生物質譜的學習材料

生物質譜的學習材料第1頁/共79頁第一節(jié)生物質譜發(fā)展過程

質譜分析法(massspectrometry)將化合物形成離子和碎片離子，按其質荷比(Ｍ/Ｚ值)的不同進行分離測定，來進行成分和結構分析的一種分析方法。

用于分析生物大分子的質譜技術成為生物質譜。第2頁/共79頁Conventionalmassspectrometersusedforlowvolatilemolecularweightsamplesthatareintroducedinthevaporphasearecalledsingle-focusingmassspectrometers.第3頁/共79頁20世紀60年代質譜技術在有機化合物小分子的結構測定中得到應用，而對于大分子(分子量超過1000Da)、極性分子和難氣化的分子，則顯得無能為力。第4頁/共79頁70年代

Macfarlane等人發(fā)明了一種被稱作等離子體解吸(Plasmadesorption,PD)的離子化技術，使得質譜測定分子量范圍擴大到幾千道爾頓。80年代初

Barber等人又引入了快原子轟擊(fastatombombardment，簡稱FAB)電離技術，并成功地測定了一個26肽的結構，從而使得質譜技術應用于蛋白質和肽的結構測定這一設想變?yōu)楝F(xiàn)實。第5頁/共79頁80年代末JohnFenn發(fā)明的電噴霧電離(electrosprayionization，ESI)和Hillenkamp等人發(fā)明的基質輔助激光解吸電離(matrixassistedlaserdesorptionionization,MALDI)。使質譜分析生物大分子成為可能。

第6頁/共79頁第二節(jié)生物質譜儀及其相關技術第7頁/共79頁2.1質譜儀組成

質譜儀由以下四部分組成：進樣系統(tǒng)——按電離方式的需要，將樣品送入離子源的適當部位；離子源——用來使樣品分子電離生成離子，并使生成的離子會聚成有一定能量和幾何形狀的離子束；質量分析器——利用電磁場（包括磁場、磁場和電場的組合、高頻電場和高頻脈沖電場等）的作用將來自離子源的離子束中不同質荷比的離子按空間位置，時間先后或運動軌道穩(wěn)定與否等形式進行分離；檢測器——用來接受、檢測和記錄被分離后的離子信號。第8頁/共79頁2.2離子源離子源的功能是將進樣系統(tǒng)引入的氣態(tài)樣品分子轉化成離子。由于離子化所需要的能量隨分子不同差異很大，因此，對于不同的分子應選擇不同的離解方法。給樣品較大能量的電離方法為硬電離方法，而給樣品較小能量的電離方法為軟電離方法，后一種方法適用于不穩(wěn)定或易電離的樣品。第9頁/共79頁2.2.1離子源類型電子轟擊電離(ElectronImpactIonization，EI)化學離子化(ChemicalIonization，CI)場電離，場解吸(FieldIonizationFD，F(xiàn)ieldDesorptionFD)快原子轟擊(FastAtomBombardment，F(xiàn)AB)電噴霧電離(ElectrosprayIonization，ESI)基質輔助激光解析電離(Matrix-AssistedLaserDesorptionIonization，MALDI)大氣壓化學電離(AtmosphericPressureChemicalIonization，APCI)第10頁/共79頁常用的適用于生物大分子研究的質譜技術方法包括FAB-MS、ESI-MS、MALDI-TOF-MS等，而其中又以ESI-MS和MALDI-TOF-MS應用最為廣泛，這兩個新技術明顯增加了質譜范圍和敏感度，從而導致了新的軟件和檢測器的發(fā)展。第11頁/共79頁電噴霧離子化技術（electrosprayionization，ESI）

原理：在一個金屬噴嘴的尖上加有2.5～6kV高電壓，經(jīng)強電場作用，樣品溶液從針尖小孔噴出，成為一個個帶正電的液滴。在迎面吹來的熱氮氣流的作用下，液滴表面溶劑蒸發(fā)，液滴變小，液滴的電荷密度驟增。當靜電排斥力等于液滴的表面張力時，液滴便發(fā)生崩解(庫侖爆炸)，形成更小的液滴。如此形成的小液滴以類似的方式繼續(xù)崩解，于是，液滴中的溶劑迅速蒸干，產(chǎn)生多電荷正離子，在質譜儀內被分析紀錄。第12頁/共79頁RayleighLimitReached++++++++++-----++++++++++-----++++++--++++++--Evaporation++ChargedDroplets

試樣離子準分子離子++++++++--其他離子第13頁/共79頁ESI-MS第14頁/共79頁Thehollowstainlesssteelneedleismaintainedatafewkilovolts(kV)relativetothechamberwallsandthecylindricalcathodesurroundingit.Theliquidsampleentersatarateof1–20μL/minthroughtheneedle,butlowerflowrates(10–100nL/min)arebecomingmorecommoninmoderninstrumentation.TheelectricfieldattheneedletipdispersestheliquidbyCoulombicforcesintoafinesprayofchargeddroplets.Thesedropletsmigrateinthefieldtowardtheglasscapillaryinlet.Aflowofdryinggas(typicallyN2at100mL/s)evaporatesthesolventfromthedroplets,sothattheirdiameterdecreases,andthesurfacechargedensityoneachdropletincreases.WhenthissurfacechargedensityreachestheRayleighlimit,theCoulombicrepulsionisapproximatelyequaltothesurfacetension,andthedropletexplodesintosmallerdroplets.第15頁/共79頁這種分子離子特點是帶多個電荷。這些離子的形成是靠吸附上或失去若干個質子而形成，所以在正離子或負離子譜上會觀察到(M+nH)n+或(M-nH)n-的峰。對于生物大分子，在ESI譜上出來的往往是一組帶不同電荷的分子離子峰，根據(jù)儀器上記錄下來的每個峰的質荷比及電荷數(shù)即可算出分子量值。第16頁/共79頁ESI-MS優(yōu)缺點優(yōu)點：解決了極性大、熱不穩(wěn)定的蛋白質與多肽分子的離子化和大分子質量、一級結構和共價修飾位點的測定問題。缺點：樣品中的鹽類對樣品結果影響很大，而且單個分子帶電荷不同可形成多種離子分子峰（重疊峰），所以對混合物的圖譜解析比較困難。第17頁/共79頁基質輔助激光解析電離(MALDI)待檢樣品與含有在特定波長下吸光的發(fā)光團的化學基質(matrix)混合，此樣品混合物隨即滴于一平板或載玻片上進行揮發(fā)，樣品混合物殘余水份和溶劑的揮發(fā)使樣品整合于格狀晶體中，樣品然后置于激光離子發(fā)生器(lasersource)。激光作用于樣品混合物，使化學基質吸收光子而被激活。此激活產(chǎn)生的能量作用于生物大分子（多肽），使之由固態(tài)樣品混合物變成氣態(tài)。第18頁/共79頁

由于多肽傾向于吸收單一光子，故多肽離子帶單一電荷.這些形成的多肽離子直接進入飛行時間質量分析儀(TOFmassanalyzer)。飛行時間質量分析儀用于測量多肽離子由分析儀的一端飛抵另一端探測器所需要的時間。TOF質量分析器被認為是與MALDI的最佳搭配。第19頁/共79頁MALDI-TOF-MS第20頁/共79頁MALDI-MS特點對于一些分子量較大或疏水性強的蛋白質，MALDI比ESI更有效。MALDI能有效地分析較復雜的肽混合物或物理化學性質相差較大的蛋白質混合物。只要能與所選擇的底物形成穩(wěn)定的分散體系的樣品都能用MALDI進行分析。MALDI不受樣品所含的添加物、緩沖液或鹽的影響，且靈敏度也比別的離子化方式高。第21頁/共79頁Yes±0.005%-0.01%to50kDA±0.02%-0.03%to150kDA≤150kDALowtolerance(≤20mM)fornonvolatilebuffers,alkalimetalsalts,detergents;onlineLC-MSusedforcontaminantremovalESINo±0.01%-0.05%to25kDA±0.05%-0.3%to300kDA≥350kDAHightolerance(≥50mM)foralkalimetalsalts,phosphate,urea,etc.;tolerantofsomenonionicdetergents;intolerantofSDSMALDICompatiblewithon-lineLC/CE-MSMassassignmentaccuracyMWrangeToleranceforbuffers,salts,anddetergentsIonizationmethod生物質譜兩種主要電離方法比較第22頁/共79頁2.3質量分析器質量分析器能將帶電離子根據(jù)其質荷比加以分離，質量分析器的主要技術參數(shù)是：質荷比的范圍（質量范圍）和分辨率。質量分析器類型：扇形磁分析器，四極桿分析器離子阱分析器，飛行時間分析器傅里葉變換分析器第23頁/共79頁四極桿分析器離子束在與棒狀電極平行的軸上聚焦，一個直流固定電壓（DC）和一個射頻電壓（RF）作用在棒狀電極上，兩對電極之間的電位相反。對于給定的直流和射頻電壓，特定質荷比的離子在軸向穩(wěn)定運動，其他質荷比的離子則與電極碰撞湮滅。第24頁/共79頁Thequadrupoleanalyzer(ormassfilter)isformedbyfourmetalrods(usuallyhigh-gradesteel),positionedpreciselyineachcornerofanimaginarysquare.Betweendiagonallyopposedrodsadirectcurrent(dc)voltageisapplied,withasuperimposedradiofrequency(rf)alternatingfield.Bothdcandrfvoltagesarescanned.Iontrajectoriesacrossthequadrupolearecomplicated.Undergivenconditionsofdcandrf,ionsofonlyonem/zvaluewillreachthedetector.Allotherm/zionspossessunstablepathsthatimpactontherods.第25頁/共79頁第26頁/共79頁三級四極桿質量分析器

第27頁/共79頁離子阱分析器由兩個端蓋電極和位于它們之間的類似四極桿的環(huán)電極構成。端蓋電極施加直流電壓或接地，環(huán)電極施加射頻電壓（RF），通過施加適當電壓就可以形成一個勢能阱（離子阱）。根據(jù)RF電壓的大小，離子阱就可捕獲某一質量范圍的離子。離子阱可以儲存離子，待離子累積到一定數(shù)量后，升高環(huán)電極上的RF電壓，離子按質量從高到低的次序依次離開離子阱，被電子倍增監(jiān)測器檢測。第28頁/共79頁飛行時間分析器有相同動能，不同質量的離子，因其飛行速度不同而分離。如果固定離子飛行距離，則不同質量離子的飛行時間不同，質量小的離子飛行時間短而首先到達檢測器。各種離子的飛行時間與質荷比的平方根成正比。第29頁/共79頁第30頁/共79頁Timeofflightanalyzers(TOF)allowionstomoveacrossavacuumtube(usuallynamedflighttube).IonsaregenerallyproducedbyMALDIorbyanothertechniquecapableofproducingdiscreteburstsofions.About100–500nsafterthelaserpulse,astrongaccelerationfieldisswitchedon,andthisimpartsafixedkineticenergytotheions.Astheionstravelacrossthevacuumtube,ionswithlowm/ztravelfasterandarriveatthedetectorfirst.第31頁/共79頁TOF分析器特點TOF質量分析器結果簡單，容易換算，蛋白質離子在飛行管內的飛行速度僅與質荷比的平方根成正比，因此容易通過計算蛋白質離子在飛行管內的飛行時間推算出蛋白質離子的m/z值。與傳統(tǒng)質量分析器相比，更易得到高分辨率和高測量精度；速度快，離子飛行時間僅為幾個μs和約100μs之間；質量范圍寬，可以直接檢測到幾十萬道爾頓的單電荷離子。第32頁/共79頁2.4檢測器具有特定m/z值的離子通過質量分析器打在檢測器上，在檢測器上產(chǎn)生的放大電流可以作為時間函數(shù)用來測定離子強度（豐度）和m/z。離子源產(chǎn)生的離子的相對強度可以由檢測器測量，其結果通常以m/z值作為橫坐標、離子相對豐度為縱坐標的形式表示。第33頁/共79頁質譜一般可以用兩種形式表示，一種是以歸一化（nomalized）的或者相對豐度（%RA）的形式來表述，另一種是以總離子流的百分數(shù)（%TIC）來描述。在歸一化的質譜中，最高的峰（largestpeak）（例如最豐富的離子，并不一定是所要研究的分析物）被稱為基峰（basepeak），其高度規(guī)定為100單位，譜中的其他峰的相對高度都根據(jù)這個峰進行規(guī)一化，一次它們的相對高度就介于0～100單位之間。第34頁/共79頁2.5串聯(lián)質譜兩個或更多的質譜連接在一起，稱為串聯(lián)質譜。最簡單的串聯(lián)質譜（MS/MS）由兩個質譜串聯(lián)而成，其中第一個質量分析器（MS1）將離子預分離或加能量修飾，由第二級質量分析器（MS2）分析結果。第35頁/共79頁TandemMSorMS/MShas2massspectrometersinseriesMS1MS2第36頁/共79頁MS/MS最基本的功能包括能說明MS1中的母離子和MS2中的子離子間的聯(lián)系。根據(jù)MS1和MS2的掃描模式，如子離子掃描、母離子掃描和中性碎片丟失掃描，可以查明不同質量數(shù)離子間的關系。最常用的就是將一級質譜的分子離子(圖譜稱MS1)和惰性原子再一次轟擊低能碰撞誘導斷裂（low-energycollision-induceddissociation，CID或稱碰撞輔助斷裂，collisionallyassisteddissociation，CAD)，從而獲得一張碎片圖譜(MS2)。第37頁/共79頁2.6聯(lián)用技術色譜可作為質譜的樣品導入裝置，并對樣品進行初步分離純化，因此色譜/質譜聯(lián)用技術可對復雜體系進行分離分析。因為色譜可得到化合物的保留時間，質譜可給出化合物的分子量和結構信息，故對復雜體系或混合物中化合物的鑒別和測定非常有效。第38頁/共79頁氣相色譜/質譜聯(lián)用（GC/MS）氣相色譜的流出物已經(jīng)是氣相狀態(tài)，可直接導入質譜。由于氣相色譜與質譜的工作壓力相差幾個數(shù)量級，開始聯(lián)用時在它們之間使用了各種氣體分離器以解決工作壓力的差異。隨著毛細管氣相色譜的應用和高速真空泵的使用，現(xiàn)在氣相色譜流出物已可直接導入質譜。第39頁/共79頁液相色譜／質譜聯(lián)用（LC/MS）液相色譜/質譜聯(lián)用主要用于分析GC/MS不能分析，或熱穩(wěn)定性差，強極性和高分子量的物質，如生物樣品（藥物與其代謝產(chǎn)物）和生物大分子（肽、蛋白、核酸和多糖）。在蛋白測序方面，LC-MS/MS得到了廣泛的應用。第40頁/共79頁LC-MS/MS第41頁/共79頁第42頁/共79頁其他聯(lián)用技術毛細管電泳/質譜聯(lián)用（CE/MS）芯片/質譜聯(lián)用（Chip/MS）

超臨界流體色譜/質譜聯(lián)用（SFC/MS）等離子體發(fā)射光譜/質譜聯(lián)用（ICP/MS）第43頁/共79頁第三節(jié)生物質譜的應用分子量的測定蛋白質、多肽純度的鑒定肽質量指紋譜肽序列測定技術蛋白質的翻譯后修飾鑒定蛋白質鑒定第44頁/共79頁INTERPRETATIONOFMASSSPECTRA關于同位素High-resolutionMSoflowmolecularweightcompoundsresultsinaseriesofisotopic同位素peaksfortheparentionandeachdetectablefragment.Theintensityofeachpeakintheseriesdependson

therelativeabundanceofagivenisotopeaswellasthenumberofatomsofagivenidentityinthedetectedfragment.第45頁/共79頁第46頁/共79頁第47頁/共79頁三種質量表示法：Themassofagivenchemicalspeciesmaybecalculatedinthreedifferentways.Thesimplestoftheseusestheinteger整數(shù)

massofthemostabundantisotopeofeachelement,andresultsinthenominal標稱

massofthespecies;thisvalueisnotparticularlyusefulinMS.

Themonoisotopicmass,calculatedusingtheexactmassofthemostabundantisotopeofeachelement,ismoreuseful,especiallyforhigh-resolutionMSoflowmolecularweightspecies.Forbiomoleculesandtheirfragmentions,themostusefulvalueistheaveragemass.Theaveragemassiscalculatedusingelementalatomicweightvaluesthatareaveragedoverallisotopes;thisvalueallowsthepositionoftheenvelopepeaktobepredicted.Table15.5showsexamplesofnominal,monoisotopic,andaveragemassvalues.第48頁/共79頁第49頁/共79頁3.1分子量的測定Eggwhitelysozyme,forexample,yieldsESI–massspectrawithfineparentpeaksbetweenm/zvaluesof1194and1791;thecorrespondingzvaluesare12–8第50頁/共79頁第51頁/共79頁用ESI-MS和MALDI-TOF-MS測定蛋白質和多肽的分子量，精確度可達0.1％～0.01％，這遠比其它方法(如SDS、凝膠過濾、超離心等）精確。第52頁/共79頁蛇毒類凝血酶活性分子量測定采用聚丙烯酰胺凝膠電泳，高效凝膠過濾色譜以及電噴霧離子化質譜三種方法對新發(fā)現(xiàn)的一種蛋白質（來源于福建尖吻蝮蛇蛇毒,是一種具有類凝血酶活性的弱酸性蛋白質）的分子量進行了測定。測定方法分子量非還原SDS-PAGE26.2kDa(二硫鍵未打開)還原SDS-PAGE29kDa(二硫鍵被還原)HPGFC24.5kDaESI-MS30298Da第53頁/共79頁3.2蛋白質、多肽純度的鑒定根據(jù)質譜測定分子量的作用，質譜還可用來作蛋白質、多肽純度的鑒定。只要質量有差異的雜質都可以被檢出，此方法靈敏度高，用量少(pmol水平)、速度快，并有獨到之處。第54頁/共79頁實例1：天花粉蛋白C-端微觀不均一，即有二個C末端，一個多一個Ala(即247個氨基酸殘基)，一個少一個Ala(即246個氨基酸殘基)，用ESI-MS完全能夠分辨出來第55頁/共79頁實例2：如豬胰島素和人胰島素混在一起，用MALDI-TOF-MS也能夠清楚地分出二個峰。兩者的差異僅在豬胰島素B鏈的第30位為Ala(89.09Da)，而人胰島素相應的位置為Thr(119.12Da)，兩者相差30Da。這些差異用其他方法是很難檢出的。第56頁/共79頁第57頁/共79頁3.3蛋白質鑒定

由于各種蛋白質的氨基酸序列(一級結構)不同，蛋白質被酶解后產(chǎn)生的肽段序列也各異，肽混合物質量數(shù)亦具特征性，稱為肽質量指紋譜(peptidemassfingerprint,PMF)，可用于蛋白質的鑒定。

第58頁/共79頁PMF流程第59頁/共79頁3.4蛋白質及多肽序列測定技術兩種經(jīng)典測序方法：

DNA順序測定解決不了翻譯后加工所導致的氨基酸殘基的修飾的問題；

Edman降解不能解決N端封閉的測序的問題。第60頁/共79頁Atypicalprocedureforproteinsequencingbeginsbydigestionwithaproteasesuchastrypsininordertoobtainacollectionoftrypticpeptides.Otherenzymesandtheircleavagesitesaredescribedelsewhere.

ThispeptidecollectioncanbeionizedusingESI,separatedbythefirstquadrupoleaccordingtom/zratios,andthenfragmented(CID),withtheresultingfragmentsanalyzedinthethirdquadrupole.第61頁/共79頁Themassspectrumcanbeanalyzedtoestablishthepeptidesequence,orcompareddirectlywithapeptidedatabase.Figure15.12depicts描述thistypicalprotocol.TheCIDprocedurecausesmoreorlessrandompeptidebondcleavage.第62頁/共79頁第63頁/共79頁肽段匹配法：直接用所得肽段信息或前體離子產(chǎn)生的未解析的CID圖譜與數(shù)據(jù)庫中的CID圖譜比較，如Sequest、Mascot、Sonat等算法；第64頁/共79頁第65頁/共79頁第66頁/共79頁第67頁/共79頁從頭測序法（denovosequence）:通過直接解釋MS/MS數(shù)據(jù)識別肽序列，這類系統(tǒng)和算法有Lutefisk、SHERENG、PEAKS、AuDeNS等,有時還要結合手工解析。

第68頁/共79頁用特定蛋白水解酶作用于蛋白質，將得到的肽段送入一級質譜，產(chǎn)生前體離子，經(jīng)過一定選擇的前體離子在碰撞室發(fā)生CID。結果是前體離子肽骨架酰胺鍵的特異性斷裂，