實(shí)驗(yàn)三：線粒體和細(xì)胞核的制備與觀察課件

實(shí)驗(yàn)三線粒體和細(xì)胞核的制備與觀察細(xì)胞內(nèi)線粒體的超活染色與觀察細(xì)胞生物學(xué)實(shí)驗(yàn)實(shí)驗(yàn)?zāi)康恼莆沼貌钏匐x心法分離動(dòng)物細(xì)胞核及線粒體的技術(shù).掌握分級(jí)分離細(xì)胞核與線粒體的純度檢測(cè)方法學(xué)習(xí)線粒體活性染色技術(shù),觀察活細(xì)胞內(nèi)線粒體的形態(tài)、數(shù)量與分布了解密度梯度離心法純化線粒體的方法.實(shí)驗(yàn)原理制備線粒體及細(xì)胞核采用組織勻漿在懸浮介質(zhì)中進(jìn)行差速離心的方法懸浮介質(zhì)通常采用一定pH的緩沖蔗糖溶液，它較接近細(xì)胞質(zhì)的分散相，在一定程度上能保持細(xì)胞器的結(jié)構(gòu)和酶的活性.詹納斯綠B是一種是毒性較小的堿性染料，能對(duì)動(dòng)植物的細(xì)胞或組織在活體狀態(tài)下進(jìn)行無毒害的染色，其原理主要是堿性染料的膠粒表面帶有陽離子，而被染部分本身具有陰離子，這樣，它們彼此之間發(fā)生吸引作用，染料就被堆積下來。細(xì)胞核由脫氧核糖核酸和強(qiáng)堿性的組蛋白、精蛋白等形式的核蛋白所組成，在DNA的雙螺旋結(jié)構(gòu)中，兩條鏈上的磷酸基向外，帶負(fù)電荷，呈酸性，很容易與帶正電荷的堿性染料以離子或氫鍵結(jié)合而被染色，此外，由于核蛋白中還有少量的弱酸性物質(zhì)，因此，詹納斯綠B也能被堆積下來而使細(xì)胞核呈現(xiàn)藍(lán)色。線粒體內(nèi)膜上分布有細(xì)胞色素氧化酶,該酶能使脂溶性的詹納斯綠B染料保持在氧化狀態(tài)呈現(xiàn)藍(lán)綠色，從而使線粒體顯色，而胞質(zhì)中的染料被還原成無色.線粒體能在詹納斯綠B染液中維持活性數(shù)小時(shí)，通過染色，可以在高倍顯微鏡下觀察到生活狀態(tài)的線粒體的形態(tài)和分布；活體染色

活體染色是指對(duì)生活有機(jī)體的細(xì)胞或組織能著色但又無毒害的一種染色方法。它的目的是顯示生活細(xì)胞內(nèi)的某些結(jié)構(gòu)，而不影響細(xì)胞的生命活動(dòng)和產(chǎn)生任何物理、化學(xué)變化以致引起細(xì)胞的死亡。活染技術(shù)可用來研究生活狀態(tài)下的細(xì)胞形態(tài)結(jié)構(gòu)和生理、病理狀態(tài)。活體染色

根據(jù)所用染色劑的性質(zhì)和染色方法不同，通常把活體染色分為體內(nèi)活染和體外活染兩類。體內(nèi)活體染色：是以膠體狀的染料溶液注入動(dòng)、植物體內(nèi)，染料的膠粒固定、堆積在細(xì)胞內(nèi)某些特殊結(jié)構(gòu)里，達(dá)到易于識(shí)別的目的。

體外活體染色(超活染色)：它是由活的動(dòng)、植物分離出部分細(xì)胞或組織小塊，以染料溶液浸染，染料被選擇固定在活細(xì)胞的某種結(jié)構(gòu)上而顯色。作為活體染色劑：對(duì)細(xì)胞無毒性或毒性極小的染料，而且總要配成稀淡的溶液來使用?；铙w染料多為堿性染料,如中性紅,詹納斯綠B,次甲基藍(lán)等對(duì)某種細(xì)胞器的染色具有專一性,如中性紅染液泡,JanusgreenB染線粒體。實(shí)驗(yàn)用品實(shí)驗(yàn)材料小白鼠肝臟人口腔粘膜上皮細(xì)胞用頸椎脫臼法處死小鼠，置于解剖盤中剪開腹腔，取小白鼠肝剪成小塊放入小燒杯內(nèi)用吸管吸取生理鹽水，反復(fù)浸泡沖洗肝臟，洗去血液。

實(shí)驗(yàn)用品實(shí)驗(yàn)試劑0.25mol/L蔗糖+0.01mol/L三羥甲基氨基甲烷(Tris)-鹽酸緩沖液(pH7.4)0.2%和0.02%詹納斯綠B(JanusgreenB)染液生理鹽水

實(shí)驗(yàn)儀器：顯微鏡，高速冷凍離心機(jī),玻璃勻漿器,解剖刀，剪刀，漏斗，尼龍網(wǎng)，刻度離心管等1.細(xì)胞器(細(xì)胞核,線粒體)的分離提取(1）獲取肝臟：用頸椎脫臼法處死小鼠,置于解剖盤中剪開腹腔,迅速取出小鼠肝,稱重1克放入小燒杯內(nèi)用吸管吸取預(yù)冷的生理鹽水洗凈血液。(2）勻漿：將鼠肝剪碎置于預(yù)冷的0.25mol/L蔗糖緩沖液中洗滌數(shù)次至鼠肝發(fā)白。然后置于勻漿器中，加入10ml預(yù)冷的0.25mol/L蔗糖緩沖液勻漿至肝組織基本碎裂(分次加入勻漿液)。（注：整過程在冰浴上進(jìn)行）(3）過濾：雙層尼龍布將勻漿液過濾到預(yù)冷的小燒杯中。實(shí)驗(yàn)步驟（4）細(xì)胞核與線粒體分離：勻漿液8ml，4℃下,700×g離心10min沉淀1（制1張裝片A，標(biāo)記A1,A2…

）(組織、細(xì)胞核、線粒體及碎片等）上清液1（制1張裝片B，做好標(biāo)記）洗滌，8ml預(yù)冷的0.25mol/L蔗糖緩洗滌液1次，1000

×g離心15min沉淀2（制1張裝片C，做好標(biāo)記）（細(xì)胞核及碎片）上清液2（制1張裝片D，做好標(biāo)記）2.分離提取物鑒定將共5張制片，不待干即滴加0.2%JanusgreenB染色20min后（暗處反應(yīng)）,蓋上蓋玻片，鏡檢，分散相的線粒體被染成淺藍(lán)色，呈圓形或橢圓形顆粒。如果線粒體聚集成堆則被染成深藍(lán)色，難以辨認(rèn)。裝片中的細(xì)胞核，也被染成較深的藍(lán)色，而血細(xì)胞不著色。注意：得到的沉淀物須加預(yù)冷0.25mol/L蔗糖緩沖液將其懸浮后再裝片，制線粒體裝片時(shí)，懸浮液只需一小滴，量太多線粒體易聚集成堆，不便觀察。

實(shí)驗(yàn)步驟實(shí)驗(yàn)步驟3.人口腔粘膜上皮細(xì)胞線粒體的超活染色觀察①將載玻片(必須十分清潔)平放在桌面上，滴2滴0.02%詹納斯綠B染液于載玻片中央；②用消毒牙簽的鈍端在自己口腔頰粘膜處稍用力刮取口腔上皮細(xì)胞(粘液狀物)，均勻地涂布在載玻片上的染液中，染色5-15min(注意不可使染液干燥，必要時(shí)可再加滴染液)，蓋上玻片，四周溢出的染液用吸水紙吸干；③低倍鏡下，選擇平展的口腔上皮細(xì)胞，換高倍鏡或油鏡觀察?？梢姳馄綘钌掀ぜ?xì)胞的核周圍胞質(zhì)中分布著一些被染成藍(lán)綠色的顆粒狀或短棒狀的結(jié)構(gòu)，即為線粒體。實(shí)驗(yàn)步驟4.密度梯度離心法純化線粒體(自選)35,000rpm/1h使用超高速離心機(jī)在顯微鏡下觀察到的離體線粒體勻漿緩沖液預(yù)冷(4℃)冰浴上研磨，勻漿搗桿垂直揷入勻漿管中，上下轉(zhuǎn)動(dòng)研磨3-5次，盡可能充分破碎細(xì)胞(適度研磨)，縮短勻漿時(shí)間。試驗(yàn)全過程要在0～4℃進(jìn)行,離心機(jī)溫度設(shè)為4℃整個(gè)分離過程不宜過長,要盡快。離心機(jī)使用：離心管要平衡g為離心力(RCF)RCF(g)=1.118×10-5×r×(rpm)2r:有效半徑(cm),

rpm:轉(zhuǎn)速(轉(zhuǎn)/分)注意事項(xiàng)只有2臺(tái)可用的冷凍離心機(jī)，每一次的離心時(shí)間較長，因此，全班同學(xué)要配合好，每次運(yùn)轉(zhuǎn)務(wù)必滿負(fù)荷.1.分別描述五張裝片的結(jié)果(如逐級(jí)分離中看到哪些細(xì)胞組分，平均