蛋白質(zhì)含量測(cè)定-考馬斯亮藍(lán)法2課件

蛋白質(zhì)含量測(cè)定——考馬斯亮藍(lán)法實(shí)驗(yàn)十一實(shí)驗(yàn)?zāi)康恼莆湛捡R斯亮藍(lán)法測(cè)定樣品蛋白含量的原理和操作步驟進(jìn)一步熟練分光光度計(jì)的原理和操作方法掌握標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作和使用雙縮脲（NH3CONHCONH3）:凡具有兩個(gè)酰胺基或兩個(gè)直接連接的肽鍵，這類化合物都有雙縮脲反應(yīng)。

紫色絡(luò)合物顏色的深淺與蛋白質(zhì)濃度成正比.Folin—酚試劑法（Lowry法）

Folin—酚試劑中的磷鉬酸鹽,磷鎢酸鹽被蛋白質(zhì)中的酪氨酸和苯丙氨酸殘基還原，產(chǎn)生深蘭色（鉬蘭和鎢蘭的混合物）。在一定的條件下，蘭色深度與蛋白的量成正比。．Folin---酚法的靈敏度是雙縮脲法的100倍.1976年由Bradford建立的考馬斯亮蘭法:染料主要是與蛋白質(zhì)中的堿性氨基酸（特別是精氨酸）和芳香族氨基酸殘基相結(jié)合。在595nm下測(cè)定的吸光度值A(chǔ)595，與蛋白質(zhì)濃度成正比.靈敏度高比Lowry法約高四倍

CoomassieDye-Based蛋白質(zhì)定量PROTEIN+Amax=595nmBLUEAcidCoomassieG-250Protein-DyeComplexOCH2CH3NHCCH3CH3NCH2SO3-CH3CH2NCH2CH2CH3SO3Na+

Bradford法的突出特點(diǎn):(1)靈敏度高。其最低檢測(cè)蛋白質(zhì)含量可達(dá)1mg，這是因?yàn)榈鞍踪|(zhì)與染料相結(jié)合后產(chǎn)生的顏色變化很大，蛋白質(zhì)-染料復(fù)合物有更高的吸光系數(shù)。(2)測(cè)定快速，簡(jiǎn)潔，完成一個(gè)樣品的測(cè)定，只要5分鐘左右。由于染料與蛋白質(zhì)結(jié)合的過(guò)程，大約只要2分鐘即可完成,其顏色可以在1小時(shí)內(nèi)保持穩(wěn)定（且在5分鐘至20分鐘之間，顏色的穩(wěn)定性最好）(3).干擾物質(zhì)少。缺點(diǎn):(1)各種蛋白質(zhì)中的精氨酸和芳香族氨基酸的含量不同，因此不同蛋白質(zhì)時(shí)有較大的偏差；(2)有一些去污劑等物質(zhì)干擾此法的測(cè)定；(3)標(biāo)準(zhǔn)曲線也有輕微的非線形，因而不能用比爾定律進(jìn)行計(jì)算而只能用標(biāo)準(zhǔn)曲線來(lái)測(cè)定未知蛋白質(zhì)的濃度。

此方法比紫外吸收法高10-20倍,凱氏定氮法比較復(fù)雜,但較準(zhǔn)確,往往以定氮法測(cè)定的蛋白質(zhì)作為其他方法的標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì).器材與試劑

可見(jiàn)光分光光度計(jì)試管標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)溶液，用牛血清清蛋白（BSA）配置考馬斯亮蘭G-250染料試劑：稱100mg考馬斯亮蘭，溶于50ml95%的乙醇后，再加入120ml85%的磷酸，用水稀釋至1升。(2)加完試劑2-5分鐘后混勻,即可開(kāi)始用比色皿，在分光光度計(jì)上測(cè)定各樣品在595nm處的光吸收值A(chǔ)595，空白對(duì)照為1號(hào)管。用標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)為橫坐標(biāo)，用吸光值A(chǔ)595為縱坐標(biāo)，作圖，即得一標(biāo)準(zhǔn)曲線。由此標(biāo)準(zhǔn)曲線，根據(jù)測(cè)出的為止樣品吸收值A(chǔ)595值，即可查出樣品蛋白質(zhì)含量。標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作坐標(biāo)紙法電腦軟件法

繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，以濃度位置向上延長(zhǎng)，光密度位置向右延長(zhǎng)、交點(diǎn)即為此座標(biāo)標(biāo)點(diǎn)。然后，將各座標(biāo)點(diǎn)和原點(diǎn)聯(lián)成一條線，若符合Lambert-Beer氏定律，則系通過(guò)原點(diǎn)的直線。②若各點(diǎn)不在一直線，則可通過(guò)原點(diǎn)，盡可能使直線通過(guò)更多點(diǎn)，使不在直線上的點(diǎn)盡量均勻地分布在直線的兩邊。③繪制完畢以后，應(yīng)在座標(biāo)紙上注明實(shí)驗(yàn)項(xiàng)目的名稱，所使用比色計(jì)的型號(hào)和儀器編號(hào)、單色光波長(zhǎng)、日期、室溫。④一般應(yīng)作2-3次以上的平行測(cè)定，重復(fù)性良好曲線方可應(yīng)用。⑤繪制好的標(biāo)準(zhǔn)曲線只能供以后在相同條件下操作測(cè)定相同物質(zhì)時(shí)使用。當(dāng)更換儀器、移動(dòng)儀器位置、調(diào)換試劑及室溫有明顯改變時(shí)，標(biāo)準(zhǔn)曲線需重新繪制。電腦作圖-Excel為例首先，將數(shù)據(jù)整理好輸入Excel，并選取完成的數(shù)據(jù)區(qū)，并點(diǎn)擊圖表向?qū)?；點(diǎn)擊圖表向?qū)Ш髸?huì)運(yùn)行圖表向?qū)缦聢D，先在圖表類型中選“XY散點(diǎn)圖”，并選了圖表類型的“散點(diǎn)圖”點(diǎn)擊“下一步”，如果發(fā)現(xiàn)圖不理想，就要仔細(xì)察看是否數(shù)據(jù)區(qū)選擇有問(wèn)題，如果有誤，可以點(diǎn)擊“系列”來(lái)更改.完成了散點(diǎn)圖，現(xiàn)在需要根據(jù)數(shù)據(jù)進(jìn)行回歸分析，計(jì)算回歸方程，繪制出標(biāo)準(zhǔn)曲線。其實(shí)這很簡(jiǎn)單，先點(diǎn)擊圖上的標(biāo)準(zhǔn)值點(diǎn)，然后按右鍵，點(diǎn)擊“添加趨勢(shì)線”。點(diǎn)擊趨勢(shì)線（也就是我們說(shuō)的標(biāo)準(zhǔn)曲線）然后按右鍵，選趨勢(shì)線格式，在顯示公式和顯示R平方值（直線相關(guān)系數(shù)）前點(diǎn)一下，勾上。再點(diǎn)確定。公式和相關(guān)系數(shù)都出來(lái)了。四.注意事項(xiàng)（1）如果測(cè)定要求很嚴(yán)格，可以在試劑加入后的5-20min內(nèi)測(cè)定光吸收，因?yàn)樵龠@段時(shí)間內(nèi)顏色最穩(wěn)定