細菌病毒培養(yǎng)技術(shù)

細菌病毒培養(yǎng)技術(shù)第1頁，共49頁，2023年，2月20日，星期二①對氧氣要求：專性需氧菌微需氧菌兼性厭氧菌

專性厭氧菌②對CO2要求：5%CO2①水②碳源③氮源④無機鹽⑤生長因子有些細菌需要（一）細菌生長繁殖的條件4、對氣體要求

4、PH1、營養(yǎng)物質(zhì)2、溫度3、滲透壓第2頁，共49頁，2023年，2月20日，星期二第3頁，共49頁，2023年，2月20日，星期二（二）細菌生長繁殖的方式二分裂法繁殖方式：鏈球菌八疊球菌葡萄球菌第4頁，共49頁，2023年，2月20日，星期二（三）細菌生長繁殖的速度第5頁，共49頁，2023年，2月20日，星期二（四）細菌生長繁殖的速度

分為四期：遲緩期、對數(shù)期、穩(wěn)定期、衰退期第6頁，共49頁，2023年，2月20日，星期二（五）常用培養(yǎng)基種類厭氧培養(yǎng)基基礎(chǔ)培養(yǎng)基增菌培養(yǎng)基選擇培養(yǎng)基鑒別培養(yǎng)基第7頁，共49頁，2023年，2月20日，星期二細菌培養(yǎng)技術(shù)

1細菌的培養(yǎng)基本知識2細菌的規(guī)?；囵B(yǎng)3細菌的計數(shù)技術(shù)第8頁，共49頁，2023年，2月20日，星期二二、細菌的規(guī)?；囵B(yǎng)種子接種

是指菌體增殖培養(yǎng)物。收獲時間

最佳培養(yǎng)時間依據(jù)細菌的生長曲線而定。對數(shù)生長期第9頁，共49頁，2023年，2月20日，星期二培養(yǎng)方法1．固體培養(yǎng)基表面培養(yǎng)法

用于制備抗原、滅活苗、凍干苗。2．液體靜置培養(yǎng)法

需氧菌（深度1/2）和兼性厭氧均可用，厭氧菌（深度3/4），還需加肝塊。3．深層通氣培養(yǎng)法

是目前菌苗生產(chǎn)的主要培養(yǎng)法。安裝有自動控溫、消泡、調(diào)pH、自動控制通氣量、自動磁力攪拌等裝置。細菌接種1～2h，再通入濾過除菌空氣，并適當(dāng)攪拌分散通入的氣體，以增加培養(yǎng)液中的溶氧量。及時補充營養(yǎng)。第10頁，共49頁，2023年，2月20日，星期二4．透析培養(yǎng)法在細菌培養(yǎng)液與培養(yǎng)基之間隔有一層透析膜，使培養(yǎng)基中高濃度小分子量的營養(yǎng)成分通過透析膜（不能透過大分子的細菌或毒素）不斷擴散到細菌培養(yǎng)液中，供細菌生長繁殖，獲得高濃度的細菌或毒素。透析器1.螺栓2.培養(yǎng)基貯存室3.視鏡4.透析膜5.培養(yǎng)室第11頁，共49頁，2023年，2月20日，星期二5、連續(xù)培養(yǎng)

連續(xù)培養(yǎng)系統(tǒng)是一個恒定體積的流動系統(tǒng)，新鮮培養(yǎng)基以恒定的速度流入，又以相同的速率流出除去多余的液體，細菌始終保持在對數(shù)生長期。第12頁，共49頁，2023年，2月20日，星期二細菌培養(yǎng)技術(shù)

1細菌的培養(yǎng)基本知識2細菌的規(guī)模化培養(yǎng)3細菌的計數(shù)技術(shù)第13頁，共49頁，2023年，2月20日，星期二三細菌的計數(shù)技術(shù)細菌性疫苗在制造中，往往需要計算每毫升所含細菌的總數(shù)。

1.顯微鏡直接計數(shù)法2.活菌計數(shù)法傾注平板培養(yǎng)法將被測樣品根據(jù)菌數(shù)含量多少，用普通肉湯或生理鹽水作10倍遞進稀釋。分別取其1ml加在滅菌的平皿中，然后取預(yù)先加熱融化且冷至45～50℃，立即搖勻放平，凝固后培養(yǎng)，統(tǒng)計平皿上長出的菌落數(shù)，乘以稀釋倍數(shù)，即為每毫升樣品中含有的活菌數(shù)。第14頁，共49頁，2023年，2月20日，星期二平板表面散布法

接種量為0.1ml

瓊脂板的制備稀釋菌液接種培養(yǎng)計數(shù)選擇菌落數(shù)在30～300之間的平皿用以計數(shù)，每個稀釋度應(yīng)取其菌落平均數(shù)。

活菌數(shù)／ml=2個平板平均菌落數(shù)×10×稀釋倍數(shù)。舉例：在10稀釋的平板中所得平均菌落數(shù)為78個。計算結(jié)果：78×10×10

=7.8×10個活菌／ml微量點板計數(shù)法

接種量為0.02ml10-8-8第15頁，共49頁，2023年，2月20日，星期二

3比濁計數(shù)法

是對比細菌懸液與標準管的濁度，求出大致的菌數(shù)。原理：菌液中含數(shù)多少與其渾濁度成正比。方法：比濁管比濁法和分光光度計法。優(yōu)點：快速簡便應(yīng)用：常用于菌苗及其他生物制劑的生產(chǎn)、細菌毒力的測定和攻毒量的確定等。第16頁，共49頁，2023年，2月20日，星期二標準比濁法比濁管由國家生物制品檢定部門提供，每套包括一支細菌比濁標準管、數(shù)支對照空管和一張比濁用的圖片。比濁方法將空管拭刷干凈，加入待測菌液1ml。將標準管與待測管并列緊貼在圖片前，使兩管受光均勻，然后透過兩管管壁對比觀察，目測圖片的清晰度，并將兩管左右換位，反復(fù)對比。例如：測定大腸桿菌的菌數(shù)，若1ml菌液加入4ml的生理鹽水后，與標準管的濁度相同，即表示該菌液經(jīng)5倍稀釋后相當(dāng)于標準管。大腸桿菌標準管的菌數(shù)相當(dāng)于8億個／ml，故被測菌數(shù)為8×5=40億個／ml。第17頁，共49頁，2023年，2月20日，星期二分光光度計法借助于分光光度計。在一定波長下測定菌液的光密度值注意：測量時一定要控制菌濃度與光密度成正比的線性范圍內(nèi)，否則不準確。第18頁，共49頁，2023年，2月20日，星期二病毒培養(yǎng)技術(shù)

1病毒的復(fù)制2病毒的動物培養(yǎng)技術(shù)3病毒的禽胚培養(yǎng)技術(shù)4病毒的細胞培養(yǎng)技術(shù)第19頁，共49頁，2023年，2月20日，星期二

病毒復(fù)制：以病毒基因為模板，在酶的作用下，分別合成基因和蛋白質(zhì)，再組裝成完整的蛋白顆粒，這種方式稱為復(fù)制（replication)。第20頁，共49頁，2023年，2月20日，星期二吸附侵入早期：病毒特異性酶的合成病毒核酸復(fù)制病毒結(jié)構(gòu)蛋白質(zhì)合成裝配釋放病毒大分子合成第21頁，共49頁，2023年，2月20日，星期二病毒培養(yǎng)技術(shù)

1病毒的復(fù)制2病毒的動物培養(yǎng)技術(shù)3病毒的禽胚培養(yǎng)技術(shù)4病毒的細胞培養(yǎng)技術(shù)第22頁，共49頁，2023年，2月20日，星期二1

病毒的動物培養(yǎng)技術(shù)動物的選擇應(yīng)當(dāng)選擇SPF動物。選擇動物的條件下：①選用對病毒易感性高。②動物健康、體重、年齡盡可能一致，符合培養(yǎng)病毒要求。③遺傳特性相似，實驗結(jié)果具有一致性、準確性和可比性。④外購動物要了解當(dāng)?shù)貏游锶航】担曫B(yǎng)及免疫接種情況，接前要經(jīng)過健康觀察，以免誤用帶有病原體動物。第23頁，共49頁，2023年，2月20日，星期二1.皮內(nèi)接種2.皮下接種3.肌肉接種4.靜脈接種5.腹腔接種動物接種途徑和方法第24頁，共49頁，2023年，2月20日，星期二

動物接種后的飼養(yǎng)管理與收獲病毒

1.接種病毒后的動物,每天觀察和檢查規(guī)定的各項指標，主要有精神、食欲、糞便、尿液、被毛狀態(tài)、活動情況和接種部位的局部反應(yīng)，每天測體溫1次，做好記錄。

2.出現(xiàn)反應(yīng)癥候動物，按規(guī)定方法剖殺，采取含病毒高的組織臟器。第25頁，共49頁，2023年，2月20日，星期二病毒培養(yǎng)技術(shù)

1病毒的復(fù)制2病毒的動物培養(yǎng)技術(shù)3病毒的禽胚培養(yǎng)技術(shù)4病毒的細胞培養(yǎng)技術(shù)第26頁，共49頁，2023年，2月20日，星期二2

病毒的禽胚培養(yǎng)技術(shù)工序過程：如何完成此項任務(wù)？選擇禽胚前孵育接種后孵育收獲病毒第27頁，共49頁，2023年，2月20日，星期二操作要點1禽胚的選擇理想的禽胚是SPF雞胚，常以非免疫雞胚補充。2禽胚的接種前孵育孵化前消毒，溫度37.5～38.5℃，相對濕度50%～60%，定時翻蛋，保證通風(fēng)。孵化4～5d照蛋檢查，淘汰無精蛋和死胚，孵化至所培養(yǎng)病毒需要的日齡即可接種。

第28頁，共49頁，2023年，2月20日，星期二3

禽胚的接種途徑痘病毒和皰疹病毒，10～13日齡

流感、新城疫、傳支等，9～11日齡鸚鵡熱衣原體和立克次氏體等，6～8日齡正粘病毒和副粘病毒，10～11日齡第29頁，共49頁，2023年，2月20日，星期二4禽胚的接種后孵育

接種后，蠟淚封孔，置37℃下孵化，每天照蛋2次以上，通過禽胚的病變初步確定病毒的存在及增殖情況，淘汰24h內(nèi)死胚。操作要點病毒感染指征：死亡充血、出血或出現(xiàn)壞死灶畸形出現(xiàn)痘斑第30頁，共49頁，2023年，2月20日，星期二5病毒的收獲

操作要點

絨毛尿囊膜接種

尿囊膜接種卵黃囊接種羊膜腔接種第31頁，共49頁，2023年，2月20日，星期二照蛋任務(wù)實例—病毒的尿囊腔接種培養(yǎng)技術(shù)第32頁，共49頁，2023年，2月20日，星期二尿囊腔接種法第33頁，共49頁，2023年，2月20日，星期二接種部位消毒任務(wù)實例—病毒的尿囊腔接種培養(yǎng)技術(shù)第34頁，共49頁，2023年，2月20日，星期二尿囊腔接種任務(wù)實例—病毒的尿囊腔接種培養(yǎng)技術(shù)第35頁，共49頁，2023年，2月20日，星期二第36頁，共49頁，2023年，2月20日，星期二收獲尿囊液—每枚雞胚收獲尿囊液6～8ml任務(wù)實例—病毒的尿囊腔接種培養(yǎng)技術(shù)第37頁，共49頁，2023年，2月20日，星期二第38頁，共49頁，2023年，2月20日，星期二病毒培養(yǎng)技術(shù)

1病毒的復(fù)制2病毒的動物培養(yǎng)技術(shù)3病毒的禽胚培養(yǎng)技術(shù)4病毒的細胞培養(yǎng)技術(shù)第39頁，共49頁，2023年，2月20日，星期二細胞培養(yǎng)技術(shù)（cellculture)

細胞培養(yǎng)技術(shù)是選用各種細胞的最佳生存條件對活細胞進行培養(yǎng)和研究的技術(shù)。即：利用機械、酶或化學(xué)方法使活體動物組織或傳代細胞分散成單個乃至2～4個細胞團懸液的培養(yǎng)，使之能繼續(xù)生存、生長、增殖的一種方法。廣義上:還包括組織培養(yǎng)、器官培養(yǎng)。第40頁，共49頁，2023年，2月20日，星期二3病毒的細胞培養(yǎng)技術(shù)細胞培養(yǎng)的方式原代培養(yǎng)：從直接取自生物體細胞、組織或器官開始的培養(yǎng)。

次代培養(yǎng)：將原代細胞培養(yǎng)物輕微消化后，再洗下分裝至含新鮮培養(yǎng)液的培養(yǎng)管中繼續(xù)培養(yǎng)。傳代培養(yǎng)：將培養(yǎng)細胞以一個培養(yǎng)瓶轉(zhuǎn)移或移植到另一個培養(yǎng)瓶中進行培養(yǎng)。

第41頁，共49頁，2023年，2月20日，星期二培養(yǎng)常用的細胞上皮細胞、成纖維細胞根據(jù)培養(yǎng)細胞的染色體和繁殖特性，可分為：⑴原代細胞直接利用新鮮動物組織經(jīng)胰蛋白酶消化、分散，獲得單個細胞，如雞胚成纖維細胞，此細胞對病毒的檢測最為敏感，但制備和應(yīng)用不方便。

⑵二倍體細胞（細胞株）由原代細胞或次代細胞選育出具有特殊生物學(xué)性質(zhì)和標記的細胞，如豬腎細胞株（PK-15）和乳倉鼠腎細胞株（BHK-21）等。適用于病毒性生物制品的制備，常用于疫苗生產(chǎn)，安全可靠。

⑶傳代細胞（非二倍體細胞系、異倍體細胞）指不再保持原來細胞的二倍體細胞數(shù)，在體外可以無限傳代的細胞，如人子宮癌細胞（HeLa細胞）和鼠腎腺癌細胞（RAG細胞）等。有致癌性，不能用于疫苗生產(chǎn)，多用于病毒的分離鑒定。

第42頁，共49頁，2023年，2月20日，星期二1.培養(yǎng)液：生長液、維持液，Eagle氏液、RPMI-1640、199、DMEM、MEM等營養(yǎng)液

。2.細胞接種量:適宜。3.pH：一般為7.0～7.4因細胞種類不同而略有差異。4.溫度：一般為37～38℃。5.氣體：氧氣和二氧化碳。6.無菌條件：培養(yǎng)的全過程都要求嚴格的無菌條件。細胞培養(yǎng)的基本條件第43頁，共49頁，2023年，2月20日，星期二各種組織是靠細胞間質(zhì)黏合而成的，要獲得分散的細胞，必須破壞細胞間質(zhì)。分散細胞的方法的三種：機械分散法：適用于細胞間連接較松的組織，如禽胚組織。

酶消化法：此法適用于原代細胞的制備及細胞的傳代培養(yǎng)。螯合劑分散法：一般只用于單層細胞的分散。

分散細胞的方法第44頁，共49頁，2023年，2月20日，星期二

1.單層細胞培養(yǎng)法

用胰酶將剪碎的組織或傳代細胞分散成2～6個成團的細胞，接種到培養(yǎng)瓶或培養(yǎng)板上，讓細胞貼壁生長，靜置培養(yǎng)或轉(zhuǎn)瓶生長培養(yǎng)。

2.懸浮細胞培養(yǎng)法（攪拌培養(yǎng)）

通過振蕩或轉(zhuǎn)動裝置使細胞始終分散懸浮于培養(yǎng)