實(shí)驗(yàn)八質(zhì)粒DNA的小量制備課件

實(shí)驗(yàn)八質(zhì)粒DNA的小量制備一般操作步驟：培養(yǎng)細(xì)菌使質(zhì)粒擴(kuò)增收集和裂解細(xì)菌分離質(zhì)粒DNA堿變性法煮沸法去污劑法有機(jī)溶劑法一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康恼莆諌A裂解法提取質(zhì)粒DNA的原理熟悉堿裂解法提取質(zhì)粒DNA的方法堿變性法抽提質(zhì)粒的原理堿變性抽提質(zhì)粒DNA是基于染色體DNA與質(zhì)粒DNA的變性與復(fù)性的差異而達(dá)到分離目的。在EDTA、（溶菌酶）和表面活性劑的存在下，經(jīng)堿處理溶菌，同時(shí)在pH高達(dá)12.0~12.6的堿性條件下，染色體DNA的氫鍵斷裂，雙螺旋結(jié)構(gòu)解開而變性。質(zhì)粒DNA的大部分氫鍵也斷裂，但超螺旋共價(jià)閉合環(huán)狀的兩條互補(bǔ)鏈不會(huì)完全分離。當(dāng)以pH4.8的KAc高鹽緩沖液去調(diào)節(jié)其pH至中性時(shí)，變性的質(zhì)粒DNA又恢復(fù)原來的構(gòu)型，保存在溶液中，而染色體DNA不能復(fù)性而形成纏連的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)。通過離心，染色體DNA、不穩(wěn)定的大分子RNA、蛋白質(zhì)-SDS復(fù)合物等一起沉淀下來而被除去。降解的小分子RNA可通過RnaseA處理去除未除凈的蛋白質(zhì)可通過苯酚/氯仿抽提除去。提質(zhì)粒用溶液Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ溶液Ⅰ（細(xì)菌重懸液）：

50mMTris-HCl10mMEDTApH7.5溶液Ⅱ(細(xì)菌裂解液）：

0.4MNaOH2%SDS溶液Ⅲ:1.32MKAcpH4.8(用醋酸調(diào)）4.將細(xì)菌沉淀懸浮于200μl預(yù)冷的溶液Ⅰ中，劇烈振蕩。5.加200μl溶液Ⅱ（新鮮配制），蓋緊管口，快速顛倒5次以混勻內(nèi)容物。冰上放置。6.加入200μl溶液Ⅲ（冰上預(yù)冷），蓋緊管口，溫和振蕩，冰上放置3-5min。7.4℃，12,000rpm，5min，將上清轉(zhuǎn)移至另一離心管中。8.加入等體積酚/氯仿（1:1），振蕩混勻，4℃，12,000rpm，2min，將上清轉(zhuǎn)移到另一離心管中。(此步也可不做)9.加入2倍體積的無水乙醇，室溫靜置2min。10.4℃，12,000rpm，5min。11.棄上清，把離心管倒扣在吸水紙上，吸干液體。12.用1ml70%乙醇洗滌質(zhì)粒DNA沉淀，棄上清，吸干，在空氣中干燥10min。13.加入30μlTE緩沖液（含20μg/mlRNaseA，不含DNA酶），使DNA完全溶解。五.實(shí)驗(yàn)結(jié)果通過凝膠電泳