一種形式是混合型病毒(multipartite)，正如其名稱所示，基因組RNA分為若干部分，每一部分或被包裝在同一個(gè)顆粒中或被包裝在不同的顆粒中，如雀麥草花葉病毒(BMV)三個(gè)獨(dú)立的顆粒包含了四個(gè)RNA分子。第二類即亞基因組RNA(如BMV的RNAⅣ)，它們不可能被用作載體，因?yàn)樗鼈冊(cè)诟腥局参镏胁荒茏晕覐?fù)制。第三類為衛(wèi)星RNA，最有可能被用作載體，因?yàn)樗鼘?duì)病毒完全是可有可無的。第31頁/共80頁

第五節(jié)常見的植物轉(zhuǎn)基因方法可分為3大類：一類是載體介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化方法，即將目的基因插入到農(nóng)桿菌的質(zhì)?；虿《镜腄NA等載體分子上，隨著載體DNA的轉(zhuǎn)移而將目的基因?qū)氲街参锘蚪M中。農(nóng)桿菌介導(dǎo)和病毒介導(dǎo)法就屬于這種方法。第二類為基因直接導(dǎo)入法，是指通過物理或化學(xué)的方法直接將外源目的基因?qū)胫参锏幕蚪M中。物理方法包括基因槍轉(zhuǎn)化法、電激轉(zhuǎn)化法、超聲波法、顯微注射法和激光微束法等；化學(xué)方法有PEG介導(dǎo)轉(zhuǎn)化方法和脂質(zhì)體法等。第三類為種質(zhì)系統(tǒng)法，這包括花粉管通道法、生殖細(xì)胞浸染法、胚囊和子房注射法等。第32頁/共80頁一、根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)法合適外植體的選擇及再生系統(tǒng)的建立抗生素篩選壓的確定及農(nóng)桿菌菌株的選擇葉盤(或其他外植體)預(yù)培養(yǎng)(1～5天，非必須)農(nóng)桿菌侵染(數(shù)秒、數(shù)分鐘)

共培養(yǎng)(2～3天)

推遲篩選或篩選(培養(yǎng)基中加入抑菌抗生素和選擇抗生素)

抗性芽的獲得

選擇抗生素(如Km)中生根農(nóng)桿菌介導(dǎo)法進(jìn)行植物基因轉(zhuǎn)化的主要程序轉(zhuǎn)基因植株的獲得分子生物學(xué)檢測(cè)第33頁/共80頁農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法的分類根據(jù)所選外植體的不同，可分為以下3種方法：1.葉盤轉(zhuǎn)化法2.原生質(zhì)體共培養(yǎng)轉(zhuǎn)化法3.整株感染法第34頁/共80頁農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法優(yōu)缺點(diǎn)：農(nóng)桿菌作為一種天然的植物基因轉(zhuǎn)化系統(tǒng)，其介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化屬于一種純生物學(xué)的方法，與其它轉(zhuǎn)化方法相比具有明顯的優(yōu)點(diǎn)：它能將載體上特定區(qū)域內(nèi)的目的基因?qū)爰?xì)胞，并整合在染色體上，這種方法儀器設(shè)備簡(jiǎn)單，操作容易，可直接用不同的植物組織進(jìn)行基因轉(zhuǎn)移；另外，這種方法外源基因插入一般為單拷貝或低拷貝，可較穩(wěn)定地表達(dá)和遺傳到子代，轉(zhuǎn)移DNA片段明確，可轉(zhuǎn)移大片段DNA，并能保證導(dǎo)入的外源基因的完整性，轉(zhuǎn)化頻率高，費(fèi)用相對(duì)低廉，再生植株可育率高。因此，農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化方法發(fā)展?jié)摿薮?，其?yīng)用也越來越廣泛。但是它最大的弱點(diǎn)就是寄主范圍狹窄，主要應(yīng)用于雙子葉植物，農(nóng)桿菌介導(dǎo)的單子葉植物轉(zhuǎn)化直到20世紀(jì)90年代之后才取得一系列進(jìn)展。近年來，由于在載體系統(tǒng)和轉(zhuǎn)化方法研究上的進(jìn)步，農(nóng)桿菌已在轉(zhuǎn)化水稻、玉米、小麥、石刁柏、黑麥草等單子葉植物上取得了成功。第35頁/共80頁二、基因槍法基因槍轉(zhuǎn)化的步驟：1)受體細(xì)胞或組織的準(zhǔn)備和預(yù)處理；2)DNA微彈的制備；3)受體材料的轟擊；4)轟擊后外植體的培養(yǎng)和篩選。第36頁/共80頁.通過微彈轟擊將DNA直接轉(zhuǎn)移入植物細(xì)胞第37頁/共80頁基因槍的結(jié)構(gòu)：

氣壓表氣體加速管易裂片運(yùn)動(dòng)中的微彈靶細(xì)胞第38頁/共80頁DNA微粒載體的制備原理:

CaCl對(duì)DNA有沉淀作用，亞精胺、聚乙二醇具有黏附作用，將這些化合物與DNA混合后與鎢粉或金粉混合，吹干后，則DNA沉淀在載體顆粒上。影響基因槍法轉(zhuǎn)化頻率的主要因素：①金屬微粒的影響②DNA沉淀輔助劑的影響③DNA的純度及濃度對(duì)轉(zhuǎn)化率的影響④微彈速度的影響⑤植物材料內(nèi)在的影響第39頁/共80頁基因槍轉(zhuǎn)化法的優(yōu)缺點(diǎn)：基因槍轉(zhuǎn)化率差異很大，一般在10-3～10-2之間。相對(duì)于農(nóng)桿菌介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化率要低得多。而且基因槍轉(zhuǎn)化成本高；所得的轉(zhuǎn)化體中嵌合體比率較大；目前大多數(shù)只報(bào)道轉(zhuǎn)化后的瞬時(shí)表達(dá)，而穩(wěn)定遺傳的比例甚差；外源DNA的整合機(jī)理等理論問題尚不清楚。此外，通過基因槍法整合進(jìn)植物細(xì)胞基因組中的外源基因通常是多拷貝的，可導(dǎo)致植物自身的某些基因非正常表達(dá)，還可能發(fā)生共抑制現(xiàn)象(co-suppression)。即使這樣，該方法得到了廣泛應(yīng)用，因其具有如下優(yōu)點(diǎn)：①無宿主限制，無論是單子葉植物和雙子葉植物都可以應(yīng)用。②可控度高，操作簡(jiǎn)便迅速，商品化的基因槍都可以根據(jù)實(shí)驗(yàn)需要調(diào)控微彈的速度和射入濃度，命中特定層次的細(xì)胞；近代的高壓放電基因槍或高壓氣體基因槍已可根據(jù)需要無級(jí)調(diào)控微彈的速率和射人濃度，可以較高的命中率把DNA微粒載體射人特定層次的細(xì)胞，即感受態(tài)細(xì)胞和分生區(qū)細(xì)胞，從而為基因轉(zhuǎn)化提供可靠的技術(shù)措施。③受體類型廣泛，基因槍技術(shù)可以選用易于再生的受體，避開原生質(zhì)體再生的困難。它不僅以原生質(zhì)體、葉圓片、懸浮培養(yǎng)細(xì)胞、莖、根為靶受體，而且種子的胚、分生組織、愈傷組織、花粉細(xì)胞、子房等幾乎所有具有分生潛力的組織或細(xì)胞都可以用基因槍進(jìn)行轟擊。④可將外源基因?qū)胫参锛?xì)胞的細(xì)胞器，并可得到穩(wěn)定表達(dá)。

第40頁/共80頁三、花粉管通道法花粉管通道法是一種較老的植物轉(zhuǎn)化方法,是我國(guó)科學(xué)家周光宇在1983年首次在“MethodsinEnzymology”報(bào)道的研究成果。該技術(shù)的原理主要是授粉后使外源DNA能沿花粉管滲入,經(jīng)過珠心通道進(jìn)入胚囊,轉(zhuǎn)化尚不具備正常細(xì)胞壁的卵、合子或早期胚胎細(xì)胞。隨著受精卵的發(fā)育而成為帶轉(zhuǎn)基因的新個(gè)體。

花粉管通道導(dǎo)入方法：花粉管通道操作方法通常有:微注射法、柱頭滴加和花粉粒攜帶。其中,最初的操作方法是柱頭滴加法,在以后的實(shí)踐中,又根據(jù)植物的花器結(jié)構(gòu)特征等,開發(fā)了一些新的花粉管通道導(dǎo)入外源DNA的技術(shù)方法,如子房注射法,即對(duì)于子房較大的受體,在授粉后使用微量注射器沿子房縱軸插入一定深度注射外源DNA溶液;或采用花粉粒攜帶法,即用待轉(zhuǎn)基因的溶液處理花粉粒,用這種攜帶有外源基因的花粉粒授粉。第41頁/共80頁花粉管通道法優(yōu)缺點(diǎn)：該法的最大優(yōu)點(diǎn)是不依賴組織培養(yǎng)人工再生植株，技術(shù)簡(jiǎn)單，不需要裝備精良的實(shí)驗(yàn)室，常規(guī)育種工作者易于掌握；另外花粉管通道法具備無基因型限制和易于實(shí)現(xiàn)大規(guī)?；蜣D(zhuǎn)化的特點(diǎn)，可以在任何開花植物和不同物種之間實(shí)現(xiàn)基因的轉(zhuǎn)移，使得受體物種在獲得新的基因型的同時(shí)，也獲得轉(zhuǎn)基因所表達(dá)的新的表型性狀，由此為農(nóng)作物育種提供了創(chuàng)造新種質(zhì)，拓寬基因庫的嶄新技術(shù)途徑，并且已經(jīng)成功應(yīng)用于作物育種，獲得了多種實(shí)用化的轉(zhuǎn)基因農(nóng)作物新品種(系)，應(yīng)用于農(nóng)作物生產(chǎn)。缺點(diǎn)是需要大量人工做大田轉(zhuǎn)化，以便以千分之幾的轉(zhuǎn)化率仍能獲得較多的轉(zhuǎn)化子。山西省農(nóng)科院生物技術(shù)中心的孫毅等又將次法進(jìn)一步改善。他們?cè)谟衩资⒒ㄆ趯⒒ǚ凼占饋恚煤型庠茨康幕虻恼崽侨芤禾幚?，后再人工授粉到原來的植株，以便帶有目的基因的花粉能夠自?dòng)經(jīng)過花粉管進(jìn)入胚珠，形成轉(zhuǎn)基因的合子。但其制約因素是處理后的花粉其授粉能力和育性降低。第42頁/共80頁四、其他轉(zhuǎn)基因方法1.發(fā)根農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)化法2.病毒介導(dǎo)轉(zhuǎn)化法3植物基因的直接轉(zhuǎn)移方法

顯微注射法：電穿孔法：微束激光打孔法：聚乙二醇法：脂質(zhì)體法：超聲波法：碳化硅纖維介導(dǎo)轉(zhuǎn)化法：

病毒載體的遺傳轉(zhuǎn)化第43頁/共80頁

第六節(jié)轉(zhuǎn)基因植物篩選與鑒定1生物學(xué)篩選2標(biāo)記基因的表達(dá)檢測(cè)3目的基因及其表達(dá)的分子鑒定以上篩選與鑒定方法，只有三種方法均證明為陽性的才可以真正稱得上轉(zhuǎn)化植株，而事實(shí)上有很多是假陽性植株，它們的生物學(xué)檢測(cè)為陽性但篩選標(biāo)記為陰性，分子鑒定也為陰性；另外一些則因?yàn)檗D(zhuǎn)入的基因沉默而盡管分子檢測(cè)為陽性但生物學(xué)和篩選標(biāo)記檢測(cè)為陰性。第44頁/共80頁1生物學(xué)篩選：即針對(duì)轉(zhuǎn)基因應(yīng)當(dāng)表達(dá)的表現(xiàn)型直接應(yīng)用生物學(xué)的方法進(jìn)行鑒定以明確目的基因能否在受體植物中表達(dá)出目標(biāo)性狀及其表達(dá)水平，如抗蟲性、抗病性等等。如轉(zhuǎn)基因抗蟲棉的抗蟲性鑒定，可以直接利用棉鈴蟲的初孵幼蟲來進(jìn)行，轉(zhuǎn)基因抗病棉的抗病性鑒定則可以直接在人工或天然病圃中進(jìn)行。第45頁/共80頁2標(biāo)記基因的表達(dá)檢測(cè)：

1.常用標(biāo)記基因及其檢測(cè)方法

在植物轉(zhuǎn)基因和基因表達(dá)調(diào)控研究中，經(jīng)常要使用選擇標(biāo)記基因(selectivegene)。標(biāo)記基因可分為選擇基因和報(bào)告基因(reportergene)，二者都可以看做是標(biāo)記基因，都起著標(biāo)記目的基因是否成功轉(zhuǎn)化的作用，但是它們又有著各自的特點(diǎn)。選擇基因（又稱選擇標(biāo)記基因），主要是一類編碼可使抗生素或除草劑失活的蛋白酶基因（如npt-Ⅱ基因和bar基因），這種基因在執(zhí)行其選擇功能時(shí)，通常存在檢測(cè)慢（蛋白酶作用需要時(shí)間）、依賴外界篩選壓力（如抗生素、除草劑）等缺陷。而報(bào)告基因則是指其編碼產(chǎn)物能夠被快速測(cè)定、且不依賴于外界壓力的一類基因。理想的報(bào)告基因通常具備如下基本要求：①、受體細(xì)胞中不存在相應(yīng)內(nèi)源等位基因的活性；②、它的產(chǎn)物是唯一的，且不會(huì)損害受體細(xì)胞；③、具有快速、廉價(jià)、靈敏、定量和可重復(fù)性的檢測(cè)特性。目前常用的報(bào)告基因有氯霉素乙酰轉(zhuǎn)移酶基因（cat）、熒光素酶基因（luc）、β-葡萄糖苷酸酶基因（gus）、冠癭堿合成酶基因（nos）等。第46頁/共80頁常用標(biāo)記基因的檢測(cè)方法

:

npt-Ⅱ基因的檢測(cè)

npt-Ⅱ基因來源于細(xì)菌轉(zhuǎn)座子Tn5上ahpA2。該基因編碼氨基糖苷-3`-磷酸轉(zhuǎn)移酶(aminnogl-ycoside-3`-phosphorransferaseⅡ)，又稱npt-Ⅱ(neomycinphosphotransferasc-Ⅱ)，該酶使氨基糖苷類抗生素(新霉素、卡那霉素、慶大霉素和G418等)磷酸化而失活。此類抗生素抑制原核生物蛋白質(zhì)生物合成70S起始復(fù)合體的生成，并阻礙了原核生物的蛋白質(zhì)生物合成。該類抗生素對(duì)植物細(xì)胞表現(xiàn)毒性抗性的機(jī)制是與植物細(xì)胞葉綠體和線粒體中的核糖體30S亞基結(jié)合，影響70S起始復(fù)合物生成，干擾葉綠體及線粒體的蛋白質(zhì)生物合成，最終導(dǎo)致植物細(xì)胞死亡。第47頁/共80頁

bar基因的檢測(cè)

bar基因?yàn)榭钩輨┗颍幋aPPT乙酰轉(zhuǎn)移酶(PAT)。PAT是一種谷氨酸結(jié)構(gòu)類似物，能競(jìng)爭(zhēng)地抑制植物體內(nèi)谷氨酰胺合成酶(GS)的活性。該酶催化細(xì)胞內(nèi)發(fā)生解氨毒的生化反應(yīng)。當(dāng)PPT存在時(shí)，GS活性被抑制，細(xì)胞內(nèi)NH3積累，細(xì)胞中毒而死亡。bar基因編碼的PPT乙酰轉(zhuǎn)移酶可以催化乙酰CoA分子轉(zhuǎn)移到PPT分子游離氨基上，使PPT乙酰化，乙酰化了的PPT失去對(duì)GS的抑制作用，因而轉(zhuǎn)化了bar基因的植物表現(xiàn)出對(duì)除草劑PPT的抗性。bar基因表達(dá)產(chǎn)物PAT活性測(cè)定方法有硅膠G薄層層析法及DTNB比色分析法。第48頁/共80頁gus基因的檢測(cè)

GUS在轉(zhuǎn)化的植物細(xì)胞內(nèi)及提取液中很穩(wěn)定，在葉肉原生質(zhì)體中GUS的半衰期為50h。GUS對(duì)較高溫度及去污劑都有—定的耐受性。GUS表現(xiàn)活性時(shí)不需要輔酶，催化作用的最適PH為5.2～8.0，對(duì)離子無特殊要求，可適應(yīng)較寬的離子強(qiáng)度范圍，但某些二價(jià)金屬離子能抑制其活性。用于gus基因檢測(cè)的常用底物有3種：5-溴-4-氯-3-吲哚-β-葡萄糖苷酸酯(X-Gluc)、4-甲基傘形酮酰-β-葡萄糖醛酸苷酯(4-MUG)及對(duì)硝基苯β-葡萄糖醛酸苷(PNPG)。這三種底物分別用于如下不同的檢測(cè)方法。

1)X-Gluc的組織化學(xué)染色定位法

2）4-甲基傘形酮酰-β-葡萄糖醛酸苷的熒光法測(cè)定GUS活性

3）對(duì)硝基苯-β-匍萄糖酸苷的分光光度法第49頁/共80頁

冠癭堿合成酶基因（nos）的檢測(cè)

冠癭堿合成酶(opinesynthase)基因存在于農(nóng)桿菌Ti質(zhì)粒或Ri質(zhì)粒上，該基因與Ti質(zhì)粒的致瘤作用無關(guān)，故載體構(gòu)建時(shí)，有時(shí)保留該基因作為報(bào)告基因使用。該基因的啟動(dòng)子是真核生物啟動(dòng)子，在農(nóng)桿菌中并不表達(dá)，整合到植物染色體上后才表達(dá)，它編碼與冠癭堿合成有關(guān)的酶，催化冠癭堿合成。

第50頁/共80頁熒光素酶基因(luc)的檢測(cè)

自20世紀(jì)60年代以來，人們陸續(xù)發(fā)現(xiàn)了多種結(jié)構(gòu)不同的熒光素酶。它們可以催化生物自身發(fā)光反應(yīng)。目前研究最多的是螢火蟲及細(xì)菌產(chǎn)生的熒光素酶，各種熒光素的化學(xué)結(jié)構(gòu)有一定差異，甚至完全不同。螢火蟲熒光素酶催化的底物是8-羥基喹啉類，在鎂離子、三磷酸腺苷及氧化作用下，酶使底物氧化脫羧，生成激活態(tài)的氧化熒光素，發(fā)射光子后轉(zhuǎn)變成常態(tài)的氧化熒光素，反應(yīng)中化學(xué)能轉(zhuǎn)變成光能。而細(xì)菌熒光素酶以脂肪為底物，需要還原型的黃素核甘酸及氧參與，使脂肪醛氧化為脂肪酸，同時(shí)放出光子。第51頁/共80頁其他標(biāo)記基因或篩選方法除了以上各種標(biāo)記基因之外有人還報(bào)道了其他一些安全的篩選標(biāo)記或思路。生物合成基因利用生物合成基因作為篩選標(biāo)記基因，可提高安全性。如某些支鏈氨基酸(賴氨酸、蘇氨酸、甲硫氨酸、異亮氨酸)的合成都要經(jīng)過天冬氨酸的合成途徑。其中賴氨酸是由天冬氨酸激酶和二羥基吡啶二羧基合酶催化合成的，兩種酶都受賴氨酸的反饋抑制。細(xì)菌來源的這兩種酶由于對(duì)賴氨酸不敏感，因此可作為植物轉(zhuǎn)化的篩選標(biāo)記，在含賴氨酸的培養(yǎng)基中轉(zhuǎn)基因植株能夠存活，而非轉(zhuǎn)基因植株則因死亡而被淘汰。篩選標(biāo)記基因的失活為了減少抗性標(biāo)記基因產(chǎn)物帶來的不安全性，一些研究者還采用反義RNA基因、核糖裂解酶基因(ribozyrnes)或采用抗體基因等策略使篩選標(biāo)記基因或基因產(chǎn)物失活。但這些方法的缺點(diǎn)是沒有去除篩選標(biāo)記基因，仍存在基因傳播的可能性。正向篩選標(biāo)記基因的使用所謂正向篩選(positiveselection)，是相對(duì)于負(fù)向篩選(negativeselection,即在篩選培養(yǎng)基上，轉(zhuǎn)基因細(xì)胞能夠存活，而非轉(zhuǎn)基因細(xì)胞則被殺死)而言的;這種篩選方法有利于轉(zhuǎn)基因細(xì)胞的生長(zhǎng)及再生，而非轉(zhuǎn)基因細(xì)胞只受到饑餓抑制而非被殺死。因此，這種篩選策略即命名為正向篩選，包括以下幾種基因：異戊烯基轉(zhuǎn)移酶基因(isopentenyltransferasegene,ipt)，木糖異構(gòu)酶基因(xyloseisomerasegene,xylA)，磷酸甘露糖異構(gòu)酶基因(phosphomannoseisomerasegene,pmi)和大腸桿菌β-葡萄糖苷酸酶基因(β-glucuronidasegene,gus)。第52頁/共80頁

三、目的基因及其表達(dá)的分子鑒定

Southern法與PCR法檢測(cè)外源基因的整合

Nouthern與RT-PCR檢測(cè)外源基因的表達(dá)

Western雜交檢測(cè)外源基因表達(dá)蛋白的生成第53頁/共80頁第七節(jié)植物基因工程應(yīng)用舉例一、植物基因工程中的目的基因

植物基因工程中的目的基因大致可分以下幾類：

(1)抗植物病蟲害基因

(2)抗非生物脅迫、改良作物產(chǎn)品質(zhì)量的基因

(3)改變植物其他性狀的基因

(4)植物醫(yī)藥基因

第54頁/共80頁二、植物基因工程應(yīng)用舉例基因工程食品基因工程食品即轉(zhuǎn)基因食品（transgenicfood或geneticallymodifiedfoods,GMFs），美國(guó)食品藥品管理局（FDA）使用生物工程食品（bioengineeredfoods）一詞，歐洲使用“新型食品”（novelfoods）一詞把轉(zhuǎn)基因食品包括在內(nèi)。例如，隨著人民生活水平的不斷提高及大米對(duì)外貿(mào)易量的增加，稻米品質(zhì)的改良日益引起人們的關(guān)注。稻米品質(zhì)主要由碾磨品質(zhì)、外觀品質(zhì)、蒸煮食味品質(zhì)和營(yíng)養(yǎng)品質(zhì)所組成。第55頁/共80頁2009年10月，中國(guó)農(nóng)業(yè)部批準(zhǔn)了兩種轉(zhuǎn)基因水稻和一種轉(zhuǎn)基因玉米的安全證書，中國(guó)成為世界上首個(gè)批準(zhǔn)主糧轉(zhuǎn)基因種植的國(guó)家。農(nóng)業(yè)部批準(zhǔn)了的轉(zhuǎn)基因植酸酶玉米這個(gè)品種，由中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院生物技術(shù)研究所范云六院士所帶領(lǐng)的團(tuán)隊(duì)完成。該品種不抗蟲，不抗病。“植酸酶玉米”主要是提高玉米產(chǎn)量,能令生豬消化更多的磷，從而減少來自動(dòng)物糞便的污染,實(shí)現(xiàn)了以環(huán)保、節(jié)能的農(nóng)業(yè)生產(chǎn)方式生產(chǎn)“綠色磷”的夢(mèng)想。

第56頁/共80頁研究成果在玉米自交系改良中，國(guó)內(nèi)外學(xué)者利用花粉管通技術(shù)獲得的品種有30多個(gè)。1986年Ohta在美國(guó)科學(xué)道技術(shù)取得了大量有價(jià)值的成果，據(jù)統(tǒng)計(jì)，每年利用此院報(bào)上報(bào)道應(yīng)用外源DNA與玉米花粉混合授粉，得到F0轉(zhuǎn)化率高達(dá)10％的胚乳基因轉(zhuǎn)移。第57頁/共80頁研究者還在玉米自交系抗逆性上取得一定成果，例如丁群星等研究發(fā)現(xiàn)玉米矮花葉病毒(MDMV)B株外殼蛋白在轉(zhuǎn)基因植株中表現(xiàn)出對(duì)MDMV的抗性；張永勝等人還研究了將抗旱耐鹽基因以及抗葉斑病基因?qū)胗衩鬃越幌抵校@得了初步成功.第58頁/共80頁轉(zhuǎn)基因技術(shù)用于玉米品質(zhì)改良賴氨酸是玉米蛋白質(zhì)中限制性氨基酸，含量高低直接關(guān)系到玉米的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值。孫學(xué)輝等通過基因工程提高了玉米氨基酸的含量;Hoods等通過轉(zhuǎn)基因玉米生產(chǎn)雞蛋抗生素蛋白，并已進(jìn)入商業(yè)化生產(chǎn)；孫學(xué)輝等采用育成18個(gè)轉(zhuǎn)基因玉米自交系,蛋白質(zhì)含量達(dá)到13.2%～17.2％,賴氨酸含量達(dá)到0.38%～0.46％，解決了賴氨酸和蛋白質(zhì)不能同時(shí)提高的難題。第59頁/共80頁玉米谷氨酰胺轉(zhuǎn)胺酶基因的克隆及原核表達(dá)東北農(nóng)業(yè)大學(xué)從玉米嫩葉中提取總RNA，通過RT-PCR的方法擴(kuò)增出玉米谷氨酰胺轉(zhuǎn)胺酶(TGase)全長(zhǎng)基因，回收目的片段并測(cè)序，該基因編碼區(qū)全長(zhǎng)1605bp，編碼535個(gè)氨基酸殘基，分子量為60.9kD，與GenBank(登錄號(hào)：AJ421525)上已發(fā)表的序列同源性為100%。按正確的閱讀框架將玉米TGase基因片段定向克隆到表達(dá)載體pET-28a上，將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到大腸桿菌Rosetta(DE3)菌株，mmol/LIPTG誘導(dǎo)融合蛋白表達(dá)，經(jīng)凝膠分析軟件測(cè)得蛋白表達(dá)量約占總蛋白的15%，以His-Tag抗體作為一抗，采用Western-blot方法檢測(cè)目的蛋白，結(jié)果證明所表達(dá)的特異蛋白是帶有His-Tag的重組融合蛋白，利用Ni2+-NTA瓊脂糖樹脂親和層析柱純化目的蛋白，SDS鑒定為單一條帶，測(cè)得純化后的TGase酶活力達(dá)到16U/mg。第60頁/共80頁玉米淀粉分支酶sbe2a基因反義載體的構(gòu)建及其轉(zhuǎn)基因初步研究

我國(guó)現(xiàn)階段種植的玉米品種中直鏈淀粉含量很低,僅占總淀粉含量的25%左右。淀粉分支酶是淀粉生物合成過程中的一個(gè)關(guān)鍵酶,它催化葡萄糖以α-1,6鍵連接,形成分支結(jié)構(gòu).反義RNA(antisenseRNA,asRNA)技術(shù),調(diào)控淀粉分支酶基因的表達(dá),以期提高玉米中直鏈淀粉的含量.吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)應(yīng)用PCR技術(shù)克隆了玉米淀粉分支酶be2a基因片段,并將其克隆到pMD18-T載體,對(duì)重組子進(jìn)行PCR檢測(cè)和限制性內(nèi)切酶分析,并進(jìn)行序列比對(duì)。結(jié)果表明:克隆片段長(zhǎng)度為562bp。將該基因反向插入到pWGLL載體Actin-pro啟動(dòng)子下游,構(gòu)建高效反義表達(dá)載體,通過花粉管通道法將其導(dǎo)入玉米自交系“鐵7922”,經(jīng)PCR檢測(cè)初步證明外源基因已整合到玉米基因組中。第61頁/共80頁德國(guó)育出新型轉(zhuǎn)基因玉米可引蟲殺蟲

德國(guó)科學(xué)家培育出一種轉(zhuǎn)基因玉米，它可以通過釋放一種吸引線蟲的化學(xué)信號(hào)(一種來自牛至的(E)-β-石竹烯(EβG，這是一種能吸引線蟲的化學(xué)物質(zhì))合成基因)從而抵抗破壞性的根蟲蟲害，而線蟲正是甲蟲幼蟲的天敵。第62頁/共80頁轉(zhuǎn)基因玉米MON88017旁側(cè)序列分析及定性PCR檢測(cè)山東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所采用基因組步移法和巢式PCR方法研究轉(zhuǎn)基因玉米MON88017外源基因插入位點(diǎn)旁側(cè)序列特征,獲得了外源基因插入位點(diǎn)的左邊界旁側(cè)序列504bp,包括336bp的插入載體序列和68bp的玉米基因組序列。根據(jù)此旁側(cè)序列,設(shè)計(jì)MON88017轉(zhuǎn)化事件特異性引物并進(jìn)行定性PCR擴(kuò)增,擴(kuò)增片段為446bp,建立了轉(zhuǎn)基因玉米MON88017轉(zhuǎn)化體特異性檢測(cè)方法。該方法特異性強(qiáng)、靈敏度高(0.1%),為轉(zhuǎn)基因玉米品種MON88017進(jìn)出口檢測(cè)和標(biāo)識(shí)檢測(cè)提供了技術(shù)基礎(chǔ)。第63頁/共80頁轉(zhuǎn)基因水果“轉(zhuǎn)基因水果”將成口服疫苗.注射疫苗往往會(huì)在兒童和部分成年人身上引起痛苦，此外，一些疫苗保存需要冷凍，而一些邊遠(yuǎn)地區(qū)既沒有電，也沒有制冷設(shè)備，從而導(dǎo)致難以推行疫苗普及接種。現(xiàn)在這種情況有可能在未來10年內(nèi)成為歷史。李家洋院士透露，目前，世界上有上百名科學(xué)家正在尋求開發(fā)口服疫苗，他們正在努力獲得某種可人工控制的水果或蔬菜，人們?cè)诜眠@些水果或蔬菜后，會(huì)對(duì)某種病毒或特定的病菌產(chǎn)生抵抗力。目前正在研究的口服疫苗包括乙肝、狂犬病、結(jié)核病的疫苗等。李家洋院士說，國(guó)際上非常有名的“金米”就是個(gè)典型的例子，這種大米里面有維生素A。第64頁/共80頁草莓轉(zhuǎn)基因研究進(jìn)展草莓是一種經(jīng)濟(jì)價(jià)值較高的多年生草本植物,栽培面積和產(chǎn)量?jī)H次于葡萄的第二大漿果。草莓是繼核桃、蘋果之后,第3個(gè)獲得轉(zhuǎn)基因植株的果樹,從已有研究結(jié)果看,進(jìn)展較為迅速,目前已經(jīng)獲得了抗病、抗蟲、抗逆、抗除草劑和品質(zhì)改良等方面的轉(zhuǎn)基因植株。抗蟲害轉(zhuǎn)基因研究目前在草莓中應(yīng)用的抗蟲基因主要豇豆胰蛋白酶抑制劑基因(CpTi)。1992年,James等首先開展了草莓抗蟲轉(zhuǎn)基因研究,他們將與幾種鱗翅目和鞘翅目害蟲抗性有關(guān)的CpTi基因轉(zhuǎn)入草莓品種“Raoella”中,獲得了轉(zhuǎn)基因植株。藤象甲幼蟲飼喂試驗(yàn)結(jié)果表明,在轉(zhuǎn)基因植株上幼蟲的成活率為80%～90%。接著,Graham等將CpTi基因?qū)氩葺?在溫室中對(duì)其進(jìn)行生物學(xué)檢測(cè)表明轉(zhuǎn)化植株在第三年仍能有效的減少大田中藤象甲及其蟲蛹造成的損失,與對(duì)照相比,轉(zhuǎn)基因草莓的生長(zhǎng)明顯得到改進(jìn),藤象甲的數(shù)量大大減少。第65頁/共80頁RIP和TCS雙價(jià)轉(zhuǎn)基因草莓抗草莓鑲脈病毒鑒定

東北農(nóng)業(yè)大學(xué)園藝學(xué)院2008年用小葉嫁接法對(duì)農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化RIP(核糖體失活蛋白R(shí)ibosome-inactivatingprtein)和TCS(天花粉蛋白Trichosanthin,是核糖體失活蛋白的一種,它是中草藥天花粉的有效成分,天花粉蛋白不但在醫(yī)學(xué)方面有很重要的價(jià)值,而且與植物的防御反應(yīng)相關(guān),它對(duì)病毒、真菌和昆蟲有直接或間接的抑制和殺滅作用。)雙價(jià)抗病毒基因所獲得的草莓品種森嘎拉和戈雷拉轉(zhuǎn)基因植株接種草莓鑲脈病毒,采用PCR方法檢測(cè)嫁接成活后的轉(zhuǎn)基因草莓苗草莓鑲脈病毒。結(jié)果表明:這2個(gè)品種的轉(zhuǎn)基因植株均有部分植株未擴(kuò)增出草莓鑲脈病毒特異條帶,說明轉(zhuǎn)入的外源基第66頁/共80頁草莓a(chǎn)nnfaf基因反義融合表達(dá)載體構(gòu)建及轉(zhuǎn)基因植株的獲得大連理工大學(xué)生物工程學(xué)院2006年建立研究草莓果實(shí)膜聯(lián)蛋白基因annfaf功能體系。利用反義基因技術(shù)將從草莓成熟果實(shí)中分離克隆的annfaf基因定向克隆至植物中間表達(dá)載體pROKⅡ，構(gòu)建了annfaf反義融合基因植物表達(dá)載體pRRJ4，通過根癌農(nóng)桿菌EHA105將其導(dǎo)入草莓基因組。對(duì)獲得的抗性植株進(jìn)行PCR和Southern檢測(cè)分析。表明該反義基因已整合到草莓基因組中。第67頁/共80頁根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)褪黑素基因草莓的獲得2009年陜西省生物技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室以草莓品種“早紅”葉片和葉柄為外植體,通過根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)法將褪黑素合成關(guān)鍵酶N-乙酰轉(zhuǎn)移酶(AANAT)和羥吲哚-O-甲基轉(zhuǎn)移酶(HIOMT)基因AANAT和HIOMT轉(zhuǎn)入草莓基因組,并對(duì)獲得的抗性植株進(jìn)行PCR和PCR-Southernblot檢測(cè)分析,結(jié)果表明外源基因已經(jīng)整合進(jìn)草莓基因組中。RT-PCR分析證明外源基因已經(jīng)在轉(zhuǎn)錄水平表達(dá)。第68頁/共80頁轉(zhuǎn)基因花卉植物一家花卉公司的廣告這樣說道：“你想擁有一束藍(lán)色的月季嗎？你想訂購(gòu)一束長(zhǎng)開不敗的鮮花嗎？你想要怎樣的一束鮮花，只要你描繪一下心中的形象，我們便能為你創(chuàng)造出你想的花卉……”大家聽了或許會(huì)感到奇怪：月季怎么會(huì)有藍(lán)色的？花兒怎可能長(zhǎng)開不敗？這是不是騙人公司？不，這是事實(shí)！這是一種運(yùn)用新型的生物技術(shù)創(chuàng)造出來的一種轉(zhuǎn)基因花。這種花不但有以上特性，還有許多奇妙的性狀，如果你想了解這五彩繽紛的花，就讓我《送你一束轉(zhuǎn)基因花》

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花色是給人們的第一印象，人們看花，首先是觀花色。

花色豐富多彩是轉(zhuǎn)基因花卉的一個(gè)重要特征。現(xiàn)在人們已經(jīng)能夠通過轉(zhuǎn)基因技術(shù)任意改變和調(diào)整花的顏色。

湖北大學(xué)生物科學(xué)院“特異花卉克隆與基因工程創(chuàng)新”科研課題，最近取得重大進(jìn)展。他們通過研究發(fā)現(xiàn)，只要通過基因工程技術(shù)破譯出花的色素基因，將花色基因和可調(diào)節(jié)基因克隆出來，導(dǎo)入所需培育的花卉里面，就可以培育出特異花卉，形成一花多色甚至是“七色花”。

現(xiàn)在選育成功的情侶夜來香、大麗菊、蝴蝶蘭、桃花等特異花，開出了2種至3種顏色、條紋狀與星點(diǎn)狀組合的花朵，其觀賞性是普通花難以比擬的。目前，課題組正利用已發(fā)現(xiàn)的名貴花卉變異體現(xiàn)象，把郁金香、洋牡丹、蘭花、劍蘭等世界10種名貴花卉和中國(guó)10大名花變成特異花卉，同時(shí)研究創(chuàng)造能在黑夜里發(fā)光的“夜光蘭”新類型花卉。

第70頁/共80頁花色主要由類黃酮、類胡蘿卜素和甜菜色素三大類色素決定，這些色素一般存在于液泡中。其中，類黃酮色素中的花色素對(duì)花色形成起主要作用，控制著花的粉紅色、紅色、紫羅蘭色和藍(lán)色。目前已克隆出許多影響花色苷代謝的基因，例如歐芹的CHS、金魚草的DFR、矮牽牛的pH6基因等。研究人員在此基礎(chǔ)上采用反義RNA技術(shù)、共抑制技術(shù)及過量表達(dá)新基因等技術(shù)手段已實(shí)現(xiàn)了對(duì)花色的修飾。1987年，有人將調(diào)控黃酮生物合成的基因?qū)氚珷颗＃蛊洚a(chǎn)生新的顏色———磚紅色，首次實(shí)現(xiàn)了對(duì)花色的調(diào)控。苯基苯乙烯酮合成酶（CHS）是花色素合成的限制酶，其表達(dá)量的變化影響花色的形成。1998年，有人將反義CHS基因轉(zhuǎn)化矮牽牛，抑制其色素合成系統(tǒng)，使花色由紫色變?yōu)榘咨２捎猛瑯拥姆椒ǎ?994年，有人轉(zhuǎn)化粉色菊花而得到白色菊花，檢測(cè)到白色中CHS合成酶前體大量積累，可能是CHS合成酶受到抑制。1996年，邵莉等人采用共抑制方法，通過CHS基因的導(dǎo)入得到了白紫色相間的矮牽?；蚧ā?000年，日本科學(xué)家將反義DFR和反義CHS基因?qū)胨{(lán)豬耳，發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)反義DFR基因的藍(lán)豬耳花色更藍(lán)，這可能與DFR被抑制引起黃酮類物質(zhì)積累有關(guān)。得4國(guó)一家公司的研究人員發(fā)現(xiàn)月季不能呈現(xiàn)藍(lán)色是由于自身不含編碼藍(lán)色素基因。該公司將分離的相關(guān)基因?qū)氚珷颗＃?991年）、月季及康乃馨、菊花、薔薇（1995年），均得到理想結(jié)果。在很多植物中，花色也受到花瓣細(xì)胞液泡中pH值的影響。1995年，有人利用玉米轉(zhuǎn)座子Ac元件從矮牽牛中分離到調(diào)控花瓣pH值的基因pH6，該基因通過調(diào)控液泡中的pH值來影響花色素苷的表達(dá)。進(jìn)一步采用反義RNA技術(shù)抑制月季中的pH6基因，使液泡中的pH值升高，從而迎來了藍(lán)色月季的誕生。

第71頁/共80頁轉(zhuǎn)基因花卉的形態(tài)也會(huì)千變?nèi)f化

花卉形態(tài)是花卉的重要組成部分，因此，改良花卉形態(tài)長(zhǎng)期以來一直是科學(xué)工作者研究的重點(diǎn)之一?；ɑ苄螒B(tài)改良包括花器官形態(tài)、花枝著生狀態(tài)、花序類型、植株形態(tài)的改良等。轉(zhuǎn)基因育種研究在改變形態(tài)方面也取得了進(jìn)展。德國(guó)研究人員將一種基因?qū)胨N薇，使植株枝數(shù)和花數(shù)大幅度增加