第五章-cDNA文庫構(gòu)建

第五章_cDNA文庫構(gòu)建第一頁，共72頁。以mRNA為模板反轉(zhuǎn)錄出的DNA稱cDNA。1.cDNAmRNAcDNA3’

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反轉(zhuǎn)錄酶引物2.cDNAlibrary利用某種生物的總mRNA合成cDNA，再將這些cDNA與載體連接，轉(zhuǎn)入細(xì)菌細(xì)胞中進(jìn)行保存和擴(kuò)增，稱cDNA文庫。第二頁，共72頁。cDNA文庫的特點(diǎn)1.基因特異性

來自結(jié)構(gòu)基因，僅代表某種生物的一小部分遺傳信息，且只代表正在表達(dá)的基因的遺傳信息：2.器官特異性

不同器官或組織的功能不一樣，因而有的結(jié)構(gòu)基因的表達(dá)就具有器官特異性，故由不同器官提取的mRNA所組建的cDNA文庫也就不同。第三頁，共72頁。3.代謝或發(fā)育特異性

處于不同代謝階段（或發(fā)育階段）的結(jié)構(gòu)基因表達(dá)亦不相同。

4.不均勻性

在同一個(gè)cDNA文庫中，不同類型的cDNA分子的數(shù)目是大不相同的，盡管它們都是由單拷貝基因轉(zhuǎn)錄而來的。

5.各cDNA均可獲得表達(dá)第四頁，共72頁。建立cDNA文庫的一般程序1.mRNA的分離與純化載體DNA片段的制備。2.雙鏈cDNA的合成。

1）單鏈cDNA的合成：反轉(zhuǎn)錄法2）第二條cDNA的合成：堿解或酶解（RNaseH）法除去RNA分子3.cDNA克隆載體的制備。4.ds-cDNA與載體DNA相連。5.重組cDNA分子的導(dǎo)入和克隆。第五頁，共72頁。第一節(jié)將RNA轉(zhuǎn)變成cDNA一、mRNA的分離純化

總RNA的提取RNA不穩(wěn)定：核糖環(huán)上的2`－OH促使對(duì)磷酸二酯鍵的親水性攻擊。異硫氰酸胍法：異硫氰酸胍可裂解細(xì)胞，使RNA與蛋白質(zhì)分離，將RNA釋放到溶液中。加入苯酚、氯仿，可促使RNA進(jìn)入水相，離心后可形成水相層和有機(jī)層，這樣RNA與仍留在有機(jī)相中的蛋白質(zhì)和DNA分離開。水相層（無色）為RNA，有機(jī)層（黃色）為DNA和蛋白質(zhì)。

RNA酶的降解RNA分子不穩(wěn)定RNA易遭降解第六頁，共72頁。RNA分子結(jié)構(gòu)RNA抽提第七頁，共72頁。2、mRNA的分離純化mRNA只占總RNA的1%-5%。原理：利用mRNA都含有一段polyA尾巴，將mRNA從總RNA中分離純化。方法：

寡聚（dT）-纖維素柱層析法。第八頁，共72頁。mRNA純化第九頁，共72頁。二、cDNA合成cDNA的合成包括第一鏈和第二鏈cDNA的合成。第一鏈cDNA的合成是以mRNA為模板，反轉(zhuǎn)錄為cDNA，有反轉(zhuǎn)錄酶催化，該酶合成DNA時(shí)需要引物引導(dǎo)，常用引物是oligodT。第二鏈合成是以第一鏈為模板，由DNA聚合酶催化。第十頁，共72頁。cDNA的第一鏈合成反轉(zhuǎn)錄：以RNA為模板，合成DNA。與通常轉(zhuǎn)錄過程中遺傳信息流從DNA到RNA的方向相反。禽類成髓細(xì)胞瘤病毒（AMV)的反轉(zhuǎn)錄酶

一類能引起鳥類等動(dòng)物白血病、肉瘤以及其它腫瘤的病毒。其反轉(zhuǎn)錄酶由一個(gè)α亞基和一個(gè)β亞基組成，有二種酶活力。1）RNA指導(dǎo)的DNA聚合酶活力。2）RNaseH酶活力，水解RNA—DNA雜種分子中的RNA，可沿3’→5’和5’→3’兩個(gè)方向起外切酶作用。第十一頁，共72頁。莫洛尼氏鼠白血病病毒（MMLV)的反轉(zhuǎn)錄酶此酶是一條單一的多肽鏈，有RNA聚合酶的活性，RNaseH的活性減弱。第十二頁，共72頁。引物1、OligodT引物2、隨機(jī)引物（六聚體寡核苷酸）這種非特異性引物可沿著mRNA多個(gè)位點(diǎn)結(jié)合3、特異性引物。反轉(zhuǎn)錄酶mRNAcDNA3’

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AAAAAAATTTTTTT第十三頁，共72頁。在總的RNA中可作為具有mRNA的特異引物文庫不能完全包含基因編碼序列產(chǎn)生一個(gè)大的具有特定序列的cDNA文庫cDNA產(chǎn)物可能是小的，不具有多聚腺苷的模板也被可利用可產(chǎn)生大量特定基因的cDNA文庫產(chǎn)生的cDNA文庫應(yīng)用范圍有限第十四頁，共72頁。第一鏈合成過程mRNAcDNA3’

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反轉(zhuǎn)錄酶引物mRNAcDNA第一鏈3’

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引物cDNA第一鏈3’

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引物或RNaseH堿第十五頁，共72頁。第十六頁，共72頁。第二鏈合成剩下的cDNA單鏈的3’末端可能形成一個(gè)彎回來的雙鏈發(fā)卡結(jié)構(gòu)（機(jī)理不明），可成為合成第二條cDNA鏈的引物。用DNA聚合酶合成第二鏈DNA。cDNA第一鏈5’

cDNA第二鏈合成DNA聚合酶cDNA第一鏈cDNA第二鏈5’

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第十七頁，共72頁。用核酸酶S1可以切掉發(fā)卡結(jié)構(gòu)（但這會(huì)導(dǎo)致cDNA中有用的序列被切掉）。核酸酶S1cDNA第一鏈cDNA第二鏈5’

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cDNA第一鏈cDNA第二鏈5’

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第十八頁，共72頁。cDNA合成缺點(diǎn)：合成效率低;〈1%mRNA能合成cDNA。第十九頁，共72頁。

改進(jìn)RNaseH酶能識(shí)別mRNA-cDNA雜交分子中的mRNA，并將其降解成許多小片斷。小片斷正好成為DNA聚合酶的引物，用來合成岡崎片斷。DNA聚合酶I能除去引物并修補(bǔ)后再使用DNA連接酶連成一整條DNA鏈。第二十頁，共72頁。mRNAcDNA3’

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反轉(zhuǎn)錄酶引物mRNAcDNA第一鏈3’

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引物mRNAcDNA第一鏈3’

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mRNAmRNADNA聚合酶DNA聚合酶cDNA第二鏈cDNA第一鏈3’

RNaseHDNAligase去引物第二十一頁，共72頁。cDNA末端修飾借助末端轉(zhuǎn)移酶給載體和雙鏈cDNA的3’端分別加上幾個(gè)C或G，成為粘性末端。在雙鏈cDNA末端接上人工接頭，即可與載體連接，轉(zhuǎn)入受體菌。

接上人工接頭粘性末端CCCCCC末端轉(zhuǎn)移酶第二十二頁，共72頁。加人工接頭第二十三頁，共72頁。第二十四頁，共72頁。三、cDNA克隆載體如果用功能測定來篩選目的基因，可用質(zhì)粒載體來構(gòu)建cDNA的表達(dá)文庫。如果通過分子雜交或抗體篩選目的基因，可用噬菌體載體構(gòu)建cDNA文庫。λ噬菌體載體－λZapcDNA載體

第二十五頁，共72頁。λZapcDNA載體優(yōu)點(diǎn)：1、高的轉(zhuǎn)染效率2、可在體內(nèi)用M13輔助噬菌體將其變?yōu)檎婧松锏馁|(zhì)粒表達(dá)載體。含有一個(gè)真核啟動(dòng)子第二十六頁，共72頁。第二十七頁，共72頁。λZapcDNA

載體的噬菌粒營救第二十八頁，共72頁。第二節(jié)cDNA文庫的篩選表達(dá)分析核酸原位雜交1、已知氨基酸序列的相關(guān)簡并密碼子探針；2、純化蛋白質(zhì)的相應(yīng)抗體探針；3、差異表達(dá)的扣除cDNA探針。第二十九頁，共72頁。一、簡并寡核苷酸探針簡并探針：是指代表編碼單個(gè)氨基酸所有不同堿基可能性的不同序列的混合物。為了增加特異性,可以參考密碼子使用表,根據(jù)不同生物的堿基使用偏好,減少簡并性。在探針庫中，只有一種與目的基因完全互補(bǔ)。一般為17個(gè)核苷酸，序列相同，堿基組成不同。雜交時(shí)借助一定濃度氯化四甲銨控制解鏈溫度（Tm)。第三十頁，共72頁。第三十一頁，共72頁。操作過程第三十二頁，共72頁。簡并探針的假陽性由于探針庫中只有一種是與目的基因完全互補(bǔ)的，其它的探針有可能與不相關(guān)的片斷雜交，產(chǎn)生假陽性信號(hào)。方法：1、制備“猜測體探針”2、PCR猜測體技術(shù)

第三十三頁，共72頁。解決方法：1）制備“猜測體探針”一種人工合成的用于分離克隆基因的低簡并性的寡核苷酸探針，其核苷酸序列是根據(jù)特定物種當(dāng)中某種已知蛋白質(zhì)的密碼子使用頻率，同時(shí)又采納了根據(jù)猜測最可能在目的基因中出現(xiàn)的密碼子資料，選擇含有密碼子簡并程度最低的蛋白質(zhì)區(qū)段進(jìn)行合成。較長的唯一的寡核苷酸序列，它能夠大范圍的卻不能夠完全的同靶序列互補(bǔ)。第三十四頁，共72頁。第三十五頁，共72頁。2）PCR猜測體技術(shù)

步驟：1、根據(jù)末端32個(gè)氨基酸序列，設(shè)計(jì)PCR簡并引物；2、以cDNA為模板；對(duì)目的基因特異性擴(kuò)增；3、產(chǎn)物連接到載體上克隆，用唯一猜測體探針雜交，選擇陽性克??；4、分離的克隆中部為32氨基酸序列，兩側(cè)為引物序列；5、用這段插入序列為探針，篩選噬菌體cDNA文庫。第三十六頁，共72頁。根據(jù)末端32個(gè)氨基酸序列，設(shè)計(jì)PCR簡并引物，以cDNA為模板，進(jìn)行擴(kuò)增用猜測探針雜交篩選陽性克隆PCR-猜測體探針第三十七頁，共72頁。二、抗體探針利用免疫學(xué)的原理，檢測克隆基因的表達(dá)產(chǎn)物。第三十八頁，共72頁。抗體鑒別陽性克隆用專門設(shè)計(jì)的表達(dá)載體，將真核基因編碼的蛋白質(zhì)在大腸桿菌中實(shí)現(xiàn)表達(dá)，通過免疫化學(xué)法進(jìn)行檢測。第三十九頁，共72頁。第四十頁，共72頁。三、差示雜交需要兩種不同的細(xì)胞群體（目的基因正常表達(dá)、目的基因不表達(dá)），分別制備兩種不同mRNA提取物，以兩種總mRNA探針（或以相應(yīng)的cDNA作探針)平行雜交，對(duì)有表達(dá)目的基因的細(xì)胞總mRNA構(gòu)建的克隆文庫進(jìn)行篩選。第四十一頁，共72頁。第四十二頁，共72頁。差別雜交的局限性：1.雜交靈敏度低，對(duì)于低峰度的mRNA尤為明顯。2.工作量大，重復(fù)性差，兩套平行濾膜之間的DNA保有量有差別，導(dǎo)致雜交信號(hào)不一致。第四十三頁，共72頁。四、扣除雜交原理：去除普遍共同存在的、或是非誘發(fā)產(chǎn)生的cDNA序列，從而使欲分離的目的基因的序列得到有效的富集。羥基磷灰石柱結(jié)合單鏈DNA-RNA或DNA-DNA雙鏈，不結(jié)合單鏈DNA第四十四頁，共72頁。操作：從表達(dá)A蛋白和不表達(dá)A蛋白的組織細(xì)胞中分別提取和分離總mRNA。將表達(dá)A蛋白的總mRNA合成cDNA第一鏈；作為探針群同不表達(dá)A蛋白的總mRNA雜交成cDNA-mRNA雙鏈。不能雜交的cDNA即為特異表達(dá)的A基因的cDNA單鏈。用羥磷灰石柱收集單鏈cDNA，合成為雙鏈DNA進(jìn)行擴(kuò)增、克隆、測序。第四十五頁，共72頁。AAA組織B組織總mRNA（A）總mRNA（B）含蛋白A的mRNA不含蛋白A的mRNA總cDNA第一鏈A雜交內(nèi)含蛋白A的cDNA羥磷灰石柱過柱吸收RNA-DNA羥磷灰石柱BAPCRcDNA文庫第四十六頁，共72頁。分離缺失突變的目的基因第四十七頁，共72頁。第三節(jié)cDNA表達(dá)文庫的功能篩選一、蛋白質(zhì)活性分析1、真核的表達(dá)文庫組成混合池，轉(zhuǎn)染動(dòng)物細(xì)胞，鑒定目的基因的功能，篩選出目的基因的克隆重組體。2、功能性探針篩選噬菌體表達(dá)文庫。3、定向克隆cDNA庫，體外轉(zhuǎn)錄mRNA,再將其注導(dǎo)入適當(dāng)?shù)募闹骷?xì)胞，分析表達(dá)蛋白質(zhì)功能。第四十八頁，共72頁。二、酵母雙雜交系統(tǒng)又叫相互作用陷阱，有效的分離能與已知的靶蛋白相互作用的蛋白質(zhì)的編碼基因。應(yīng)用范圍：鑒定新的蛋白與蛋白相互作用；鑒定蛋白級(jí)聯(lián)底物；鑒定突變對(duì)蛋白與蛋白結(jié)合的影響；在已知的相互作用中鑒定干擾蛋白質(zhì)。第四十九頁，共72頁。基本原理：許多真核生物的轉(zhuǎn)錄激活因子都是由兩個(gè)結(jié)構(gòu)上可以分開的、功能上相互獨(dú)立的結(jié)構(gòu)域組成；應(yīng)用重組DNA技術(shù)，可以將來自同一個(gè)轉(zhuǎn)錄因子的、或者兩種不同轉(zhuǎn)錄因子的結(jié)構(gòu)域分開，分開的兩種結(jié)構(gòu)域在體內(nèi)重新組裝成具有功能的轉(zhuǎn)錄因子，從而激活UAS（上游激活序列）下游啟動(dòng)子調(diào)節(jié)的報(bào)告基因的表達(dá)。第五十頁，共72頁。例：釀酒酵母的半乳糖苷酶基因（lacZ)的轉(zhuǎn)錄激活因子GAL4，在N端1～147位氨基酸區(qū)段有一個(gè)DNA結(jié)合域（DNA-BD）；在C端768～881位氨基酸區(qū)段有一個(gè)轉(zhuǎn)錄激活域（AD），DNA-BD能識(shí)別上游激活序列（USA)并與之結(jié)合；AD通過同轉(zhuǎn)錄機(jī)制中的其它成份之間的結(jié)合作用啟動(dòng)USA下游基因進(jìn)行轉(zhuǎn)錄。用DNA重組技術(shù)將它們分開，即使在同一個(gè)寄主中表達(dá)，它們不能激活lacZ基因進(jìn)行轉(zhuǎn)錄。第五十一頁，共72頁。組成元件1.用于篩選的報(bào)告基因lacZ（寄主基因組內(nèi)）；2.pGBT9(DNA-BD載體)：插入了BD和誘餌基因；3.pGAD424(AD載體)：插入AD基因和待測的靶蛋白基因。外源基因都按正確的取向和讀碼結(jié)構(gòu)插入在載體的MCS內(nèi)，表達(dá)的靶蛋白和誘餌蛋白分別會(huì)同BD和AD之間產(chǎn)生融合作用，形成雜種蛋白質(zhì)。寄主菌株：剔除掉GAL4基因的釀酒酵母第五十二頁，共72頁。第五十三頁，共72頁。酵母雙雜交文庫篩選策略第五十四頁，共72頁。第五十五頁，共72頁。優(yōu)點(diǎn)：快速獲得相互作用蛋白的基因；只需單一步驟的質(zhì)粒構(gòu)建；在體內(nèi)鑒定蛋白的相互作用；弱小的，暫時(shí)的相互作用也能鑒定；能在整個(gè)時(shí)間段積聚弱小的相互作用信號(hào)。第五十六頁，共72頁。缺點(diǎn)：(1)雙雜交系統(tǒng)分析蛋白間的相互作用定位于細(xì)胞核內(nèi),而許多蛋白間的相互作用依賴于翻譯后加工如糖基化、二硫鍵形成等,這些反應(yīng)在細(xì)胞核內(nèi)無法進(jìn)行。(2)容易出現(xiàn)“假陽性”。通常由以下原因造成:prey蛋白的非特異性結(jié)合；無需與誘餌蛋白結(jié)合就能誘導(dǎo)報(bào)告基因的轉(zhuǎn)錄。第五十七頁，共72頁。三、cDNA噬菌體展示將編碼特異蛋白的基因序列插入噬菌體基因組，并使之與噬菌體外殼蛋白編碼基因相融合。重組噬菌體侵染宿主細(xì)菌后，復(fù)制形成大量帶有雜合外殼蛋白的噬菌體顆粒，直接用于捕獲靶蛋白庫中與外源蛋白質(zhì)相互作用的蛋白質(zhì)。PIII基因型表達(dá)型第五十八頁，共72頁。實(shí)驗(yàn)策略構(gòu)建一個(gè)含靶蛋白的噬菌粒載體M13助噬菌體供體大腸桿菌（寄主細(xì)胞）第五十九頁，共72頁。篩選方法被展示的多肽或蛋白可以保持相對(duì)獨(dú)立的空間結(jié)構(gòu)和生物活性，以利于靶分子的識(shí)別和結(jié)合，此叫“多肽文庫”。將靶蛋白分子固定于固相上，與“肽庫”經(jīng)過一定時(shí)間孵育后，洗去未結(jié)合的游離噬菌體，然后洗脫與靶分子結(jié)合吸附的噬菌體，收集并感染宿主細(xì)胞后經(jīng)繁殖擴(kuò)增，進(jìn)行下一輪洗脫。經(jīng)過3輪～5輪的“吸附-洗脫-擴(kuò)增”后，與靶分子特異結(jié)合的噬菌體得到高度富集。第六十頁，共72頁。第六十一頁，共72頁。常用的免疫抗體第六十二頁，共72頁。優(yōu)點(diǎn)淘選的高效率使得在極低的存在水平下，可挑選到高親和力噬菌體；所挑選到的噬菌體可在微量存在