基因工程和基因組學(xué)課件

第九章基因工程和基因組學(xué)

遺傳工程或基因工程，是將分子遺傳學(xué)的理論與技術(shù)相結(jié)合，用來改造、創(chuàng)建動、植物新品種，工業(yè)化生產(chǎn)生物產(chǎn)品，診斷和治療人類遺傳疾病的一個新領(lǐng)域。本章介紹遺傳工程的基本原理和方法，基因組學(xué)的發(fā)展及應(yīng)用前景。廣義遺傳工程包括:生化工程、蛋白質(zhì)工程、細(xì)胞工程、染色體工程、細(xì)胞器工程、基因工程及酶工程等。狹義遺傳工程是指:基因工程(重組DNA技術(shù))。

一、基因工程概述:第一節(jié)基因工程１.概念：基因工程：在分子水平上，采取工程建設(shè)方式

按照預(yù)先設(shè)計(jì)的藍(lán)圖

借助于實(shí)驗(yàn)室技術(shù)將某種生物的基因或基因組轉(zhuǎn)移到另一種生物中去

使后者定向獲得新遺傳性狀的一門技術(shù)?；蚬こ碳夹g(shù)的建立，使所有實(shí)驗(yàn)生物學(xué)領(lǐng)域產(chǎn)生巨大的變革。基因工程是采用分子生物學(xué)、核酸生物化學(xué)以及微生物遺傳學(xué)的現(xiàn)代方法和手段建立起來的綜合技術(shù)。1982年，美國食品衛(wèi)生和醫(yī)藥管理局批準(zhǔn)，用基因工程在細(xì)菌中生產(chǎn)人的胰島素投放市場。1985年，轉(zhuǎn)基因植物獲得成功。1994年，延熟保鮮的轉(zhuǎn)基因番茄商品生產(chǎn)。1996年，克隆羊誕生。1996年全世界轉(zhuǎn)基因植物種植面積為170萬公頃，1997年為1100萬公頃，1998年為2780萬公頃，1999年達(dá)到3990萬公頃，2000年達(dá)到4420萬公頃，2001年達(dá)到5260萬公頃，2002年達(dá)到5000萬公頃。2001年種植面積已超過100萬公頃的作物有：大豆（3330萬hm2，占全世界轉(zhuǎn)基因作物的63%，均為抗除草劑大豆）、玉米（980萬hm2，占19%）、棉花（680萬hm2，占13%）、油菜（270萬hm2，5%）；其它還有水稻、小麥、花生、向日葵、亞麻、甘藍(lán)、馬鈴薯等，番茄、煙草、南瓜和木瓜等50多種轉(zhuǎn)基因作物已實(shí)現(xiàn)商品化。主要分布在美國（3570萬hm2）、阿根廷（1180萬hm2）、加拿大（320萬hm2）和中國（150萬hm2）等國。2001年全世界轉(zhuǎn)基因作物占相應(yīng)種植總面積的百分率3．內(nèi)容：①．從細(xì)胞和組織中分離DNA；②．限制性內(nèi)切酶酶切DNA分子，制備DNA片段；③．將酶切DNA分子與載體DNA連接構(gòu)建能在宿主細(xì)胞內(nèi)自我復(fù)制的重組DNA分子；④．把重組DNA分子引入宿主受體細(xì)胞復(fù)制；⑤．重組DNA隨宿主細(xì)胞的分裂而分配到子細(xì)胞建立無性繁殖系(Clone)或發(fā)育成個體；⑥．從細(xì)胞群體中選出所需要的無性繁殖系并使外源基因在受體細(xì)胞中正常表達(dá)，翻譯成蛋白質(zhì)等基因產(chǎn)物、回收；或篩選出獲得定向的性狀變異的個體。1.限制性內(nèi)切酶(restrictionenzyme)：一種水解DNA的磷酸二脂酶，遺傳工程中重要工具。這種酶能識別雙鏈DNA分子中一段特異的核苷酸序列，在這一段序列內(nèi)將雙鏈DNA分子切斷。

細(xì)菌細(xì)胞中存在限制修飾系統(tǒng)：限制：降解外源DNA，防御異源遺傳信息進(jìn)入的手段。修飾：修飾外源DNA片段后，保留在新細(xì)胞中。二、限制性內(nèi)切核酸酶⑴．限制性內(nèi)切酶的命名：根據(jù)其來自的生物名稱，用英文字母和數(shù)字表示；②.HindⅢ來自Haemophilusinfluenzae。①.EcoRI來自Escherichiacoli；⑵．限制性內(nèi)切酶的類別：第Ⅰ類酶:每隔一段DNA序列隨機(jī)切割雙鏈DNA分子，沒有序列特異性,酶切位點(diǎn)不定。

如EcoB(大腸桿菌B株)、EcoK(大腸桿菌K株)分子量較大(約300000)，作用時需ATP、Mg++等輔助因子。第Ⅱ類酶:能識別一段特異的DNA序列，準(zhǔn)確地酶切雙鏈DNA的特異序列。如EcoRI(大腸桿菌)、HindⅢ(嗜血桿菌)，分子量較小(約20000-100000)，作用時需Mg2+存在。第Ⅱ類酶特點(diǎn)：(1)切割產(chǎn)生平末端(bluntends)如SmaⅠ：載體：將“目的”基因?qū)胧荏w細(xì)胞的運(yùn)載工具。DNA片段與適合的載體DNA連接構(gòu)成重組DNA在載體DNA的運(yùn)載下，高效率地進(jìn)入宿主細(xì)胞，并在其中進(jìn)行復(fù)制。DNA載體：質(zhì)粒、噬菌體、病毒、細(xì)菌或酵母菌人工染色體等。三、載體（vector）：載體的條件：①.具有復(fù)制原點(diǎn)，能自我復(fù)制；②.具多克隆位點(diǎn)(multiplecloningsite，MCS或Polylinkerregion)即有多種限制酶的切點(diǎn)；③.選擇時的遺傳標(biāo)記，如抗生素基因；④.易從宿主細(xì)胞中回收。如pUC18質(zhì)粒具有以下特點(diǎn)：③.克隆位點(diǎn)的酶切位點(diǎn)多，克隆方便；④.具有a－互補(bǔ)的顯色表型，用于檢測重組質(zhì)粒的選擇標(biāo)記。①.分子量小，可接受較大外源片段；②.拷貝數(shù)多，每個細(xì)胞中有500個；噬菌體DNA中間約2/3的序列為中間基因簇，位于兩端的為DNA左、右臂。中間基因簇可被外源DNA替代而不影響浸染細(xì)菌的能力。能接受15-23kb外源DNA片段，可以作為cDNA或核DNA克隆的載體。㈡、λ噬菌體(溫和型)：基因組全長49kb。優(yōu)點(diǎn)：2.不易引起生物危害，有助于“目的”基因進(jìn)入細(xì)胞并增殖；1.攜帶大片段外源DNA分子，可占用總量的25%時仍不失活。指能在兩種不同的生物中復(fù)制的載體。如能在原核生物（如E.coli）、真核細(xì)胞（如酵母）中復(fù)制的載體。穿梭載體需同時具有細(xì)菌質(zhì)粒的復(fù)制原點(diǎn)、真核生物自主復(fù)制序列(Auto-nomouslyreplicatingsequence,ARS)以及兩者的選擇標(biāo)記。㈣、穿梭載體（shuttlevectors）：穿梭載體在細(xì)菌中用于克隆、擴(kuò)增基因，在酵母菌中用于基因表達(dá)分析。酵母菌的YEp系列載體(yeastepisomaplasmid)YIp和YRp系列載體均是穿梭載體。YEp24具有Amp及Tc二個抗生素抗性基因，可將外源DNA片段插在抗生素基因中，通過插入失活,選擇陽性克隆。

㈦、Ti質(zhì)粒及其衍生載體：適合于植物的載體系統(tǒng)將重組DNA運(yùn)載到植物細(xì)胞并使目的基因表達(dá)。Ti質(zhì)粒是一種細(xì)菌質(zhì)粒，它自然存在于土壤農(nóng)桿菌(革蘭氏陰菌)(Agrobacteriumtumefaciens)細(xì)胞中可誘導(dǎo)植物產(chǎn)生瘤細(xì)胞(tumor-Inducing,Ti)冠癭瘤(growngalltumors)。Ti質(zhì)粒一部分DNA叫轉(zhuǎn)移DNA

(transferDNA，T-DNA)，當(dāng)農(nóng)桿菌感染植物時，T-DNA便轉(zhuǎn)移到植物的染色體上，誘導(dǎo)冠癭瘤，并能合成冠癭堿(opine)，作為農(nóng)桿菌的碳源和氮源。農(nóng)桿菌感染產(chǎn)生冠纓瘤一般而言，一個基因

是編碼一條多肽鏈的一個DNA片段，包括啟動子、終止子及內(nèi)含子等。

在DNA重組技術(shù)出現(xiàn)之前，由于DNA分子量大而結(jié)構(gòu)單一，DNA是細(xì)胞中最難分析的大分子。DNA重組技術(shù)發(fā)展成功之后，DNA已成為細(xì)胞中最易操作分析的大分子。四、基因的分離與鑒定：利用這一技術(shù)，可從一個含有10萬個基因的大基因組中，準(zhǔn)確地分離出特異的單個目的基因。1.體外通過限制性內(nèi)切酶的修剪和DNA連接酶的連接；2.目標(biāo)DNA分子+載體DNA，共價連接；3.獲得重組DNA分子。DNA的體外重組：分離與鑒定基因是DNA重組中的關(guān)鍵步驟之一。分離的基因可用于分析基因序列、結(jié)構(gòu)與表達(dá)，又可為基因工程提供目的基因。㈠、從基因庫中分離基因：1.構(gòu)建基因庫（library）基因庫是一組DNA和cDNA序列克隆的集合體。根據(jù)克隆核酸序列、來源，基因庫可分為：核基因庫、染色體庫、cDNA庫、線粒體庫等。①.核基因庫：核基因庫(genomiclibrary)：將某生物全部基因組DNA酶切后與載體連接構(gòu)建而成的。理想的核基因庫應(yīng)能包括全部基因組序列。構(gòu)建文庫可采用不同的載體：

質(zhì)粒載體：重組質(zhì)粒導(dǎo)入感受態(tài)細(xì)胞，收集所有菌落。噬菌體或(柯斯質(zhì)粒)載體：重組DNA包裝進(jìn)噬菌體，感染細(xì)菌，收集噬菌斑。BAC(細(xì)菌人工染色體)或YAC(酵母人工染色體)載體：重組人工染色體，導(dǎo)入相應(yīng)宿主細(xì)胞，收集所有細(xì)胞，即為基因庫。

②.染色體基因庫：將基因組的一部分如一條染色體用來構(gòu)建基因庫可選擇特異基因以及分析染色體結(jié)構(gòu)和組織。果蠅的多線染色體中，對染色體進(jìn)行微切割，構(gòu)建染色體區(qū)段基因文庫。如對X染色體上多線染色體帶的分析。人類基因組項(xiàng)目研究中，利用流動細(xì)胞分離(flowcytometry)技術(shù)將人類染色體分開，用于構(gòu)建單個染色體基因庫，大大加速了人類基因組作圖和分析。流式細(xì)胞分離原理分離后的染色體進(jìn)行涂色驗(yàn)證酵母菌：利用改良的脈沖電泳方法(pulsedfieldgelelectro-phoresis,PFGE)，將酵母菌16根染色體據(jù)其分子量大小分開后，用于構(gòu)建染色體庫，在基因組分析中發(fā)揮作用。③.cDNA庫：以mRNA為模板經(jīng)反轉(zhuǎn)錄酶合成互補(bǔ)DNA構(gòu)建基因庫。真核生物mRNA的5’端具有一段多聚A尾端序列得到的雙鏈DNA分子經(jīng)兩端補(bǔ)齊后以帶有限制性酶切點(diǎn)的人工接頭連接酶切后與載體(通常是噬菌體)連接制備cDNA庫。cDNA庫與核DNA庫不同：cDNA庫僅具有細(xì)胞或組織內(nèi)表達(dá)基因的mRNA序列僅包括基因組的部分基因序列。cDNA庫對于研究基因的表達(dá)模式、分離某一特定基因是十分有用的。通常是將cDNA庫與核基因庫配合使用，以便既能得到基因的編碼序列，又可得到基因的調(diào)控序列。2.篩選基因庫：根據(jù)待選基因相關(guān)信息

確定篩選方法和條件從基因庫中篩選、分離基因。多數(shù)方法是利用一段核苷酸序列(DNA、cDNA或寡聚核苷酸)或抗體作探針(Probe)，用放射性同位素或非放射性同位素標(biāo)記探針

篩選基因庫。篩庫過程：將轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染后菌落印影在濾膜上用堿裂解、中和后洗滌烘干再用目的基因的放射性DNA或mRNA作探針進(jìn)行雜交放射性自顯影凡黑點(diǎn)菌落即為陽性克隆。①.限制性酶圖譜：構(gòu)建陽性克隆的限制性酶圖譜

根據(jù)同源性分析，可了解陽性克隆片段的酶切位點(diǎn)及相對位置

用于進(jìn)一步亞克隆或同已知的其它序列比較。3.陽性克隆的分析與鑒定：從基因庫中篩選出的陽性克隆

分析、鑒定

得到目的基因。圖示：一個15kbDNA片段的限制性酶圖譜構(gòu)建方法。將陽性克隆DNA分裝3個管中酶切DNA瓊脂糖凝膠電泳溴化乙錠染色紫外燈下見到DNA帶。

從凝膠電泳結(jié)果分析：模式Ⅱ就是這個15kbDNA片段用上述兩種酶酶切后的限制性酶圖譜。用類似的方法，將不同DNA用限制性酶消化，根據(jù)其產(chǎn)生的多型性，即限制性酶片段長度的多型性來分析DNA水平的變異程度，以RFLP作為分子標(biāo)記進(jìn)行基因組圖譜分析。②.核酸分子雜交：Southern雜交分析：由英國的Southern發(fā)明(1975)，一種將瓊脂糖中的DNA轉(zhuǎn)移到尼龍膜進(jìn)行DNA分子雜交分析的方法。篩選基因庫得到陽性克隆后將限制性酶酶切與Southern雜交結(jié)合繪制限制性酶圖譜。Northern雜交分析：與Sorthern雜交相同的原理和程序。用于分析克隆的基因在某一細(xì)胞或組織的轉(zhuǎn)錄水平，檢測mRNA的存在。Western雜交分析：用于蛋白質(zhì)的分析。③.核酸序列測定克隆后的DNA片段進(jìn)行核酸序列測定后確定該DNA片段序列的正確性。一般采用Sanger(1977)發(fā)明的雙脫氧核糖核酸終止法測定核酸序列。在Sanger雙脫氧法中，可用熒光標(biāo)記來代替放射性標(biāo)記：④.核酸序列分析：測定的核酸序列是否為基因、有什么功能，需用計(jì)算機(jī)軟件或生物學(xué)實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步分析。（1）同源性比較將待測序列在核酸和蛋白質(zhì)兩個水平上比較基因間的同源性，將序列發(fā)送到Blast等DNAData數(shù)據(jù)庫進(jìn)行比較。核酸序列分析方法：對于那些同已知序列無任何同源性的新序列，可能還要進(jìn)行基因功能性研究。一個ORF是一條能編碼一條多肽鏈的DNA序列，具有翻譯起始信號和終止信號等。（2）分析核酸序列的閱讀框架PCR反應(yīng)三個步聚(一個循環(huán))：1.變性：94-95℃使模板DNA雙鏈變成單鏈；2.復(fù)性：50-70℃下，引物分別與互補(bǔ)的DNA單鏈互補(bǔ)配對；3.延伸：在引物的引導(dǎo)和Taq酶作用下，于72℃下合成模板DNA的互補(bǔ)鏈。PCR反應(yīng)通常有25-35個循環(huán)，一般可擴(kuò)增5kb左右的片段。由該技術(shù)衍生出一些新的技術(shù)，如RAPD和AFLP等技術(shù)。㈡、PCR擴(kuò)增基因：聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(polymerasechainReaction，PCR)可以體外快速擴(kuò)增DNA。美國Mullis(1986)發(fā)明，是現(xiàn)代生物學(xué)發(fā)展史上的一個里程碑。㈢、人工合成基因：根據(jù)已知的基因或氨基酸序列，將化學(xué)合成寡核苷酸的方法與酶促合成DNA的方法結(jié)合起來可很快地人工合成基因。如SOE-PCR技術(shù)可擴(kuò)增出完整的基因序列。1.化學(xué)合成的寡聚核苷酸(80-100個核苷酸)通過SOE將單鏈部分補(bǔ)齊；2.PCR擴(kuò)增DNA片段；3.DNA變性；4.兩個單鏈部分經(jīng)SOE補(bǔ)齊雙鏈；5.PCR擴(kuò)增DNA，利用多級SOE-PCR擴(kuò)增出完整的基因。目前，基因工程研究發(fā)展迅速，已取得一系列重大突破。基因工程技術(shù)已廣泛用于工業(yè)、農(nóng)業(yè)、畜牧業(yè)、醫(yī)學(xué)、法學(xué)等領(lǐng)域，為人類創(chuàng)造了巨大的財(cái)富。五、基因工程的應(yīng)用：具有生長激素的轉(zhuǎn)基因鼠轉(zhuǎn)基因的方法和技術(shù)：㈠、基因工程工業(yè)：最早應(yīng)用基因工程生產(chǎn)人的蛋白質(zhì)的方法是在細(xì)菌中表達(dá)人的胰島素(1982)。胰島素是一種控制糖代謝的蛋白質(zhì)激素。不能產(chǎn)生胰島素的患者會有糖尿病，患者必須每天注射胰島素?，F(xiàn)已在細(xì)菌中生產(chǎn)10多種醫(yī)藥產(chǎn)品，如表皮生長因子、人生長激素因子、干擾素、乙型肝類工程疫苗等。有些真核細(xì)胞的蛋白質(zhì)需要糖基化等修飾加工以后才具有活性，而細(xì)菌細(xì)胞缺少真核細(xì)胞的這些修飾系統(tǒng)真核生物細(xì)胞更適合于表達(dá)真核生物蛋白質(zhì)基因。目前，酵母菌、植物懸浮細(xì)胞、植株和動物培養(yǎng)細(xì)胞成功地均應(yīng)用于表達(dá)外源蛋白?；蚬こ虘?yīng)用大腸桿菌生產(chǎn)人類生長激素㈡、植物基因工程：植物基因轉(zhuǎn)化是指將外源基因轉(zhuǎn)移到植物細(xì)胞內(nèi)、并整合到植物基因組中穩(wěn)定遺傳和表達(dá)的過程。許多植物基因已經(jīng)被分離、克隆。植物基因轉(zhuǎn)化技術(shù)也得到不斷發(fā)展和完善。應(yīng)用最多的為農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法和基因槍轉(zhuǎn)化法?？瓜x稻對照1.根癌農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化技術(shù)：根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)的植物轉(zhuǎn)化是應(yīng)用得最早而廣泛的植物轉(zhuǎn)化方法（雙子葉植物、單子葉植物）。過程：將目的基因與啟動子（花椰菜病毒35S）及終止子組成嵌合DNA分子插入到Ti衍生質(zhì)粒RB與LB內(nèi)構(gòu)成重組質(zhì)粒

再轉(zhuǎn)化到農(nóng)桿菌細(xì)胞

將重組農(nóng)桿菌去感染植物細(xì)胞

使質(zhì)粒的部分DNA包括目的基因，整合到植物染色體，實(shí)現(xiàn)遺傳轉(zhuǎn)化。利用從抗草甘磷(glyphosate)E.coli中分離克隆的EPSP合成酶基因，已培育出高抗除草劑轉(zhuǎn)基因植物?；驑尳閷?dǎo)的植物轉(zhuǎn)化是通過高壓氣體為動力，高速發(fā)射包裹有重組DNA的金屬顆粒將目的基因直接導(dǎo)入植物細(xì)胞，并整合到染色體上的方法。2.基因槍轉(zhuǎn)化技術(shù)：轉(zhuǎn)化的載體多數(shù)是以pUC系列質(zhì)粒為基礎(chǔ)構(gòu)建的。它們通常具有細(xì)菌復(fù)制原點(diǎn)及抗性選擇標(biāo)記，具有可在植物中表達(dá)的啟動子終止子及調(diào)控序列，以及植物抗性選擇標(biāo)記(如除草劑、潮霉素等抗性)。幾種基因槍類型的共同特點(diǎn)：是用一種動力系統(tǒng)將金屬微粒和包被DNA導(dǎo)入受體細(xì)胞或組織進(jìn)行轉(zhuǎn)化。1.位于高壓氣體桶底部的爆破片；2.載有重組DNA和金屬微粒的大載體；3.阻擋板；

4.包裹有重組DNA的金屬微粒；5.被轟擊樣品。㈢、轉(zhuǎn)基因動物:與轉(zhuǎn)基因植物相比，轉(zhuǎn)基因動物的發(fā)展要慢些。轉(zhuǎn)基因動物：目的基因+載體重組DNA微量注射法將重組DNA導(dǎo)入受體合子細(xì)胞核中遺傳轉(zhuǎn)化。如：利用轉(zhuǎn)基因羊，大量表達(dá)人類的抗胰蛋白酶。

可分泌人類生長因子Ⅸ的轉(zhuǎn)基因羊“Polly”(下圖)。(Wilmut等，Nature385,1997)受精卵細(xì)胞注射法轉(zhuǎn)基因牛：受精卵注射法人類生長激素轉(zhuǎn)基因豬同胞鼠對照轉(zhuǎn)移有人類生長激素轉(zhuǎn)基因鼠㈣、遺傳疾病診斷：利用重組DNA技術(shù)進(jìn)行遺傳疾病診斷，是直接從DNA即基因水平進(jìn)行診斷準(zhǔn)確度高，速度快。進(jìn)行產(chǎn)前診斷，分析胎兒是否有遺傳疾病。如：鐮刀性貧血病的診斷㈤、基因治療：利用基因工程技術(shù)，將特異基因?qū)氩⒄系接羞z傳缺陷患者的基因組中治療遺傳疾病，通常叫做基因治療(genetherapy)。方法：利用減毒的病毒DNA作載體(retrovirusDNA)構(gòu)建重組DNA分子用病毒包裝物包裝后形成的減毒病毒感染患者的細(xì)胞將正?；蛘系饺旧w上。例如，用漠洛尼氏鼠白血病病毒(MLV)改造而成的retrovirus載體，已用于治療嚴(yán)重綜合免疫缺陷(SCID)。SCID是由于腺苷脫氫酶基因(adenosinedeaminase，ADA)突變引起的，患者無任何免疫功能。方法：將ADA基因?qū)氲組LVretrovirus載體中取代該病毒DNA中的三個基因結(jié)構(gòu)(gag、pol、env)將重組后的病毒去感染T細(xì)胞，使ADA基因整合到T細(xì)胞的染色體中實(shí)現(xiàn)基因治療的目的。2000年法國Fischer用該方法治愈患有SCID遺傳病的兩個嬰兒(8個月和11個月)。這一工作被認(rèn)為是20世紀(jì)人類基因治療上的重大突破。㈥、DNA芯片(DNAchips)：核酸分子雜交的原理和方法+半導(dǎo)體技術(shù)結(jié)合發(fā)展形成的一門新技術(shù)。這一技術(shù)可使許多分子雜交反應(yīng)同時進(jìn)行。

DNA芯片技術(shù)：在面積不大(如2cm２)的基片表面分成不同小格有序地點(diǎn)陣排列于一定位置可尋址的核苷酸分子將待分析核苷酸分子標(biāo)記(如用熒光)，變性成單鏈與芯片上序列相同的核苷酸分子雜交與芯片上序列不同的核酸分子被洗掉利用高精度的激光掃描儀記錄分子已雜交的熒光信號計(jì)算機(jī)軟件分析。DNA芯片的基片：玻璃、硅片或尼龍等。應(yīng)用領(lǐng)域：基因多態(tài)性檢測（如單核苷酸多態(tài)性篩選singlenucleotidePolymorphisms，SNPs)；基因表達(dá)分析（不同細(xì)胞和不同組織的RNA群體比較）；

克隆選擇及文庫篩選（如cDNA文庫）；基因突變檢測及遺傳病和腫瘤的診斷等。第二節(jié)基因組學(xué)基因組學(xué)(genomics)：遺傳學(xué)研究進(jìn)入分子水平后發(fā)展起來的一個分支，主要研究生物體內(nèi)基因組的分子特征。研究對象：以整個基因組為研究單位，而不以單個基因?yàn)閱挝蛔鳛檠芯繉ο?。研究目?biāo)：認(rèn)識基因組的結(jié)構(gòu)、功能和進(jìn)化；

闡明整個基因組所包含的遺傳信息和相互關(guān)系；

充分利用有效資源，預(yù)防和治療人類疾病。重要組成部分：基因組計(jì)劃(genomeproject)大體上可分為：⒈構(gòu)建基因組的遺傳圖譜；⒉構(gòu)建基因組的物理圖譜；⒊測定基因組DNA的全部序列；⒋繪制基因組的轉(zhuǎn)錄本圖譜；⒌分析基因組的功能。基因組計(jì)劃研究開始于1990年。美國啟動被譽(yù)為“人體阿波羅計(jì)劃”的“人類基因組計(jì)劃”，投資30億美元，歷時15年測定人類基因組的30億個核苷酸對的排列次序構(gòu)建高分辨率的人類基因組遺傳圖譜和物理圖譜發(fā)展生物信息學(xué)。在美國提出人類基因組計(jì)劃后，日本和中國分別于1991年和1992年啟動了“水稻基因組計(jì)劃”。由于以人類為對象的研究實(shí)際上受到諸多限制，也受倫理學(xué)的約束，所以人類基因組計(jì)劃還將對有關(guān)的模式生物，如酵母、線蟲、果蠅、小鼠、家豬、擬南芥等進(jìn)行相應(yīng)的研究，為研究人類基因組的戰(zhàn)略提供重要的依據(jù)。2002年4月5日《Science》以14頁的篇幅刊登和宣布中國科學(xué)家獨(dú)立繪制完成水稻基因組草圖序列（總數(shù)：4.6億），是繼人類基因組工作草圖（2001年春）之后完成測定的最大基因組。（2001年12月14日美、英等國科學(xué)家宣布繪制出擬南芥基因組的完整圖譜）材料：秈稻。完成單位：華大基因研究中心，中科院遺傳與發(fā)育生物學(xué)研究所等12個單位，2001年7月啟動。水平：水稻基因組中的總基因數(shù)約為46022~55615個（接近人類基因數(shù)的兩倍），工作框架圖序列已覆蓋水稻整個基因組92％以上的基因。方法：“鳥槍射擊法”，利用國產(chǎn)曙光2000、曙光3000超級計(jì)算機(jī)(1000億次/秒)對隨機(jī)DNA碎片進(jìn)行排序和組裝，確定其在基因組的正確位置。計(jì)劃：功能基因分析和蛋白質(zhì)研究。2002年11月21日《Nature》宣布中國科學(xué)家獨(dú)立繪制完成粳稻基因組第四號染色體精確測序圖，使我國對國際水稻基因組測序計(jì)劃貢獻(xiàn)率達(dá)到10%。材料：粳稻“日本晴”。完成單位：中科院國家基因研究中心等4家單位。整個國際水稻基因組計(jì)劃始于1998年，日本、美國、中國、法國等國家和地區(qū)參加。水平：第四號染色體中的總堿基數(shù)目為0.35億堿基對，覆蓋了該染色體全長序列98％的區(qū)域，只剩下7個小空洞，測序堿基序列的精確度達(dá)到99.99%。完整測定的著絲粒序列在高等生物中屬于首次。計(jì)劃：對預(yù)測鑒定的4658個基因作進(jìn)一步分析、著絲粒功能等研究。一、基因組圖譜的構(gòu)建解決方法：大規(guī)模序列測定前，構(gòu)建基因組圖譜可作為序列測定中制定測序方案的依據(jù)，以便錨定測知的核酸序列在染色體上的位置?；蚪M中核苷酸順序的測定方法：小基因組物種常用鳥槍法測序法。大基因組測序存在兩個問題：片段數(shù)(n)龐大，片段間連接和裝配非常復(fù)雜；基因組中相同或相似的重復(fù)序列在連接和裝配時容易出錯。測序方法：克隆連續(xù)序列法(clonecontig)：將基因組DNA切割長度為0.1Mb-1Mb的大片段克隆到Y(jié)AC或BAC載體上分別測定單個克隆的序列再裝配連接成連續(xù)的DNA分子。定向鳥槍射擊法(directedshotgun)：以基因組圖譜中標(biāo)記為依據(jù)測序裝配和構(gòu)建不同DNA片段的序列?；蚪M圖譜根據(jù)構(gòu)建的途徑，可分為兩種：遺傳圖譜：根據(jù)遺傳性狀(如已知基因位點(diǎn)、功能未知的DNA標(biāo)記、可鑒別的表型性狀)的分離比例將其定位在基因組中，構(gòu)建相應(yīng)的連鎖圖譜。物理圖譜：將各種標(biāo)記直接定位在基因庫中的某一點(diǎn)上。

㈠、遺傳圖譜的構(gòu)建：1.圖譜標(biāo)記：可用基因和DNA作為可鑒別的標(biāo)記(mark)。缺點(diǎn)：基因數(shù)目有限、所構(gòu)建的遺傳圖譜不詳細(xì)、標(biāo)記間的遺傳距離較大。⑵.DNA標(biāo)記：每種生物DNA具有穩(wěn)定性，∴DNA本身可作為構(gòu)建遺傳圖譜的標(biāo)記，主要有以下3種類型：①.限制性內(nèi)切酶多型性:②.簡單序列長度多型性③.單核苷酸多型性⑴.基因標(biāo)記：基因控制性狀的表現(xiàn)，所以也就是利用可以鑒別的形態(tài)、生化等表型性狀作標(biāo)記，2、遺傳圖譜的構(gòu)建：⑴.人類基因組遺傳圖譜的構(gòu)建：家系分析法：分析8個家系134個成員(186個減數(shù)分裂)根據(jù)5264個STR(簡單重復(fù)序列)標(biāo)記繪制而成（對于X染色體，另外利用12家系的170個成員分析(105個減數(shù)分裂)）將5264個標(biāo)記定位在2335個位點(diǎn)構(gòu)建的人類基因組遺傳圖譜密度為每個標(biāo)記599Kb。⑵.植物基因組遺傳圖譜的構(gòu)建：①.選擇親本：要求親緣關(guān)系遠(yuǎn)，遺傳差異性大，親本間分子標(biāo)記具有多態(tài)性。

②.產(chǎn)生構(gòu)圖群體：配制雜交組合，建立分離群體：利用回交或三交(復(fù)交)產(chǎn)生的后代群體。單交組合產(chǎn)生的F2；衍生的F3、F4家系；由連續(xù)多代自交或姊妹交產(chǎn)生的重組近交系(recombinantinbredLines，RIL)；.通過單倍體加倍而成的雙倍體(doubledhaploids，DH)；.③.遺傳標(biāo)記的染色體定位：有單體、三體、代換系與附加系分析等方法，依據(jù)染色體劑量的差異將遺傳標(biāo)記定位在特定染色體上。即當(dāng)供體材料總DNA等量時，DNA雜交帶的信號強(qiáng)弱與該標(biāo)記位于的染色體劑量成正比。④.標(biāo)記間的連鎖分析：通過分析分離群體內(nèi)雙親間有多態(tài)性的遺傳標(biāo)記間的連鎖交換情況和趨于協(xié)同分離的程度即可確定標(biāo)記間的連鎖關(guān)系和遺傳距離。(二)、物理圖譜的構(gòu)建：1.構(gòu)建物理圖譜的原因：⑴.遺傳圖譜的分辯率有限：⑵.遺傳圖譜的精確性不高：2.構(gòu)建物理圖譜的三條途徑：⑴.

限制性酶圖譜：利用限制性內(nèi)切酶繪制圖譜，對于DNA分子長度<50Kb的片段，一般沒有什么困難。而對于>50Kb的DNA分子，可選用稀有切點(diǎn)內(nèi)切酶酶切DNA。⑵.熒光原位雜交是另一物理圖譜構(gòu)建方法通過熒光標(biāo)記的探針與DNA分子雜交，使染色體上的雜交信號（位置就是探針DNA在染色體上的圖譜位點(diǎn)）在顯微鏡下可直接觀察。⑶.序列標(biāo)簽位點(diǎn)：利用某一已知序列為標(biāo)簽的位點(diǎn)(sequencetaggedsites，STS)作探針，與基因組DNA雜交，繪制物理圖譜。3.人類基因組物理圖譜:人類基因組序列開始測定時，已有45萬個EST，其中有一些重復(fù)序列，經(jīng)計(jì)算機(jī)分析篩選后得到49625個，各代表一個基因。再從中篩選出3萬個EST、二個輻射雜交系庫（分別有83和93個細(xì)胞株）、一個有32000個克隆的YAC文庫用于構(gòu)建圖譜。結(jié)果構(gòu)建的物理圖譜的密度為每個標(biāo)記183kb，EST分布結(jié)果表明基因在染色體上的排列是不均勻的。將上述遺傳圖譜及其它物理圖譜整合構(gòu)成更加完整的人類其因組圖譜，作為基因組序列測定的框架和分析的依據(jù)。二、基因組圖譜的應(yīng)用：基因組圖譜中除了構(gòu)建遺傳圖譜和物理圖譜外，還可進(jìn)一步根據(jù)標(biāo)記類型細(xì)分為不同的稱謂。如RFLP圖譜、RAPD圖譜、AFLP圖譜等，目前已在擬南芥、番茄、水稻等30多種植物中構(gòu)建了基因圖譜。基因圖譜的構(gòu)建除了進(jìn)行測序之外，還有許多的用途。1.基因定位：借助基因組圖譜，可使基因定位在精度、深度、廣度等方面有極大的提高。已陸續(xù)在各種農(nóng)作物上定位了許多重要農(nóng)藝性狀和經(jīng)濟(jì)性狀的基因，在復(fù)雜數(shù)量性狀位點(diǎn)(quantitativetraitloci，QTL)定位分析方面，也取得了很大進(jìn)展。2.基因組比較分析：已經(jīng)在禾本科玉米、水稻、高梁、大麥、小麥和黑麥，茄科的蕃茄、胡椒、馬鈴薯，十字花科擬南芥、甘藍(lán)、花椰菜、油菜等做了遺傳圖譜比較分析，從分子水平了解物種間同源性，研究基因組的進(jìn)化和染色體的演變。3.標(biāo)記輔助選擇(marker-assistedselectionMAS)：飽和基因組圖譜可用來確定與任何一個目的基因緊密連鎖的分子標(biāo)記根據(jù)圖譜間接選擇目的基因，可降低連鎖累贅，加速目的基因的轉(zhuǎn)移與利用，提高回交育種的效率。4.基因的克隆與分離：