DB37T 3320-2018水貂、狐和貉常見細菌實時熒光PCR檢測方法

ICS65.020.30B41山DB37Real-timefluorescentPCRfordetectingofcommonbacterialpath山東省質(zhì)量技術(shù)監(jiān)督局發(fā)布本標準按照GB/T1．12009給出的規(guī)則起草。本標準的附錄為資料性附錄。本標準由山東省畜牧獸醫(yī)局提出。本標準由山東省畜牧業(yè)標準化技術(shù)委員會歸口。本標準主要起草單位：山東省動物疫病預防與控制中心、山東大學生命科學學院。本標準規(guī)定了水貂、狐和貉常見細菌（大腸桿菌、綠膿桿菌、克雷伯氏菌、嗜水氣單胞菌、沙門氏菌、檸檬酸桿菌、不動桿菌）實時熒光PCR檢測方法。本標準所適用于水貂、狐和貉的常見細菌的快速篩查和檢測，其他動物細菌可參考本標準。2規(guī)范性引用文件下列文件對于本文件的應(yīng)用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，僅所注日期的版本適用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改單）適用于本文件。GB19489實驗室生物安全通用要求GB/T27401實驗室質(zhì)量控制規(guī)范動物檢疫GB/T6682分析實驗室用水規(guī)格和實驗方法3縮略語熒光定量PCR熒光定量聚合酶鏈式反應(yīng)。Ct值每個反應(yīng)管內(nèi)的熒光信號量達到設(shè)定的閾值時所經(jīng)歷的循環(huán)圈數(shù)。DNA脫氧核糖核酸。Taq酶TaqDNA聚合酶PBS磷酸鹽緩沖生理鹽水4試劑和材料4.1熒光定量PCR檢測儀及配套反應(yīng)管（板）。4.2高速臺式冷凍離心機（離心速度12000r/min以上）。4.3混勻器。4.4恒溫水浴鍋。4.5冰箱（2℃~8℃和-20℃兩種）。4.6微量移液器（0.5L～10L，5L～20L，20L～200L，200L～1000L及配套吸頭。4.71.5mL離心管（無核酸酶）。4.8可以選用經(jīng)驗證效果好的細菌DNA柱式提取試劑盒，或按照附錄A配制試劑。5樣品的采集與前處理采樣過程中樣本不得交叉污染，采樣及樣品前處理過程中須戴一次性手套。5.1取樣工具5.1.1棉拭子、剪刀、鑷子、研缽、Eppendorf管。5.1.2所有上述取樣工具必須經(jīng)（121±2）℃,15min高壓滅菌并烘干或經(jīng)160℃干烤2h。5.2采樣方法5.2.1拭子樣品咽喉拭子采樣，采樣時要將拭子深入喉頭及上腭來回刮3次～5次，取咽喉分泌液。肛拭子采樣，采樣時要將拭子深入肛門回刮3次～5次，取排泄物。5.2.2內(nèi)臟或肌肉樣品用無菌的剪刀和鑷子剪取待檢樣品1.0g于研缽中充分研磨，再加5.0mLPBS混勻，然后將組織懸液轉(zhuǎn)入無菌Eppendorf管中，編號備用。5.2.3血清或血漿用無菌注射器直接吸取至無菌Eppendorf管中，編號備用。5.3運送與存放采集的樣品密封后，采用保溫壺或保溫桶加冰密封，盡快運送到實驗室。采集或處理的樣本在2℃~8℃條件下保存應(yīng)不超過24h；若需長期保存，須放置-70℃冰箱，但應(yīng)避免反復凍融（最多凍融3次）。6引物及探針見表1“熒光PCR方法的引物及探針”。表1熒光PCR方法的引物及探針大腸桿菌FGTGTGATATCTACCCGCTTCRAGAACGGTTTGTGGTTAATCAGGAFAM-TCGGCATCCGGTCAGTGGCAGT-MGB克雷伯氏菌FTGAAACGACCTGATTGCATTCGATRAGGCTGTCGGGATAAGCCAHEX-CGCGCCACYGGAAGGGYATG-TAMRA綠膿桿菌FACCCGARACGYAGGCTATGRCAGGTCGGAGCTGTMCTACTCFAM-AGGTGGTGATCGCACGCAG-BHQ沙門氏菌FGCCATGCTGTTCGATGATRFAM-TTTTGCACCACMGCCAGCCC-TAMRAFRPFAM-CAGCAGAAACTTGCCACTCGGTCTTG-BHQ1不動桿菌FGTTGTGGCTTTAGGTTTATTARAAGTTACTCGACGCAATTCG表1熒光PCR方法的引物及探針（續(xù)）不動桿菌CY5-ACCCATCAAGGTAAAGGCTTCGTTCG-BHQ1檸檬酸桿菌FTTGGCGTCCAGCGCATTCARAATTCCAGCCTTCGGCAAACGCY5-TCCAGATCGGAAAGGGTTGCGGTGAC-TAMRA7操作方法7.1樣本核酸的提取7.1.1細菌培養(yǎng)：取單克隆菌落接種于5ml液體培養(yǎng)基中，37℃搖床（300rpm）培養(yǎng)過液。7.1.2待檢樣品、陽性對照和陰性對照的份數(shù)總和用n表示，取n個滅菌的1.5mL離心管，逐管編號。7.1.3細菌收集：取1ml培養(yǎng)物于1.5mlEP管中,室溫8000rpm離心5min,棄上清，沉淀重新懸浮于ddH2O中，棄上清。110μl，20mg/ml的蛋白酶K3μl，50℃作用3h或37℃過夜（此時菌液應(yīng)為透明粘稠液體）。7.1.5抽提：菌液均分到兩個1.5mlEP管，加等體積的酚∶氯仿∶異戊醇(25∶24∶1)，混勻，室溫放置（5-10）min.12000rpm離心10min，抽提兩次。（上清很粘稠,吸取時應(yīng)小心）。7.1.6沉淀：加0.6倍體積的異丙醇，混勻，室溫放置10min。12000rpm離心10min。7.1.7洗滌：沉淀用75%的乙醇洗滌。7.1.8抽（晾）干后,溶于40μl～60μlddH2O中,取2μl～5μl電泳.作PCR模板用.獲得的DNA溶液，冰上保存?zhèn)溆茫ㄗ⒁馓崛〉腄NA須在2h內(nèi)進行PCR擴增，若需長期保存須放置-70℃以下冰箱，7.2擴增試劑準備---在反應(yīng)混合物配制區(qū)進行可以用各細菌的檢測試劑盒，也可合成引物探針后配制反應(yīng)液。7.2.1室溫溫浴PCR反應(yīng)液，2000r/min離心5sec；7.2.2準備n個潔凈經(jīng)無核酸酶的PCR反應(yīng)管，設(shè)所需PCR管數(shù)為n（n=樣本數(shù)+1管陰性對照+1管陽性對照7.2.3每個測試反應(yīng)體系需要15μLPCR反應(yīng)液和0.3μLTaq酶。計算好各試劑的使用量，加入一適當體積離心管中，充分混合均勻，向每個PCR管中各分裝15μL，轉(zhuǎn)移至樣本處理區(qū)。7.3加樣---在樣品處理區(qū)進行分別向上述PCR管中加入樣本核酸提取步驟7.1.8中制備的DNA溶液各10μL，使總體積達25μL。記錄反應(yīng)管對應(yīng)的樣品編號。蓋緊管蓋后，瞬時離心。7.4熒光PCR反應(yīng)---在檢測區(qū)進行將加樣后的PCR管放入熒光PCR檢測儀內(nèi)，記錄PCR管擺放順序。反應(yīng)參數(shù)設(shè)置：a)第一階段，預變性92℃/3min；b)第二階段，92℃15sec，60℃60sec，共40個循環(huán)，最后40℃2min。熒光收集在第二階段每次循環(huán)的退火延伸時進行。8結(jié)果判定8.1結(jié)果分析條件的設(shè)定8.1.1閾值設(shè)定原則：根據(jù)儀器噪聲情況進行調(diào)整，以閾值線剛好超過陰性對照品擴增曲線的最高點8.1.2對于多通道熒光PCR儀，大腸桿菌、綠膿桿菌、沙門氏菌選定FAM(465-510)檢測通道讀取檢測結(jié)果，ABI儀器選擇FAM無熒光淬滅基團；克雷伯氏菌選定HEX或VIC檢測通道讀取檢測結(jié)果，ABI儀器選擇VIC無熒光淬滅基團；不動桿菌和檸檬酸菌選定CY5檢測通道讀取檢測結(jié)果。8.2質(zhì)控標準8.2.1陰性對照選用TE溶液做模板。陰性對照無Ct/Cp值并且無擴增曲線。8.2.2陽性對照選用標準菌株提取核酸做模板。陽性對照的Ct/Cp值應(yīng)小于等于28，并出現(xiàn)典型的擴8.2.3如陰性和陽性對照不滿足以上條件，此次實驗視為無效。8.3結(jié)果判定8.3.1陰性：無Ct/Cp值，且無特征性擴增曲線，表明樣品為陰性。8.3.2陽性：Ct/Cp值≤30.0，且出現(xiàn)典型的擴增曲線，表示樣品為陽性。8.3.3Ct/Cp值大于30.0，且出現(xiàn)典型的擴增曲線的樣品建議復驗。復驗仍出現(xiàn)上述結(jié)果的，判為陽性，否則判為陰性。9廢棄物處理實驗檢測過程中產(chǎn)生的廢棄物嚴格按照實驗室生物安全管理的要求進行處理并做好記錄。（規(guī)范性附錄）磷酸鹽緩沖生理鹽水配方所用試劑均為分析純以上。濃HCl調(diào)節(jié)pH值至8.0，定容至100mL，高壓滅菌后室溫保存待用。A.20.5mol/LEDTA（pH8.0）溶液：稱取18.61gNa2EDTA?2H2O置于100mL燒杯中，加入80mL水，用10%的NaOH溶液，調(diào)節(jié)pH值至8.0，定容至100mL，高壓滅菌后室溫保存待用。A.310%SDS：稱取10gSDS溶解于80mL滅菌水中，定容至100mL。儲存于滅菌過的容器中待用。A.45mol/LNaCl溶液：稱取29.25gNaCl溶解于80mL水中，定容至100mL，高壓滅菌后室溫保存A.5TE緩沖液：將0.5mL的10mmolTris-HCl(pH8.0)、0.1