生物化學DNA復制RNA轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)錄

生物化學DNA復制RNA轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)錄第1頁/共62頁

轉(zhuǎn)錄(transcription)：以DNA為模板，根據(jù)堿基配對的原則合成與DNA互補的RNA的過程。第2頁/共62頁1、相同點：都需要模板都分為三階段合成方向都是5’→3’都形成磷酸二酯鍵

一、轉(zhuǎn)錄與DNA復制的比較：第3頁/共62頁2、轉(zhuǎn)錄DNA復制的不同點

底物不同轉(zhuǎn)錄不需引物；不對稱轉(zhuǎn)錄發(fā)生時間、空間等有選擇性第4頁/共62頁二、DNA指導下RNA聚合酶：（一）RNA聚合酶特性四種核苷三磷酸（ATP、GTP、CTP、UTP）為底物；模板以雙鏈狀態(tài)下活性最大；聚合酶無校對功能；無需引物，方向5’→3’需要模板第5頁/共62頁

（二）酶的分類與構(gòu)成大腸桿菌的RNA聚合酶第6頁/共62頁大腸桿菌RNA聚合酶各亞基的功能亞基基因Mr亞基功能數(shù)目αrpoA40,OOO2酶的裝配，與啟動子上游元件和活化因子結(jié)合βrpoB155,0001結(jié)合核苷酸底物，催化磷酸二酯鍵形成β’rpoC160,0001與模板結(jié)合σrpoD32,OOO-1識別啟動子，促進轉(zhuǎn)錄92，000的起始

9,OOO1未知第7頁/共62頁酶類分布產(chǎn)物α-鵝膏蕈堿對酶的作用分子量反應條件ⅡIⅢ核仁核質(zhì)核質(zhì)rRNA5.8SrRNA18SrRNA28SrRNAmRNAsnRNAtRNA5SrRNA不抑制低濃度抑制高濃度抑制500000~700000~700000_低離子強度,要求Mg2+或Mn2+高離子強度高Mn2+濃度真核細胞的RNA聚合酶同樣，真核RNA聚合酶無校對功能。第8頁/共62頁三、大腸桿菌的轉(zhuǎn)錄（一）相關(guān)概念1.鏈的名稱2.轉(zhuǎn)錄單位：一個轉(zhuǎn)錄事件從起始到終止的DNA區(qū)間稱一個轉(zhuǎn)錄單位。（即從啟動子到終止子之間的DNA序列）3.轉(zhuǎn)錄起始點：指第一個核苷酸摻入的DNA上的位點+1第9頁/共62頁4.啟動子：RNA多聚酶能識別、結(jié)合，開始轉(zhuǎn)錄的一段DNA序列第10頁/共62頁大腸桿菌RNA聚合酶的啟動子

轉(zhuǎn)錄起始位(pribnowbox)-35區(qū)-10區(qū)第11頁/共62頁5、終止子(terminator)終止子：提供轉(zhuǎn)錄終子信號的DNA序列稱為終止子，有兩類：依賴r-因子的終止子和不依賴r-因子的終止子。終止因子：協(xié)助RNA聚合酶識別終止信號的輔助因子（或蛋白質(zhì)）。通讀：RNA聚合酶越過終止子繼續(xù)轉(zhuǎn)錄的現(xiàn)象稱為通讀，通讀是由于終止子被特異性的因子抑制產(chǎn)生的。

抗終止因子：引起抗終止作用的蛋白質(zhì)稱為抗終止因子。第12頁/共62頁(二)轉(zhuǎn)錄過程1.起始第13頁/共62頁第14頁/共62頁利用足跡法（footprint）和DNA測序法可以確定啟動子的序列結(jié)構(gòu).第15頁/共62頁足跡法示意圖第16頁/共62頁s70forstandardpromoters;s32forheat-shockpromoters;

s54fornitrogen-starvationpromotersStandardHeat-shockNitrogenstarvation大腸桿菌不同的σ因子識別不同啟動子:第17頁/共62頁2.延長σ因子循環(huán)

第18頁/共62頁3.終止

不依賴r

-因子的終止子：第19頁/共62頁第20頁/共62頁依賴r

-因子的終止子的終止反應：

r

-因子：含六聚體的寡聚蛋白，具有依賴RNA的NTP酶活性，它結(jié)合于新生RNA上，借助與水解NTP產(chǎn)生能量推動RNA聚合酶向前移動，當酶遭遇終止子時暫停前進，r

-因子追上酶，與酶相互作用釋放RNA。還具有RNA-DNA解螺旋酶活性。第21頁/共62頁調(diào)節(jié)序列起始子GCboxCAATbox真核生物編碼蛋白質(zhì)的基因的啟動子的一般特性真核RNA聚合酶Ⅱ的啟動子第22頁/共62頁真核RNA聚合酶Ⅱ需要許多其它蛋白因子第23頁/共62頁真核RNA聚合酶Ⅱ和轉(zhuǎn)錄因子在啟動子上的裝配第24頁/共62頁三、RNA生物合成的抑制劑（之一）：模板抑制劑

烷化劑：使DNA發(fā)生烷基化，發(fā)生在G-N7，A-N1、N3N7；C-N1。易引起嘌呤的水解，在DNA上留下空隙干擾復制或轉(zhuǎn)錄；或引起堿基錯配。

放線菌素D：放線菌素D與DNA形成非共價的復合物，抑制其模板功能（低濃度抑制轉(zhuǎn)錄，較高濃度抑制復制）。具有類似作用的還有色霉素A3、橄欖霉素、光神霉素。

嵌入染料：可插入雙鏈DNA分子相鄰的堿基對之間，一般具有芳香族發(fā)色團。溴化乙錠（EB）是一種高靈敏的熒光試劑，常用來檢測DNA和RNA。與DNA結(jié)合后抑制其復制和轉(zhuǎn)錄。第25頁/共62頁放線菌素D：模板抑制劑放線菌素D的結(jié)構(gòu)與作用第26頁/共62頁RNA生物合成的抑制劑（之二）：嘌呤和嘧啶類似物：人工合成的堿基類似物能夠抑制和干擾核酸的合成。如：NH2SH

作為代謝拮抗物抑制合成酶類或直接摻到核酸分子中，形成異常RNA或DNA。NH2F第27頁/共62頁RNA聚合酶抑制劑（之三）：RNA聚合酶抑制劑（2）利鏈霉素：與細菌RNA聚合酶亞基結(jié)合，抑制轉(zhuǎn)錄過程中RNA鏈的延長反應。（3）-鵝膏蕈堿：抑制真核生物RNA聚合酶活性。（1）利福霉素：抑制細菌RNA聚合酶活性。利福平可以高效抑制結(jié)核桿菌，殺死麻瘋桿菌，在體外有抗病毒作用。第28頁/共62頁第三節(jié)RNA轉(zhuǎn)錄后的加工原核生物RNA的加工真核生物RNA的加工第29頁/共62頁轉(zhuǎn)錄后加工：指在細胞內(nèi)，由RNA聚合酶合成的初始轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物需要經(jīng)過一系列的變化才能轉(zhuǎn)變?yōu)槌墒斓腞NA分子的過程。第30頁/共62頁（一）、rRNA前體的加工甲基化6500個核苷酸核酸內(nèi)切酶RNaseⅢ、P核酸外切酶一、原核生物RNA的加工第31頁/共62頁（二）tRNA的加工第32頁/共62頁三、真核生物RNA的一般加工轉(zhuǎn)錄初始產(chǎn)物（hnRNA）（一）mRNA前體的加工第33頁/共62頁真核mRNA前體的加工步驟:（1）hnRNA被剪接，把內(nèi)含子（DNA上非編碼序列）轉(zhuǎn)錄序列剪掉，把外顯子（DNA上的編碼序列）轉(zhuǎn)錄序列）拼接上，真核生物一般為不連續(xù)基因。加工包括：（4）分子內(nèi)部的核苷酸甲基化修飾。（3）5’端連接“帽子”結(jié)構(gòu)（m7G5ppp5NmpNp-）；（2）3’端添加polyA“尾巴”；第34頁/共62頁第35頁/共62頁真核mRNA的5’－“帽子”加工第36頁/共62頁多聚腺苷酸聚合酶

真核生物mRNA

3’-“尾巴”的加工內(nèi)切酶加尾信號第37頁/共62頁因發(fā)現(xiàn)斷裂基因而獲1993年諾

貝爾生理學獎的RichardJ

RobertandPhllipASharp第38頁/共62頁（二）真核rRNA前體的加工第39頁/共62頁（三）真核tRNA前體的加工第40頁/共62頁四、RNA的拼接機理大多真核生物基因是斷裂基因，即含有內(nèi)含子。斷裂基因的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物必需通過拼接，去除插入部分（內(nèi)含子,intron），使編碼區(qū)（外顯子,exon）成為連續(xù)序列。這是基因表達的重要環(huán)節(jié)。內(nèi)含子的結(jié)構(gòu)多種多樣，拼接機制也是多種多樣的。RNA的拼接方式類型Ⅰ內(nèi)含子的自我拼接：核酶的作用類型Ⅱ內(nèi)含子的自我拼接：核酶的作用hnRNA的拼接：核內(nèi)小RNA(SnRNA)與蛋白質(zhì)組成核糖核蛋白體（snRNP）的作用(類型Ⅲ內(nèi)含子的切除）。核tRNA的拼接：酶促拼接第41頁/共62頁核酶的發(fā)現(xiàn)：

1981年CechT在研究四膜蟲(Tetrahymenathermophila)rRNA前體拼接過程中發(fā)現(xiàn)，此類的拼接無需蛋白質(zhì)的酶參與作用，它可自我催化完成。Cech稱具有催化功能的RNA為核酶（ribozyme）。1989年cechT和AltmanS共同獲諾貝爾化學獎，AltmanS的貢獻是發(fā)現(xiàn)RnaseP中的M1RNA單獨也具有催化功能。核酶的發(fā)現(xiàn)改變了酶的化學本質(zhì)是蛋白質(zhì)的傳統(tǒng)觀念，被認為是近二十年來生物化學領域中最令人鼓舞的成就之一。第42頁/共62頁TheM1RNAinribonucleasePiscatalyticTheintroninthepre-rRNAofTetrahemenaisself-spliced因發(fā)現(xiàn)核酶而獲諾貝爾獎的兩位科學家：第43頁/共62頁1、類型Ⅰ內(nèi)含子的自我拼接：

借助與鳥苷酸或鳥苷的作用，內(nèi)含子自我催化，通過三次轉(zhuǎn)酯反應完成拼接，切下L19RNA。第44頁/共62頁

L19RNA或L19IVS（含395個核苷酸）第45頁/共62頁2、類型Ⅱ內(nèi)含子的自我拼接

也是由內(nèi)含子自我催化完成，但轉(zhuǎn)酯反應無鳥苷的參與，兩次轉(zhuǎn)酯反應后內(nèi)含子形成套索結(jié)構(gòu)而切下。第46頁/共62頁

細胞內(nèi)存在許多種類的小分子RNA，其大小在100～300個核苷酸，稱為核內(nèi)小RNA（SmallnuclearRNA,snRNA）。U系列的snRNA中尿嘧啶含量較高。因而得名。這些小RNA與多種蛋白質(zhì)結(jié)合形成snRNP參與核內(nèi)RNA

的加工。U1、U2、U4、U5、U6結(jié)合形成的snRNP參與hnRNA的拼接，U3snRNP參與rRNA的拼接。第47頁/共62頁U2hnRNA含與分支處互補序列U1hnRNA含與內(nèi)含子3’-端互補序列第48頁/共62頁核酸內(nèi)切酶環(huán)磷酸二酯酶激酶激酶

連接酶磷酸酯酶4、核內(nèi)tRNA前體的酶促拼接（內(nèi)含子Ⅳ的切除）第49頁/共62頁RNA拼接的意義1、RNA的拼接是生物機體在進化歷史中形成的，是進化的結(jié)果；2、RNA的拼接是基因表達的重要環(huán)節(jié)。RNA轉(zhuǎn)錄后通過拼接而抽取有用信息，形成連續(xù)的編碼序列，并可通過選擇性拼接而控制生物機體生長發(fā)育。因此，這是真核生物遺傳信息精確調(diào)節(jié)和控制的方式之一。

RNA拼接現(xiàn)象的發(fā)現(xiàn)，給生物學家一系列令人困惑的疑問：為什么生物機體要先轉(zhuǎn)錄內(nèi)含子，然后將其切除？RNA合成后再拼接是一個非常耗能的過程，對細胞其收益是什么？內(nèi)含子由何而來？內(nèi)含子有無生物功能？圍繞以上問題，提出一些看法或觀點，但爭議很大，目前尚無定論：第50頁/共62頁5、內(nèi)含子和外顯子是相對的，有些內(nèi)含子具有編碼序列，能產(chǎn)生蛋白質(zhì)和功能RNA。如Ⅰ型內(nèi)含子能產(chǎn)生核酸內(nèi)切酶，Ⅱ型內(nèi)含子能產(chǎn)生核酸內(nèi)切酶和逆轉(zhuǎn)錄酶。以幫助內(nèi)含子的轉(zhuǎn)移。RNA拼接的意義

3、基因由模塊裝配而成，模塊間的間隔序列也就演變成內(nèi)含子，因此外顯子和內(nèi)含子有著同樣的古老歷史。而現(xiàn)今存在的幾類內(nèi)含子也各自有其起源和進化歷史，從它們的拼接方式和分布可以大致推測其起源時間。

4、RNA的拼接主要存在于真核生物，原核生物極為少見，但并非完全沒有。一種合理的解釋是原核生物為適應快速生長的需要，在進化中已將內(nèi)含子丟掉。事實上，快速生長的單細胞如酵母，其編碼的基因也幾乎沒有內(nèi)含子。然而內(nèi)含子的存在和拼接作用對生物機體的進化十分重要。第51頁/共62頁不同RNA拼接方式導致一個基因多種產(chǎn)物降鈣素甲狀腺腦降鈣素基因相關(guān)肽返回第52頁/共62頁真核生物復雜轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物的兩種不同的剪接方式第53頁/共62頁第四節(jié)逆轉(zhuǎn)錄（reversetranscription）

1970年Temin等和Baltimore分別從勞氏肉瘤病毒和小白鼠白血病病毒等致病RNA病毒中分離出逆轉(zhuǎn)錄酶，迄今已知的致癌RNA病毒都含有逆轉(zhuǎn)錄酶。

定義:以RNA為模板，按照RNA中的核苷酸順序合成DNA的過程稱為逆轉(zhuǎn)錄，由逆轉(zhuǎn)錄酶催化進行。用特異抑制物（放線菌素D）能抑制致癌RNA病毒的復制，而對一般RNA病毒的復制無影響。已知放線菌素D專門抑制以DNA為模板的反應，可見致癌RNA病毒的復制過程必然涉及到DNA。所以Temin于1964年提出前病毒的假說。第54頁/共62頁

以前病毒形式整合到宿主細胞DNA中而使細胞惡性轉(zhuǎn)化單鏈病毒RNARNA-DNA雜交分子雙鏈DNA（前病毒）

逆轉(zhuǎn)錄酶也和DNA聚合酶一樣，沿53’方向合成DNA，底物為四種dNTP,并要求短鏈RNA作引物。

逆轉(zhuǎn)錄酶是多功能酶，兼有3種酶的活性：

RNA指導的DNA聚合酶活性；

DNA指導的DNA聚合酶活性；核糖核酸酶H的活性，專一水解RNA-DNA雜交分子中的RNA，可沿5’3’方向起核酸外切酶的作用；無校對功能，錯誤率高，易產(chǎn)生變異。+RNA+DNA-RNA+DNA-DNA+致癌RNA病毒的逆轉(zhuǎn)錄過程第55頁/共62頁逆轉(zhuǎn)錄病毒的生活史第56頁/共62頁不能把“中心法則”絕對化，遺傳信息也可以從RNA傳遞到DNA。促進了分子生物學、生物化學和病毒學的研究，為腫瘤的防治提供了新的線索。目前逆轉(zhuǎn)錄酶已經(jīng)成為研究這些學科的工具。

1983年,發(fā)現(xiàn)人類免疫缺陷病毒(humanimmunedeficiencevirus,HIV),感染T淋巴細胞后即殺死細胞,造成宿主機體免疫系統(tǒng)損傷,引起艾滋病(acquiredimmunodeficiencysyndrome,AIDS)，該病毒為逆轉(zhuǎn)錄病毒。逆轉(zhuǎn)錄酶發(fā)現(xiàn)的理論與實踐意義：第57頁/共62頁

因發(fā)現(xiàn)逆轉(zhuǎn)錄病毒的遺傳物質(zhì)而獲1975年諾貝爾獎的三位科學家第58頁/共62頁（1）病毒RNA可充當mRNA，利用寄主中的核