實驗室設備和一般技術

組織培養(yǎng)實驗室的面積大小和裝備程度取決于兩個因素：一是所要進行的實驗的性質二是所能得到的經(jīng)費的多少

現(xiàn)在是1頁\一共有65頁\編輯于星期三標準的組織培養(yǎng)實驗室應當具備設施1.玻璃器皿、塑料器皿和其他實驗器皿的清洗和貯存；2.培養(yǎng)基的制備、滅菌和貯存；3.植物材料的無菌操作；4.將培養(yǎng)物保持在溫度、光照、可能時還有濕度的可控條件下；5.培養(yǎng)物的觀察。

現(xiàn)在是2頁\一共有65頁\編輯于星期三第一節(jié)實驗室設計和常用設備第二節(jié)器皿用具第三節(jié)培養(yǎng)條件

現(xiàn)在是3頁\一共有65頁\編輯于星期三第一節(jié)實驗室設計和常用設備一、實驗室設計洗滌室、準備室、滅菌室、緩沖室、無菌操作室、培養(yǎng)室、細胞學實驗室、攝影室等分室，另加馴化室、溫室或大棚。當規(guī)模小、條件差的情況下，全部工序也可在一間室內完成?，F(xiàn)在是4頁\一共有65頁\編輯于星期三現(xiàn)在是5頁\一共有65頁\編輯于星期三（一）準備室準備室（又稱化學實驗室），要求20m2左右，明亮，通風。任務——器皿洗滌，培養(yǎng)基配制、分裝、高壓滅菌，材料預處理，重蒸餾水的制備等。同時兼顧試管苗出瓶。需安裝一個較大的水池，水泥制作，白瓷磚砌內外表面，池底放一張橡膠墊，以減少玻璃器皿的破損。下水道應暢通，以免妨礙工作。大型工作臺1-2張，大桌子1-2張。玻璃櫥1-3個，用以放置藥品、培養(yǎng)瓶和物品等。此外還應有化學藥劑，儀器設備，各種器皿，烘箱、冰箱、天平、酸度計、蒸餾水發(fā)生器或純水發(fā)生器、高壓滅菌器、電爐、不銹鋼鍋、培養(yǎng)基分注器、盆與桶等?，F(xiàn)在是6頁\一共有65頁\編輯于星期三（二）緩沖室

為避免進出時帶進雜菌，無菌室外應設置緩沖室，面積約3m2-5m2。進入無菌室前需在緩沖室里換上經(jīng)過滅菌的衛(wèi)生服、拖鞋，戴上口罩。最好安裝1盞紫外燈，用以滅菌。墻上設衣帽鉤，門邊擺拖鞋或設1鞋箱。還應安裝1個配電板，其上設保險絲盒、閘刀開關、插座以及石英電力時控器等。石英電力時控器是自動開關燈的設備，將它和交流接觸器安裝在電路里就可以自動控制每天的光照時數(shù)。現(xiàn)在是7頁\一共有65頁\編輯于星期三（三）無菌操作室簡稱無菌室或接種室，10m2-20m2，具體視生產(chǎn)規(guī)模和超凈工作臺數(shù)量而定。是組培室最關鍵的部分。門窗要密閉，一般用移動門窗，以減少空氣的擾動。安裝紫外燈空調操作臺和擱架以放置組培的操作器具和滅菌后待接種的培養(yǎng)瓶等。其主要儀器設備有：超凈工作臺、空調機、醫(yī)用小平車等。

現(xiàn)在是8頁\一共有65頁\編輯于星期三（四）培養(yǎng)室

培養(yǎng)室是將接種到培養(yǎng)瓶等器皿中的植物材料進行培養(yǎng)的場所。其面積根據(jù)培養(yǎng)規(guī)模和經(jīng)濟條件來確定。為了滿足外植體的生長和發(fā)育，培養(yǎng)室要具備適宜的溫度、濕度、光照、通風等條件。其主要設計如下：培養(yǎng)架子和燈光通風設施邊臺

現(xiàn)在是9頁\一共有65頁\編輯于星期三（五）馴化室當試管苗長出一定量的不定根，根長在0.5cm-1cm時，及時移栽馴化。馴化室通常是在溫室的基礎上營建。馴化室要求清潔無菌，配有空調機、除濕器、恒溫恒濕控制儀、噴霧器、光照調節(jié)裝置、通風口以及必要的殺菌劑。面積大小視生產(chǎn)規(guī)模定?，F(xiàn)在是10頁\一共有65頁\編輯于星期三（六）溫室

為了保證試管苗不分季節(jié)地周年地生產(chǎn)，必須有足夠面積的溫室與之配套。溫室內應配有溫度控制裝置、通風口、噴霧裝置、光照調節(jié)裝置、殺菌殺蟲工具及相應藥劑。現(xiàn)在是11頁\一共有65頁\編輯于星期三現(xiàn)在是12頁\一共有65頁\編輯于星期三現(xiàn)在是13頁\一共有65頁\編輯于星期三現(xiàn)在是14頁\一共有65頁\編輯于星期三現(xiàn)在是15頁\一共有65頁\編輯于星期三二、常用設備

1．超凈工作臺2．無菌箱3．空調機

4．除濕機5．恒溫箱6．烘箱

7．高壓滅菌器8．冰箱9．天平

10．顯微鏡11．水浴鍋12．搖床

13．轉床14．蒸餾水發(fā)生器

15．酸度計16．離心機現(xiàn)在是16頁\一共有65頁\編輯于星期三1．超凈工作臺2．無菌箱3．空調機250C±20C

現(xiàn)在是17頁\一共有65頁\編輯于星期三4．除濕機：濕度也要求恒定，一般保持70%-

80%，濕度過高易滋長雜菌，濕度過低培養(yǎng)器皿

內的培養(yǎng)基會失水變干，從而影響外植體的正

常生長。濕度過高時，可采用小型室內除濕機

除濕，當濕度過低時，可采用噴水來增濕。

5．恒溫箱:又稱培養(yǎng)箱，可用于植物原生質體和酶制劑的保溫，也用于組織培養(yǎng)材料的保存和暗培養(yǎng)。恒溫箱內裝上日光燈，可進行溫度和光照實驗。

現(xiàn)在是18頁\一共有65頁\編輯于星期三6．烘箱：可以用80C-100C的溫度，迅速干

燥洗凈后的玻璃器皿。也可以用160C-180C的

溫度，進行1h-3h的高溫干燥滅菌。還可用80C

的溫度烘干組織培養(yǎng)植物材料，以測定干物質。

7．高壓滅菌器：

是一種密閉良好又可承受高壓的金屬鍋，其上有顯示滅菌器內壓力和溫度的表頭。滅菌器上還有排氣孔和安全閥?，F(xiàn)在是19頁\一共有65頁\編輯于星期三各種型號的高壓滅菌鍋現(xiàn)在是20頁\一共有65頁\編輯于星期三8．冰箱有普通冰箱、低溫冰箱等。用于在常溫下易變性或失效的試劑和母液的儲藏，細胞組織和試驗材料的冷凍保藏，以及某些材料的預處理。

9．天平

包括藥物天平、扭力天平、分析天平和電子天平等。大量元素、糖、瓊脂等的稱量可采用感量為0.1g的藥物天平，微量元素、維生素、激素等的稱量則應采用感量為0.0001g的分析天平。有條件的，最好配用感量為0.0001g的電子天平?，F(xiàn)在是21頁\一共有65頁\編輯于星期三百分之一天平千分之一天平萬分之一天平現(xiàn)在是22頁\一共有65頁\編輯于星期三10．顯微鏡:包括雙目實體顯微鏡（解剖鏡）、

生物顯微鏡、倒置顯微鏡和電子顯微鏡。顯微鏡

上要求能安裝或帶有照相裝置，以對所需材料進

行攝影記錄。有：雙目實體顯微鏡、生物顯微鏡

倒置顯微鏡。

11．水浴鍋:水浴鍋可用于溶解難溶藥品和熔化瓊脂條?，F(xiàn)在是23頁\一共有65頁\編輯于星期三12．搖床（振蕩培養(yǎng)機):在液體培養(yǎng)中為了

改善浸于液體培養(yǎng)基中的培養(yǎng)材料的通氣狀況，

可用搖床來振動容器。

13．轉床（旋轉培養(yǎng)機）:同樣用于液體培養(yǎng)。由于旋轉培養(yǎng)使植物材料交替地處于培養(yǎng)液和空氣中，所以氧氣的供應和對營養(yǎng)的利用更好?，F(xiàn)在是24頁\一共有65頁\編輯于星期三體視顯微鏡普通光學顯微鏡倒置顯微鏡倒置熒光顯微鏡現(xiàn)在是25頁\一共有65頁\編輯于星期三14．蒸餾水發(fā)生器:

制備培養(yǎng)基所用的重蒸餾水，是將蒸餾水再蒸餾一次，使水中不含或少含某些離子。一種是用蒸餾水重新蒸餾，另一種是用自來水連續(xù)蒸餾兩次，以獲得重蒸餾水。此外，還可用純水發(fā)生器將自來水制成純凈的實驗室用水，生產(chǎn)速率可達到4L/h、15L/h或40L/h（因型號而異）。這種水與“試劑級”水比較，其雜質的含量仍然太高，但卻得到了質量一致的較好的實驗室用水?，F(xiàn)在是26頁\一共有65頁\編輯于星期三15．酸度計用于校正培養(yǎng)基和酶制劑的pH值。半導體小型酸度測定儀，既可在配制培養(yǎng)基時使用，又可在培養(yǎng)過程中測定pH值的變化。

16．離心機用于分離培養(yǎng)基中的細胞以及解離細胞壁后的原生質體。一般每分鐘3000-4000轉即可。現(xiàn)在是27頁\一共有65頁\編輯于星期三現(xiàn)在是28頁\一共有65頁\編輯于星期三現(xiàn)在是29頁\一共有65頁\編輯于星期三現(xiàn)在是30頁\一共有65頁\編輯于星期三第二節(jié)器皿用具一、組培器皿（一）器皿的類型培養(yǎng)器皿分注器離心管刻度移液管細菌過濾器現(xiàn)在是31頁\一共有65頁\編輯于星期三1．培養(yǎng)器皿

（1）概念

培養(yǎng)器皿---指用于盛放培養(yǎng)基和接種培養(yǎng)材料的器皿。要求透光度好，能耐高壓滅菌?，F(xiàn)在是32頁\一共有65頁\編輯于星期三（2）類型按材料分：

玻璃培養(yǎng)器皿：優(yōu)點是透光度好、容易清洗；缺點是容易破碎；塑料培養(yǎng)器皿：優(yōu)點是不容易破碎、成本較低，但缺點是透光度較玻璃的差、遇火焰易被熔化?，F(xiàn)在是33頁\一共有65頁\編輯于星期三按形狀分試管——特別適合于用少量培養(yǎng)基及試驗各種不同配方時選用，在莖尖培養(yǎng)及花藥和單子葉植物分化長苗培養(yǎng)時更顯方便。有圓底的和平底的兩種。三角瓶——是植物組織培養(yǎng)中最常用的培養(yǎng)器皿，適合于各種培養(yǎng)，固體或液體、大規(guī)模或小規(guī)模都行。其優(yōu)點是：采光好、瓶口較小不易失水和污染。L形管和T形管——為專用的旋轉式液體培養(yǎng)試管。培養(yǎng)皿——適于作單細胞的固體平板培養(yǎng)、胚和花藥培養(yǎng)和無菌發(fā)芽。角形培養(yǎng)瓶和圓形培養(yǎng)瓶——適于液體培養(yǎng)用。果醬瓶——常用于試管苗大量繁殖，200ml-500ml規(guī)格現(xiàn)在是34頁\一共有65頁\編輯于星期三2．分注器

作用---分裝培養(yǎng)基。分注器可以把配置好的培養(yǎng)基按一定量注入到培養(yǎng)器皿中。一般由4cm-6cm的大型滴管、漏斗、橡皮管及鐵夾組成。還有量筒式的分注器，上有刻度，便于控制。微量分注還可采用注射器?，F(xiàn)在是35頁\一共有65頁\編輯于星期三3．離心管

離心管用于離心，將培養(yǎng)的細胞或制備的原生質體從培養(yǎng)基中分離出來，并進行收集。現(xiàn)在是36頁\一共有65頁\編輯于星期三4．刻度移液管在配制培養(yǎng)基時，生長調節(jié)物質和微量元素等溶液，用量很少，只有用相應刻度的移液管才能準確量取。同時，不同種類的生長調節(jié)物質，不能混淆，這就要求專管專用。常用的移液管容量有0.1ml、0.2ml、0.5ml、2ml、5ml、10ml等?，F(xiàn)在是37頁\一共有65頁\編輯于星期三移液器現(xiàn)在是38頁\一共有65頁\編輯于星期三

培養(yǎng)基中有些生長調節(jié)物質以及有機附加物質如吲哚乙酸（IAA）、赤霉素（GA）等，在高溫條件下易被分解破壞，而用細菌過濾器（圖1—7）既可除菌又可保持試劑的功效。可用金屬制的蔡式漏斗，以石棉濾膜來除去細菌。在過濾少量的液體時，宜用醋酸纖維素和硝酸纖維素混合物制成的微孔濾膜，其孔徑為0.45μm。在過濾時需要一套減壓吸濾設備（通常使用真空泵），漏斗下接吸濾瓶，吸嘴處接上一只內裝脫脂棉的濾氣玻璃管。5．細菌過濾器現(xiàn)在是39頁\一共有65頁\編輯于星期三圖1—7細菌過濾器滅菌裝置現(xiàn)在是40頁\一共有65頁\編輯于星期三（二）器皿的清洗

植物組織培養(yǎng)除了要對待培養(yǎng)的實驗材料和接種用具進行嚴格消毒外，各種培養(yǎng)器皿也要求洗滌清潔，以防止帶入一些有毒的或影響培養(yǎng)效果的化學物質或一些微生物等，對那些常用的玻璃器皿的清潔程度要求更為嚴格。現(xiàn)在是41頁\一共有65頁\編輯于星期三

1．洗滌劑——清洗玻璃器皿用的洗滌劑主要有肥皂、洗潔精、洗衣粉和鉻酸洗滌液（由重鉻酸鉀和濃硫酸混合而成）。配制鉻酸洗滌液的注意事項：

（1）在配制時重鉻酸鉀一定要冷卻后才能加濃硫酸，且只能把濃硫酸緩慢加入重鉻酸鉀溶液中，決不能將重鉻酸鉀溶液或蒸餾水倒入濃硫酸中。（2）由于鉻酸洗滌液具有極強的氧化能力和腐蝕作用，故不要用手直接接觸洗滌液。

現(xiàn)在是42頁\一共有65頁\編輯于星期三2．洗滌方法

使用前先用1%稀鹽酸浸泡1夜，然后用肥皂水洗凈，清水沖洗，最后用蒸餾水沖淋1遍，干后備用。

已用過的玻璃器皿洗滌方法：去殘渣——水洗——熱肥皂水（或洗潔精）——水洗——蒸餾水沖洗1次。較臟的玻璃器皿的洗滌：洗衣粉或洗潔精刷洗幾次并沖凈——浸入洗滌液中——流水中沖洗——蒸餾水沖洗?，F(xiàn)在是43頁\一共有65頁\編輯于星期三已被霉菌等雜菌污染的玻璃器皿的洗滌：

121℃高溫高壓蒸汽滅菌30min——趁熱倒去殘渣——清水中沖洗——浸泡在濃的重鉻酸鉀洗滌液中——2h后取出——水洗數(shù)次——蒸餾水沖淋1次。

用過的吸管和滴管的清洗：洗滌液中浸泡2h以上——取出在流水中沖洗半小時——蒸餾水沖淋1次?，F(xiàn)在是44頁\一共有65頁\編輯于星期三用過的載玻片和蓋玻片的清洗:洗滌液中浸泡數(shù)小時——水洗——綢布擦干——放在95%的灑精中備用?？傊?，要求洗凈的玻璃器皿應透明發(fā)亮，內外壁水膜均勻，不持水珠?，F(xiàn)在是45頁\一共有65頁\編輯于星期三二、器械用具

組織培養(yǎng)所需要的器械用具，可選用醫(yī)療器械和微生物實驗所用的器具。常用的器械用具如圖1—8所示。

鑷子

尖頭鑷子，適用于取植物組織和分離莖尖、葉片表皮等。長20cm-25cm的槍形鑷子，可用于接種和轉移植物材料。剪刀

常用的有解剖剪和彎頭剪，一般在轉移植株時用。解剖刀

常用的解剖刀，有長柄和短柄兩種。刀片也有雙面及單面之分，可以經(jīng)常更換。對大型材料如塊莖、塊根等就需用大型解剖刀?，F(xiàn)在是46頁\一共有65頁\編輯于星期三4.顯微接種工具

包括接種針、接種鉤及接種鏟，由白金絲或鎳絲制成，用來接種花藥或轉移植物組織。5.鉆孔器

取肉質莖、塊莖、鏡肉質根內部的組織時使用。鉆孔器一般做成T形，口徑有各種規(guī)格6.其它

燃燒工具用的酒精燈、用于熔解培養(yǎng)基的帶有磁攪拌器的電爐、用于加速熔解瓊脂培養(yǎng)基的微波烘箱、用于貯備無離子水和重蒸餾水的大型塑料桶、試管架以及轉移培養(yǎng)瓶、試管架的搪瓷盤或塑料框等?，F(xiàn)在是47頁\一共有65頁\編輯于星期三

1—8植物組織培養(yǎng)中常用的器械

1．鑷子2．剪刀3．解剖刀4．接種針和接種鉤現(xiàn)在是48頁\一共有65頁\編輯于星期三第三節(jié)培養(yǎng)條件在植物組織培養(yǎng)中溫度、光照、濕度等各種環(huán)境條件，培養(yǎng)基組成、pH值、滲透壓等各種化學環(huán)境條件都會影響組織培養(yǎng)育苗的生長和發(fā)育。現(xiàn)在是49頁\一共有65頁\編輯于星期三3.1溫度

因為溫度是植物組織培養(yǎng)中的重要因素，所以植物組織培養(yǎng)在最適宜的溫度下生長分化才能表現(xiàn)良好，大多數(shù)植物組織培養(yǎng)都是在23～27℃、之間進行，一般采用25土2℃。低于15℃時培養(yǎng)，植物組織會表現(xiàn)生長停止，高于35℃時對植物生長不利。

不同培養(yǎng)目標采用的培養(yǎng)溫度也不同?，F(xiàn)在是50頁\一共有65頁\編輯于星期三3.2光照

組織培養(yǎng)中光照也是重要的條件之一，主要表現(xiàn)在光強、光質、以及光照時間方面現(xiàn)在是51頁\一共有65頁\編輯于星期三3.2.1光照強度

光照強度對培養(yǎng)細胞的增殖和器官的分化有重要影響，從目前的研究情況看，光照強度對外植體、細胞的最初分裂有明顯的影響。一般來說，光照強度較強，幼苗生長的粗壯，而光照強度較弱幼苗容易徒長?，F(xiàn)在是52頁\一共有65頁\編輯于星期三3.2.2光質

光質對愈傷組織誘導，培養(yǎng)組織的增殖以及器官的分化都有明顯的影響。如百合珠芽在紅光下培養(yǎng)，8周后，分化出愈傷組織。但在藍光下培養(yǎng)，幾周后才出現(xiàn)愈傷組織，而唐菖蒲子球塊接種15d后，在藍光下培養(yǎng)首先出現(xiàn)芽，形成的幼苗生長旺盛，而白光下幼苗纖細。現(xiàn)在是53頁\一共有65頁\編輯于星期三3.2.3光周期

試管苗培養(yǎng)時要選用一定的光周期來進行組織培養(yǎng)，最常用的周期是16h的光照，8h的黑暗。研究表明，對短日照敏感的品種的器官組織，在短日照下易分化，而在長日照下產(chǎn)生愈傷組織，有時需要暗培養(yǎng)，尤其是一些植物的愈傷組織在暗下比在光下更好。如紅花、烏飯樹的愈傷組織。

現(xiàn)在是54頁\一共有65頁\編輯于星期三3.3濕度

包括:培養(yǎng)容器濕度

環(huán)境的濕度條件，容器內主要受培養(yǎng)基水分含量和封口材料的影響。前者又受瓊脂含量的影響。在冬季應適當減少瓊脂用量，否則，將使培養(yǎng)基干硬，以致不利于外植體接觸或插進培養(yǎng)基，導致生長發(fā)育受阻。封口材料直接影響容器內濕度情況，但封閉性較高的封口材料易引起透氣性受阻，也會導致植物生長發(fā)育受影響。

現(xiàn)在是55頁\一共有65頁\編輯于星期三環(huán)境的相對濕度可以影響培養(yǎng)基的水分蒸發(fā)，一般要求70％-80％的相對濕度，常用加濕器或經(jīng)常灑水的方法來調節(jié)濕度。濕度過低：會使培養(yǎng)基喪失大量水分，導致培養(yǎng)基各種成分濃度的改變和滲透壓的升高，進而影響組織培養(yǎng)的正常進行。

濕度過高時：易引起棉塞長霉，造成污染。

合適的環(huán)境濕度現(xiàn)在是56頁\一共有65頁\編輯于星期三3.4滲透壓

培養(yǎng)基中由于有添加的鹽類、蔗糖等化合物，因此，而影響到滲透壓的變化。通常1～2個大氣壓對植物生長有促進作用，2個大氣壓以上就對植物生長有阻礙作用，5～6個大氣壓植物生長就會完全停止，6個大氣壓植物細胞就不能生存。

現(xiàn)在是57頁\一共有65頁\編輯于星期三3.5pH值

不同的植物對培養(yǎng)基最適pH值的要求也是不同的種類最適pH值種類最適pH值杜鵑4.0月季5.8越桔4.5胡蘿卜、石刁柏6.0