細(xì)胞染色體顯示和分帶技術(shù)

細(xì)胞染色體顯示和分帶技術(shù)第1頁，共26頁，2023年，2月20日，星期二第一節(jié)性染色質(zhì)檢測(cè)在間期細(xì)胞核中，女性X染色質(zhì)和男性Y染色質(zhì)均可用特殊染色法顯示出來,性染色質(zhì)檢查方法如下:第2頁，共26頁，2023年，2月20日，星期二一、X染色質(zhì)顯示法女性：X染色質(zhì)：Barr氏體位于間期細(xì)胞核內(nèi)面，呈三角形或半月形小體，易被碳酸復(fù)紅或硫堇等染料著色結(jié)果：細(xì)胞質(zhì)不著色，細(xì)胞核染成紫紅色，核內(nèi)Barr小體呈三角形/半月形。第3頁，共26頁，2023年，2月20日，星期二二、Y染色質(zhì)顯示法男性：Y染色質(zhì)：鹽酸阿的平染色法結(jié)果：Y染色質(zhì)呈特別明亮的黃綠色熒光園點(diǎn)，可位于核內(nèi)任何位置，但多見于中央部位，第4頁，共26頁，2023年，2月20日，星期二第二節(jié)培養(yǎng)細(xì)胞染色體

顯示法

一、原理顯示染色體要選擇分裂中期細(xì)胞，因細(xì)胞分裂處于中期時(shí)，染色體的長短和大小恰到好處，是研究染色體的最好階段。獲得多量的中期分裂相及染色體分散均勻的理想分裂相可采取的措施如下:第5頁，共26頁，2023年，2月20日，星期二1．提高細(xì)胞分裂相數(shù)（1）細(xì)胞的選擇和處理大多數(shù)傳代細(xì)胞應(yīng)選擇對(duì)數(shù)生長期的細(xì)胞。初代淋巴細(xì)胞常用有絲分裂源PHA、ConA等刺激細(xì)胞。（2）阻抑中期分裂用秋水仙素(Colchicine)，現(xiàn)常用它的衍生物秋水仙胺(Colcemid)來破壞細(xì)胞有絲分裂中的紡錘絲，以發(fā)揮阻抑分裂中期的作用。由于DNA合成并無干擾，因此隨時(shí)間延長可截獲很多中期分裂相，一般的用量：秋水仙素0.04～0.8mg/L培養(yǎng)液，秋水仙胺0.004～0.08mg/L培養(yǎng)液。作用時(shí)間為2～6小時(shí)。第6頁，共26頁，2023年，2月20日，星期二2．促染色體分散措施

（1）低滲處理一般用0.075mol/L，在37℃水浴中將上述細(xì)胞處理20～40分鐘，可使細(xì)胞體積脹大，染色體松散。（2）固定常用醋酸甲醇(1:3)混合液，用時(shí)現(xiàn)用現(xiàn)配。顯示染色體方法很多，以下幾種方法較為常用。第7頁，共26頁，2023年，2月20日，星期二二、傳代細(xì)胞染色體檢查

一、原理：秋水仙堿可使細(xì)胞停止在分裂中期，染色體長短恰倒好處。二、方法：細(xì)胞類型：傳代細(xì)胞系，外周血LC，羊水，絨毛細(xì)胞等方法：秋水仙素低滲固定染色鏡檢第8頁，共26頁，2023年，2月20日，星期二末梢血培養(yǎng)法，Giemsa染色法顯示人染色體第9頁，共26頁，2023年，2月20日，星期二第三節(jié)染色體結(jié)構(gòu)顯示和檢測(cè)一、染色體顯帶原理和種類二、染色體顯帶方法要點(diǎn)三、原理四、常用染色體顯帶法五、姐妹染色單體分化染色第10頁，共26頁，2023年，2月20日，星期二一、染色體顯帶原理和種類（一）原理染色體顯帶是沿著整個(gè)染色體的長軸，能顯現(xiàn)出著色深淺不同。橫行走向的帶(Band)經(jīng)特殊染色后，易著色的陽性帶(PositiveBand)為含有A-T多的染色體節(jié)段，相反，G-C多的則不易著色，為陰性帶(NegativeBand)。有報(bào)道，已被定位的正?；蚝彤惓；蚪^大部分都在陰性帶區(qū)。人們推測(cè)，看家基因在陰性區(qū)帶，人染色體能顯示出近2000個(gè)G帶。第11頁，共26頁，2023年，2月20日，星期二（二）種類

染色體顯帶是指沿著整個(gè)染色體軸能出現(xiàn)著色深淺不同的橫紋。根據(jù)顯帶方法不同可分為：用奎吖因(QM)、阿的平(QD)熒光染色的帶，稱“Q”帶；用Giemsa染色顯帶稱“G”帶；用Giemsa染色顯示異染色質(zhì)部分稱“C”帶；用特殊方法處理后，顯現(xiàn)出與Q帶和G帶相反的帶型稱“K”帶等。目前，Q、G和C三種帶型較為常用，其中G帶更為多用。第12頁，共26頁，2023年，2月20日，星期二二、染色體顯帶方法要點(diǎn)“老化”處理：將染色體制片后存放3~10分鐘或86℃干燥20～30分鐘顯Q帶法：用奎吖因(QM)或阿的平(QM)染色顯帶Giemsa顯G帶：胰酶消化Giemsa染色顯帶顯C帶法：在預(yù)熱至65℃的5%Ba(OH)2液中15分鐘Giemsa染色15分鐘顯帶注意：1、標(biāo)本片老化處理很重要；2、胰酶濃度和消化時(shí)間要事先熟知，消化要充分但不能過度；3、中期分裂相要多而均勻，稍長一些為佳第13頁，共26頁，2023年，2月20日，星期二1．中期染色體

為了獲得滿意的顯帶效果，需制備質(zhì)量好的中期染色體標(biāo)本，即須達(dá)到以下要求：①長度適宜，一般稍長一些，能顯出更多的條帶，這與加入秋水仙素的濃度和作用時(shí)間有關(guān)，要控制好。②染色體分散均勻無重疊，這與低滲有關(guān)，低滲不足染色體易發(fā)生重疊，過度易流失。③無嚴(yán)重單體分叉。第14頁，共26頁，2023年，2月20日，星期二2．特殊處理

中期染色體標(biāo)本顯帶效果的提高要經(jīng)三個(gè)步驟：（1）標(biāo)本片應(yīng)先放置一段時(shí)間，稱“老化”處理，以3～10天為宜。（2）顯帶染色前要將標(biāo)本加溫預(yù)處理利于顯帶，預(yù)處理后的標(biāo)本不必再老化。常用80℃干燥20～30分鐘。（3）胰蛋白酶消化較好(比用NaOH、尿素等好)。第15頁，共26頁，2023年，2月20日，星期二三、常用染色體顯帶法1．顯Q帶法（1）將標(biāo)本片于pH6.0緩沖液中浸5～10分鐘后，再轉(zhuǎn)浸入用Soresen氏緩沖液(pH6.0)配制的0.2%的QD或QM染液中染色5～10分鐘(見表12-3-1)。（2）用pH6.0的磷酸緩沖液漂洗2次，每次5分鐘，于玻片上滴加1～2滴新鮮緩沖液，加蓋片。（3）在熒光顯微鏡下觀察。第16頁，共26頁，2023年，2月20日，星期二表12-3-1Soresen(100ml)緩沖液PHNa2HPO4(1/15mol/L)kH2PO4(1/15m0l/L)pHNa2HPO4(1/15mol/L)kH2HPO4(1/15mol/L)5.292.597.56.8150505.595956.9860405.9110907.1770306.2420807.3880206.4736747.7390106.6440608.04955第17頁，共26頁，2023年，2月20日，星期二2．胰酶一Giemsa顯G帶法(1)將中期染色體標(biāo)本于60～80℃烘箱中烘24小時(shí)或過夜，然后再浸入0.025m磷酸緩沖液中(pH6.8)，56℃溫浴10分鐘后，用現(xiàn)配的胰酶一Giemsa混合液消化和染色10～30分鐘，染色后用自來水沖洗，再用蒸餾水漂洗數(shù)次，涼干，二甲苯透明2～3分鐘，封入中性樹脂中。(2)將標(biāo)本放于40～80℃烤箱中數(shù)小時(shí)或更長，用0.25%胰蛋白酶熱消化7～15分鐘，并不斷輕輕擺動(dòng)玻片，水洗后再用Giemsa染液染5～10分鐘，用自來水沖洗，蒸餾水漂洗，涼干，二甲苯透明2～3分鐘，封入中性樹脂中。第18頁，共26頁，2023年，2月20日，星期二3．顯C帶法

將中期染色體玻片先投入預(yù)熱至65℃的5%Ba(OH)2液中15分鐘，取出玻片用自來水沖洗后，再將玻片投入預(yù)熱至65℃的2×SCC液中1小時(shí)10分鐘，待自來水沖洗后再過pH7.4磷酸沖液，用Giemsa染色15分鐘后鏡檢。附：2×SCC液配方：稱NacL17.5g和枸椽酸鈉8.82g液于1000mL蒸餾水中。

5%Ba(OH)2：稱Ba(OH)22.5g溶于50mL生理鹽水中。必須注意：①胰蛋白酶消化顯帶過程中，消化不足，帶不出現(xiàn)。②消化過度，染色體變得膨脹和不著色。③要注意胰蛋白酶濃度和消化時(shí)間。④預(yù)處理或老化是顯帶的重要環(huán)節(jié)，干熱處理簡(jiǎn)單易行，效果好。（見書后照片6）第19頁，共26頁，2023年，2月20日，星期二末梢血培養(yǎng)法，Giemsa染色分帶法顯示人染色體第20頁，共26頁，2023年，2月20日，星期二人染色體G帶第21頁，共26頁，2023年，2月20日，星期二慢性粒細(xì)胞白血病患者骨髓細(xì)胞PH染色體核型第22頁，共26頁，2023年，2月20日，星期二四、姐妹染色單體分化染色

(一)原理細(xì)胞被培養(yǎng)在含有5-溴脫氧尿苷(5-BromodeOxyurdine;BUdR)的培養(yǎng)基中，當(dāng)細(xì)胞DNA合成時(shí)，BUdR取代胸腺嘧啶核苷(Thymidine.TdR)進(jìn)入細(xì)胞增殖周期，第一周期每條染色單體DNA雙鏈都被BUdR摻入(TB、TB)，第二周期只有一條單體保留了無BUdR舊鏈，另一條單體雙鏈都有BUdR(TB、TB)，經(jīng)熒光染料著色時(shí)TB有強(qiáng)熒光，BB熒光弱。第23頁，共26頁，2023年，2月20日，星期二(二)方法(二)方法1.制片：細(xì)胞培養(yǎng)時(shí)加入BUdR，淋巴細(xì)胞于3