高效液相色譜的原理與構(gòu)造介紹

第三講高效液相色譜(HPLC)的原理與構(gòu)造內(nèi)容概要一、高效液相色譜簡介二、高效液相色譜的固定相和流動(dòng)相三、高效液相色譜分離公式與術(shù)語四、液相色譜儀的基本配置五、檢測器的種類和用途六、色譜柱簡介2023/4/16浙江工業(yè)大學(xué)發(fā)酵工程研究所2一、

什么是HPLC？高效液相色譜：—HPLC(HighPerformanceLiquidChromatography)—是一種區(qū)別于經(jīng)典液相色譜，基于儀器方法的高效能分離手段：高性能色譜柱，高精度輸液泵，高靈

敏度檢測器…—廣泛應(yīng)用于各個(gè)領(lǐng)域:醫(yī)藥，環(huán)保，石化，生命科學(xué)，食品，農(nóng)業(yè)…—無論在技術(shù)上，理論上，還是在應(yīng)用上仍有較大的

發(fā)展空間:超高壓液相色譜(UPLC)的創(chuàng)立2023/4/16浙江工業(yè)大學(xué)發(fā)酵工程研究所3高效液相色譜的流程2023/4/16浙江工業(yè)大學(xué)發(fā)酵工程研究所4二、高效液相色譜固定相和流動(dòng)相2.1固定相的種類：1.液-液分配及離子對分離固定相

（1）全多孔型擔(dān)體由氧化硅、氧化鋁、硅藻土等制成的多孔球體；早期采用100μm的大顆粒，表面涂漬固定液，性能不佳已不多見；現(xiàn)采用10μm以下的小顆粒，化學(xué)鍵合制備柱填料；

（2）表面多孔型擔(dān)體（薄殼型微珠擔(dān)體）30～40μm的玻璃微球，表面附著一層厚度為1～2μm的多孔硅膠。表面積小，柱容量底；2023/4/16浙江工業(yè)大學(xué)發(fā)酵工程研究所5（3）化學(xué)鍵合固定相化學(xué)鍵合固定相:目前應(yīng)用最廣、性能最佳的固定相；

a.硅氧碳鍵型：≡Si—O—C

b.硅氧硅碳鍵型：≡Si—O—Si—

C

穩(wěn)定，耐水、耐光、耐有機(jī)溶劑，應(yīng)用最廣；

c.硅碳鍵型：≡Si—C

d.硅氮鍵型：≡Si—N2023/4/16浙江工業(yè)大學(xué)發(fā)酵工程研究所6化學(xué)鍵合固定相的特點(diǎn)：（1）傳質(zhì)快，表面無深凹陷，比一般液體固定相傳質(zhì)快；（2）壽命長，化學(xué)鍵合，無固定液流失，耐流動(dòng)相沖擊；耐水、耐光、耐有機(jī)溶劑，穩(wěn)定；（4）選擇性好，可鍵合不同官能團(tuán)，提高選擇性；（5）有利于梯度洗脫；存在著雙重分離機(jī)制：(鍵合基團(tuán)的覆蓋率決定分離機(jī)理)高覆蓋率：分配為主；低覆蓋率：吸附為主；

2023/4/16浙江工業(yè)大學(xué)發(fā)酵工程研究所72.液-固吸附分離固定相

種類：硅膠、氧化鋁、分子篩、聚酰胺等；結(jié)構(gòu)類型：全多孔型和薄殼型；粒度：5～10μm；

2023/4/16浙江工業(yè)大學(xué)發(fā)酵工程研究所83.離子交換色譜分離固定相

結(jié)構(gòu)類別：（1）薄殼型離子交換樹脂薄殼玻璃珠為擔(dān)體，表面涂約1%的離子交換樹脂；（2）離子交換鍵合固定相薄殼鍵合型；微粒硅膠鍵合型（鍵合離子交換基團(tuán)）

樹脂類別：（1）陽離子交換樹脂（強(qiáng)酸性、弱酸性）（2）陰離子交換樹脂（強(qiáng)堿性、弱堿性）2023/4/16浙江工業(yè)大學(xué)發(fā)酵工程研究所94.空間排阻分離固定相（1）軟質(zhì)凝膠葡聚糖凝膠、瓊脂凝膠等。多孔網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)；水為流動(dòng)相。適用于常壓排阻分離。（2）半硬質(zhì)凝膠苯乙烯-二乙烯基苯交聯(lián)共聚物，有機(jī)凝膠；非極性有機(jī)溶劑為流動(dòng)相，不能用丙酮、乙醇等極性溶劑（3）硬質(zhì)凝膠多孔硅膠、多孔玻珠等；化學(xué)穩(wěn)定性、熱穩(wěn)定性好、機(jī)械強(qiáng)度大，流動(dòng)相性質(zhì)影響小，可在較高流速下使用?？煽乜讖讲Ａ⑶颍哂泻愣讖胶驼６确植?。2023/4/16浙江工業(yè)大學(xué)發(fā)酵工程研究所102.2液相色譜的流動(dòng)相1.流動(dòng)相的特性

（1）液相色譜的流動(dòng)相又稱為：淋洗液，洗脫劑。流動(dòng)相組成改變，極性改變，可顯著改變組分分離狀況；（2）親水性固定液常采用疏水性流動(dòng)相，即流動(dòng)相的極性小于固定相的極性，稱為正相液液色譜法，極性柱也稱正相柱。（3）若流動(dòng)相的極性大于固定液的極性，則稱為反相液液色譜，非極性柱也稱為反相柱。組分在兩種類型分離柱上的出峰順序相反。2023/4/16浙江工業(yè)大學(xué)發(fā)酵工程研究所112.流動(dòng)相類別按流動(dòng)相組成分：單組分和多組分；按極性分：極性、弱極性、非極性；按使用方式分：固定組成淋洗和梯度淋洗。常用溶劑：己烷、四氯化碳、甲苯、乙酸乙酯、乙醇、乙腈、水。采用二元或多元組合溶劑作為流動(dòng)相可以靈活調(diào)節(jié)流動(dòng)相的極性或增加選擇性，以改進(jìn)分離或調(diào)整出峰時(shí)間。2023/4/16浙江工業(yè)大學(xué)發(fā)酵工程研究所123.流動(dòng)相選擇

在選擇溶劑時(shí)，溶劑的極性是選擇的重要依據(jù)。采用正相液-液分配分離時(shí)：首先選擇中等極性溶劑，若組分的保留時(shí)間太短，降低溶劑極性，反之增加。也可在低極性溶劑中，逐漸增加其中的極性溶劑，使保留時(shí)間縮短。

常用溶劑的極性順序：水(最大)>甲酰胺>乙腈>甲醇>乙醇>丙醇>丙酮>二氧六環(huán)>四氫呋喃>甲乙酮>正丁醇>乙酸乙酯>乙醚>異丙醚>二氯甲烷>氯仿>溴乙烷>苯>四氯化碳>二硫化碳>環(huán)己烷>己烷>煤油(最小)2023/4/16浙江工業(yè)大學(xué)發(fā)酵工程研究所134.選擇流動(dòng)相時(shí)應(yīng)注意的幾個(gè)問題2023/4/16（1）盡量使用高純度試劑作流動(dòng)相，防止微量雜質(zhì)長期累積損壞色譜柱和使檢測器噪聲增加。（2）避免流動(dòng)相與固定相發(fā)生作用而使柱效下降或損壞柱子。如使固定液溶解流失；酸性溶劑破壞氧化鋁固定相等。（3）試樣在流動(dòng)相中應(yīng)有適宜的溶解度，防止產(chǎn)生沉淀并在柱中沉積。（4）流動(dòng)相同時(shí)還應(yīng)滿足檢測器的要求。當(dāng)使用紫外檢測器時(shí)，流動(dòng)相不應(yīng)有紫外吸收。浙江工業(yè)大學(xué)發(fā)酵工程研究所142.3HPLC分類按流動(dòng)相和固定相的相對極性分:—正相色譜(NormalPhaseChromatography)固定相的極性大于流動(dòng)相—反相色譜(ReversedPhaseChromatography)固定相的極性小于流動(dòng)相有機(jī)化合物的極性：—分子間作用力(靜電引力,偶極力,色散力,氫鍵力…)綜合表現(xiàn)的一種描述。2023/4/16浙江工業(yè)大學(xué)發(fā)酵工程研究所152.4HPLC的基本類型：等度：—吸光度相同；—在整個(gè)運(yùn)行過程中溶劑組成保持不變

(60:40甲醇/水)2023/4/16浙江工業(yè)大學(xué)發(fā)酵工程研究所16梯度：—在運(yùn)行過程中溶劑組成變化；—漸變或臺階式變化。

100%H20/0%MeOH到0%H2O/100%MeOH2023/4/16浙江工業(yè)大學(xué)發(fā)酵工程研究所17三、HPLC分離公式與術(shù)語色譜圖：—樣品流經(jīng)色譜柱和檢測器，所得到的信號-時(shí)間曲線，又稱

色譜流出曲線(elutionprofile)。這是一張由儀器提供的表示分離狀況的色譜圖，這張色譜圖含有豐富的信息，現(xiàn)在我們來測量色譜圖并以此對一些基本理論展開討論。2023/4/16浙江工業(yè)大學(xué)發(fā)酵工程研究所18基線(baseline)——經(jīng)流動(dòng)相沖洗，柱與流動(dòng)相達(dá)到平衡后，檢測器測出一段時(shí)間的流出曲線。一般應(yīng)平行于時(shí)間軸。噪音(noise)——基線信號的波動(dòng)。通常因電源接觸不良或瞬時(shí)過載、檢測器不穩(wěn)定、流動(dòng)相含有氣泡或色譜柱被污染所致。2023/4/16浙江工業(yè)大學(xué)發(fā)酵工程研究所19漂移(drift)——基線隨時(shí)間的緩緩變化。主要由于操作條件如電壓、溫度、流動(dòng)相及流量的不穩(wěn)定所引起，柱內(nèi)的污染物或固定相不斷被洗脫下來也會(huì)產(chǎn)生漂移。色譜峰(peak)——組分流經(jīng)檢測器時(shí)響應(yīng)的連續(xù)信號產(chǎn)生的曲線。流出曲線上的突起部分。正常色譜峰近似于對稱形正態(tài)分布曲線（高斯Gauss曲線）。不對稱色譜峰有兩種：前延峰(leadingpeak)和拖尾峰(tailingpeak)。前者少見。2023/4/16浙江工業(yè)大學(xué)發(fā)酵工程研究所20峰底——基線上峰的起點(diǎn)至終點(diǎn)的距離。峰高(peakheight，h)——峰的最高點(diǎn)至峰底的距離。峰寬(peakwidth，W)——峰兩側(cè)拐點(diǎn)處所作兩條切線與基線的兩個(gè)交點(diǎn)間的距離。半峰寬(peakwidthathalf-height，Wh/2)——峰高一半處的峰寬。2023/4/16浙江工業(yè)大學(xué)發(fā)酵工程研究所21峰面積(peakarea，A)——峰與峰底所包圍的面積。洗脫體積(V)和峰寬(W):—洗脫體積也可按保留時(shí)間表示，記作t。2023/4/16浙江工業(yè)大學(xué)發(fā)酵工程研究所22分離度（R）：分離程度的度量簡單來說，分離度即為兩峰相對于其峰寬分開得有多遠(yuǎn)。分離度大于1.5視作完全分離。時(shí)間0.5125

2023/4/16浙江工業(yè)大學(xué)發(fā)酵工程研究所23保留因子（k’）：保留能力的量度k’是樣品與填料作用強(qiáng)度的直接量度。0.5125

2023/4/16浙江工業(yè)大學(xué)發(fā)酵工程研究所24分離因子（α）：峰分離程度的量度α是兩個(gè)化合物在同一套色譜系統(tǒng)上，保留差異的數(shù)值表述。0.5125

2023/4/16浙江工業(yè)大學(xué)發(fā)酵工程研究所25理論塔板數(shù)（N）：分離效率的量度理論塔板數(shù)或柱效是一個(gè)數(shù)值，它表示作為保留時(shí)間函數(shù)的峰展寬的量度。

W=0.5W=2

t=52023/4/16浙江工業(yè)大學(xué)發(fā)酵工程研究所26分離度方程式（R）：分離度方程式描述了分離度與分離因子、柱效和保留因子之間的關(guān)系。它是評價(jià)一張色譜圖以及決定如何解決、開發(fā)和優(yōu)化分離方法的依據(jù)。2023/4/16浙江工業(yè)大學(xué)發(fā)酵工程研究所27

2023/4/16浙江工業(yè)大學(xué)發(fā)酵工程研究所28

00011/20.522/30.6733/40.751010/110.912020/210.952023/4/16浙江工業(yè)大學(xué)發(fā)酵工程研究所29分離度方程：分離因子α項(xiàng)當(dāng)α值很小的時(shí)候，其很小的變化也可引起R值較大的變動(dòng)；當(dāng)α值很大的時(shí)候，此項(xiàng)接近1。2023/4/16浙江工業(yè)大學(xué)發(fā)酵工程研究所30分離度方程：柱效N項(xiàng)分離度R與理論塔板數(shù)的平方根成正比2023/4/16浙江工業(yè)大學(xué)發(fā)酵工程研究所31色譜峰對稱性的測量方法2023/4/16浙江工業(yè)大學(xué)發(fā)酵工程研究所32四、HPLC的構(gòu)造2023/4/16浙江工業(yè)大學(xué)發(fā)酵工程研究所332023/4/16浙江工業(yè)大學(xué)發(fā)酵工程研究所344.1真空脫氣機(jī)系統(tǒng)中氣泡的產(chǎn)生：—流動(dòng)相本身存在，梯度淋洗混合后放出氣泡；氣泡的影響：—存在于管路中，系統(tǒng)壓力不穩(wěn)定，實(shí)驗(yàn)結(jié)果有偏差；—存在于單向閥中，易造成液體回流，流量不準(zhǔn)確，甚至是

不吸液；—存在于檢測器中，出現(xiàn)鬼峰，影響檢測準(zhǔn)確性。2023/4/16浙江工業(yè)大學(xué)發(fā)酵工程研究所35如果所用泵在低壓端進(jìn)行溶劑混合（如Agilent1200系列四元泵），則需要進(jìn)行脫氣，因此必須配備一臺真空脫氣機(jī)或其他脫氣系統(tǒng)（如用氦氣進(jìn)行脫氣）。單元泵和高壓混合泵則通常不需要進(jìn)行脫氣。但在下述情況下，對于等度洗脫或高壓混合泵也建議使用真空脫氣機(jī)：—如果在低UV波長段、用最高的靈敏度進(jìn)行檢測，—如果分析要求使用最佳的進(jìn)樣精度，或—如果分析要求保留時(shí)間重現(xiàn)性很高（在流速低于0.5ml/min時(shí)必須使用）。—如果樣品或檢測對流動(dòng)相中溶解的氧敏感（降解）。2023/4/16浙江工業(yè)大學(xué)發(fā)酵工程研究所36溶劑瓶中的溶劑在LC泵的抽取下流過真空箱內(nèi)的特殊管狀塑料膜。當(dāng)溶劑經(jīng)過真空管時(shí)，溶劑中溶解的氣體將滲過塑料膜進(jìn)入真空箱。當(dāng)溶劑離開真空脫氣機(jī)的出口時(shí)，幾乎已被完全脫氣。2023/4/16浙江工業(yè)大學(xué)發(fā)酵工程研究所37Agilent1200系列真空脫氣機(jī)（G1322A型）由一個(gè)四通道（有四個(gè)管狀塑料膜）真空箱和一個(gè)真空泵構(gòu)成。打開真空脫氣機(jī)后，控制電路即開啟真空泵，真空泵運(yùn)行使真空箱內(nèi)產(chǎn)生部分真空。其壓力由壓力傳感器測定。根據(jù)壓力傳感器的信號，真空脫氣機(jī)通過打開或關(guān)閉真空泵來維持部分真空。4.2四元泵高壓輸液泵：最高壓力可大400bar；四通道：方便使用，比如：A通道——水，B通道——乙腈，C通道——甲醇，D通道——臨時(shí)流動(dòng)相。為了獲得高柱效而使用粒度很小的固定相（<10μm），液體的流動(dòng)相高速通過時(shí)，將產(chǎn)生很高的壓力，因此高壓、高速是高效液相色譜的特點(diǎn)之一。應(yīng)具有壓力平穩(wěn)、脈沖小、流量穩(wěn)定可調(diào)、耐腐蝕等特性2023/4/16浙江工業(yè)大學(xué)發(fā)酵工程研究所38四元泵包括一個(gè)溶劑槽、一個(gè)真空脫氣機(jī)和一個(gè)四通道梯度泵。四通道的梯度泵包括一個(gè)高速配量閥和一個(gè)泵組件。它通過低壓混合來產(chǎn)生梯度。2023/4/16浙江工業(yè)大學(xué)發(fā)酵工程研究所39四元泵的液路圖2023/4/16浙江工業(yè)大學(xué)發(fā)酵工程研究所404.3自動(dòng)進(jìn)樣器2023/4/16浙江工業(yè)大學(xué)發(fā)酵工程研究所41流路中為高壓力工作狀態(tài)；通常使用耐高壓的六通閥進(jìn)樣裝置；其結(jié)構(gòu)如圖所示：2023/4/16浙江工業(yè)大學(xué)發(fā)酵工程研究所424.4手動(dòng)進(jìn)樣器Agilent1200手動(dòng)進(jìn)樣器使用Rheodyne7725i（羅丹尼）七通進(jìn)樣閥。樣品經(jīng)閥前部的進(jìn)樣口打入外接于閥的20μl樣品環(huán)。閥內(nèi)有陶瓷固定片和Vespel?進(jìn)樣密封。當(dāng)閥在進(jìn)樣和充樣位置之間來回切換時(shí)，固定片上的先合后開通路確保流量不被中斷。閥裝在鋼制固定桿上，并能裝在LC系統(tǒng)兩側(cè)。2023/4/16浙江工業(yè)大學(xué)發(fā)酵工程研究所43充樣位置：—在充樣位置，泵直接和柱子聯(lián)接(孔2和孔3聯(lián)接)，并且針口和樣品環(huán)聯(lián)接。至少2到3倍樣品環(huán)體積的樣品通過針口注入，以便達(dá)到好的精度。樣品填入環(huán)內(nèi)，過量的樣品通過和孔6聯(lián)接的排放管排出。2023/4/16浙江工業(yè)大學(xué)發(fā)酵工程研究所44進(jìn)樣位置：—在進(jìn)樣位置，泵和樣品環(huán)聯(lián)接(孔1和孔2聯(lián)接)。將全部樣品從環(huán)沖洗到柱。針口和排泄管(孔5)聯(lián)接。2023/4/16浙江工業(yè)大學(xué)發(fā)酵工程研究所454.5柱溫箱Agilent1200系列柱溫箱是用于LC的疊放式溫度控制柱溫箱。它即可作為單獨(dú)模塊使用又可作為Agilent1200系列系統(tǒng)的一部分使用。用它來加熱和冷卻色譜柱，以達(dá)到保留時(shí)間重現(xiàn)性的最高要求。2023/4/16浙江工業(yè)大學(xué)發(fā)酵工程研究所46五、檢測器樣品在經(jīng)過色譜柱分離后，各個(gè)組分先后進(jìn)入到檢測器中，由檢測器進(jìn)行檢測。對檢測器的一般要求為：靈敏度高、重復(fù)性好、線性范圍寬、死體積小、對溫度和流量的變化不敏感。高效液相色譜中，常用的檢測器可分為兩類：—溶質(zhì)性檢測器：它僅對被分離組分的物理或物理化學(xué)特性

有響應(yīng)。如紫外、熒光、電化學(xué)檢測器等?！傮w檢測器：它對試樣和洗脫液總的物理和化學(xué)性質(zhì)響應(yīng)，

如示差折光檢測器等。2023/4/16浙江工業(yè)大學(xué)發(fā)酵工程研究所47(1)紫外檢測器作用原理：依據(jù)被分析試樣組分對特定波長紫外光的選擇性吸收，組分濃度與吸光率的關(guān)系遵守比爾定律。比爾—朗伯定律數(shù)學(xué)表達(dá)式A=lg(1/T)=Kbc—A為吸光度，T為透射比，是透射光強(qiáng)度比上入射光強(qiáng)度；—K為摩爾吸收系數(shù)，它與吸收物質(zhì)的性質(zhì)及入射光的波長λ

有關(guān)，c為吸光物質(zhì)的濃度b為吸收層厚度。2023/4/16浙江工業(yè)大學(xué)發(fā)酵工程研究所48紫外檢測器的特點(diǎn)：—靈敏度高；—線形范圍高；—流通池可做的很小（1mm×10mm，容積8μL）；—對流動(dòng)相的流速和溫度變化不敏感；—波長可選，易于操作；—可用于梯度洗脫。2023/4/16浙江工業(yè)大學(xué)發(fā)酵工程研究所49（2）光電二極管陣列檢測器2023/4/16—紫外檢測器的重要進(jìn)展；—光電二極管陣列檢測器：1024個(gè)二極管陣列，各檢測特定波長，計(jì)算機(jī)快速處理，三維立體譜圖，如圖所示。浙江工業(yè)大學(xué)發(fā)酵工程研究所502023/4/16浙江工業(yè)大學(xué)發(fā)酵工程研究所51光電二極管陣列檢測器2023/4/16浙江工業(yè)大學(xué)發(fā)酵工程研究所52（3）示差折光檢測器2023/4/16

除紫外檢測器之外應(yīng)用最多的檢測器；可連續(xù)檢測參比池和樣品池中流動(dòng)相之間的折光指數(shù)差值。差值與濃度呈正比；

通用型檢測器（每種物質(zhì)具有不同的折光指數(shù)）；靈敏度低、對溫度敏感、不能用于梯度洗脫；偏轉(zhuǎn)式、反射式和干涉型三種；浙江工業(yè)大學(xué)發(fā)酵工程研究所