臨床基因擴增(PCR)診斷實驗室工作規(guī)范(試行)

附件2臨床基因擴增（PCR）診斷實驗室工作規(guī)范（試行）為使基因擴增診斷技術(shù)規(guī)范有效的用于臨床，保證檢測質(zhì)量，更好地為臨床疾病的診療服務(wù)，特制定本規(guī)范。1．臨床基因擴增實驗室的設(shè)置：和儀器設(shè)備臨床PCR實驗室應(yīng)分為四個隔開的工作區(qū)域，每一區(qū)域都應(yīng)有專用的儀器設(shè)備。即1）試劑貯存和準(zhǔn)備區(qū)；2）標(biāo)本制備區(qū)；3）擴增反應(yīng)混合物配制和擴增區(qū)和的擴增產(chǎn)物分析區(qū)。如使用擴增和產(chǎn)物檢測同時完成的熒光定量PCR方法或全自動分析儀如Cobas－T（Anplicor）等，則3）和4）兩個區(qū)可合并。與上述特定實驗區(qū)有關(guān)的各個房間必須有明確的標(biāo)記，以避免不同工作區(qū)內(nèi)的設(shè)備物品如加樣器、試劑等的移出或不同的工作區(qū)間發(fā)生混淆。進入各個工作區(qū)必須遵循一嚴(yán)格的）順序，只能按單一方向進行，即從試劑貯存和準(zhǔn)備區(qū)～標(biāo)本制備區(qū)～擴增反應(yīng)混合物配制和擴增區(qū)～擴增產(chǎn)物分析區(qū)。不同的工作區(qū)必須使用不同的工作服，可以不同的顏色來區(qū)別。此外，當(dāng)工作人員離開各工作區(qū)時，不得將各區(qū)特定的工作服帶出。1．l．試劑貯存和準(zhǔn)備區(qū)本區(qū)用于貯存溶液的制條、溶液的分裝和主反應(yīng)混合液的制各。本區(qū)儀器設(shè)備配置：（l）4冰箱和一20冰柜；（2）混勻器；（3）微量加樣器若干支（覆蓋1～1000pl）；（5）專用工作服和工作鞋；（6）專用辦公用品；（7）消耗品：一次性手套、一次性吸水紙、耐高壓處理的離。心管和加樣器吸頭（帶濾心）；（8）可移動紫外燈（近工作臺面）。1．2．標(biāo)本制備區(qū)標(biāo)本貯存、核酸提取及貯存均在本區(qū)內(nèi)進行。RNA測定時的單鍵。cDNA合成也在本區(qū)進行。本區(qū)儀器設(shè)備自己置：（l）4冰箱、－20或-70冰柜三（2）高達臺式冷凍離心機；（3）混勻器；（4）水浴箱或加熱模塊；（5）微量如排器若干支（覆蓋l～1000μl）；（6）專用工作服和工作鞋；（7）專用辦公用品；（8）消耗品：一次性手套、一次性吸水紙、耐高壓處理的部心管和加樣器吸頭（帶濾心）；（9）可移動紫外燈（近工作臺面）；（10）超凈工作臺；（11）超聲波水?。ㄌ幚泶蠓肿覦NA適用）。1．3．?dāng)U增反應(yīng)混合物配制和擴增區(qū)模板材料（來自標(biāo)本制備區(qū)）和主反應(yīng)混合液（來自試劑貯存和準(zhǔn)備區(qū)）的加入以及擴增反應(yīng)等專門在本二．作區(qū)內(nèi)近行。本區(qū)儀器設(shè)備自己置：（l）核酸擴增僅三（2）微量加樣器（覆蓋1～1000μl）；（3）專用工作服和工作鞋；（4）專用辦公用品；（5）消耗品：一次性手套、一次性吸水紙、高壓處理的部心管和加樣器吸頭（帶濾心）；（6）可移動紫外燈（近工作臺面）。1．4.擴增產(chǎn)物分析區(qū)本區(qū)面積應(yīng)為6～8m。擴增嚴(yán)物的分析在本區(qū)進行。本區(qū)儀器設(shè)備配置：視檢測方法不同而定，如為PCR�ELISA，則需（l）微量加樣器若干支（覆蓋l～2s（2）酶標(biāo)權(quán)、洗報機和恒溫箱;（3）專用工作服和工作鞋；（4）專用辦么，用品；（5）消耗品：～次性手套、一次性吸水紙、加樣器吸頭（帶濾心）；（6）可移動紫外燈（近工作臺面）。2．臨床基因擴增診斷實驗室質(zhì)量保證臨床基因擴增診斷實驗室質(zhì)量保證涉及到整個基因擴增檢測的所有階段，即測定分析前的標(biāo)本來集處理、測定中的核酸提取、擴增和產(chǎn)物分析以及測定后的結(jié)果報告等。2．1．標(biāo)本的采集常用于基因擴增檢測的臨床標(biāo)本包括EDTA或拘檬酸鈉抗凝全血或骨髓、血清或血漿．痰、腦普液、尿及分泌物等。采樣容器最好是密閉的一次性的，如真空系血管。一次性塑料容器使用時無需進一步預(yù)處理。當(dāng)使用非密鬧采樣系統(tǒng)時，如尿、分泌物和骨髓的采禪，必須注意防止來自來樣者的皮屑或分泌物的污染。采樣者采樣時起碼要談．一次性手套。可重復(fù)使用的玻璃器〔應(yīng)高壓處理，因為玻璃器（常含有不易失活的ANA酶。RNA酶的主要來源是實驗人員的手。最好是熱滅菌，250烘烤4小時以上可使RNA酶永久性失活。全血和骨髓標(biāo)本必須進行抗凝處理。通常EDTA和拘檬酸鹽是首選的抗凝劑。不能使用肝素抗凝，因為肝素是Taq酶的強抑制劑，而且在其后的核酸提取步驟中很難去除肝素。臨床用于RNA（如HCVRNA）測定的血標(biāo)本最好進行抗凝處理，并盡快（3小時以內(nèi)）分離血漿，以避免RNA的降解。如未作抗凝處理，則物血后，必須在1小時內(nèi)分離血清。2．2．標(biāo)本的穩(wěn)定化處DNA分析，標(biāo)本采集后一般不需要特殊的穩(wěn)定化處理，但標(biāo)本應(yīng)及時送到實驗室。由于RNA易于降解，因此用于RNA測定的標(biāo)本的穩(wěn)定化處理有時是必不可少的，Chaotropic物質(zhì)[特別是異硫氨酸抓鹽（Guanidinethiocyanate，GITC）]可使DNAse和RNAse立即失活。在采集標(biāo)本時，可將標(biāo)本材料如血清或血漿加入含有GITC的試劑管中進行穩(wěn)定化處理。GITC可使RNAse不可逆失活的適合濃度為5mol/L。如果GITC濃度小于4mol／L；RNA會很快降解。在適當(dāng)?shù)姆€(wěn)定化處理后，標(biāo)本一般不需要冷藏即可郵寄。如果溫度低于室溫，GITC即會結(jié)晶，所以在加入標(biāo)本前應(yīng)使之完全溶解。如標(biāo)本不能及時送到實驗室，最好選用GITC處理方法以穩(wěn)定標(biāo)本。2．3標(biāo)本的運送標(biāo)本來集后應(yīng)盡快送至實驗室，經(jīng)過適當(dāng)穩(wěn)定化處理的標(biāo)本可在常溫下通過郵寄運送。如用于DNA提取的含EDTA的全血標(biāo)本及用于RNA提取的經(jīng)GITC穩(wěn)定化處理的標(biāo)本。是否冷藏取決于標(biāo)本的用途，較長時間在室溫貯存會導(dǎo)致靈敏度大大降低。通常應(yīng)采用不易破碎的容器裝載標(biāo)本。用于RNA檢測的標(biāo)本，如果在未經(jīng)穩(wěn)定化處理，則必須速凍后，放在干冰中運送。2．4．標(biāo)本的貯存臨床體液標(biāo)本如血清／血漿等可于-70下長時間貯存。用于DNA測定的核酸樣本應(yīng)在10mmol／LTris，lmmol／LEDTA緩沖液（pH7．5－8．0）中4保存。用于RNA測定的核酸樣本應(yīng)在緩沖液中一80C或液氮中貯存。用乙醇沉淀的核酸樣本貯存在一20OC即可。用GIT（：穩(wěn)定化處理的RNA標(biāo)本在室溫可保存7天，如貯存時間較長，則RNA測定敏感性略有下降。2．5．標(biāo)本的處理（核酸提?。┖怂崽崛∈菦Q定擴增檢測成敗的關(guān)鍵性步驟。通常，核酸制備質(zhì)量不高是由于抑制物去除不完全所致。抑制物可能來源于標(biāo)本本身（如血紅素及其前體或降解產(chǎn)物）或核酸提取過程中確．留的有機溶劑（如酚、氯份等），這些物質(zhì)對其后的酶反應(yīng)步驟具有強烈的抑制作用，提取試劑盒制備的DNA的長度平均范圍為30�40kb。然而；明顯出現(xiàn)降解的DNA（在1和10kb的低分子量范圍內(nèi)）在經(jīng)瓊脂糖凝膠電冰分離和用溴化乙錠染色后也可見有強的熒光信號。用對甲基化不敏感的限制性內(nèi)切酶（如EcoRI）消化DNA，然后電泳分離，能夠?qū)γ富钚缘囊种苿┻M行質(zhì)控（在抑制劑存在的情況下，高分子量的片段不被酶切）。潛在的抑制劑的存在通常用260nm和280nm的分光光度測定來估計，好的DNA提取物，A260/A280比值應(yīng)該在1．75--2．0之間；否則，污染（殘留的蛋白或酚）可能會很高。僅用光度計比色方法不能對DNA的完整性下結(jié)論。最快的對總RNA提取質(zhì)量控制的方法是在非變性條件下作瓊脂糖凝膠電冰，這一點跟DNA分離相同，然而，如果對結(jié)果產(chǎn)生懷疑，就應(yīng)該在變性的條件下作瓊脂糖凝膠電泳以檢測RNA的完整性。在理想情況下，三種主要的核糖體RNA(28S、18s和5S）在凝膠上出現(xiàn)的帶相對較窄。如發(fā)生RNA的降解。則帶被拖向低分子量或出現(xiàn)帶的缺失。測定核糖體RNA帶的密度指數(shù)可作為對RNA制備的質(zhì)量評價的實驗室內(nèi)的標(biāo)準(zhǔn)；對向低分子量拖尾的、不對稱性的峰的評估也是RNA完整性的合適的指標(biāo)。另外，瓊脂糖凝膠電泳能顯示出在RNA的制備中被DNA污染的程度。由于這些原因，單獨的光電比色不能對RNA的完整性下結(jié)論。2．9．1．2．對cDNA合成和擴增的質(zhì)控。本部分包括陽性質(zhì)控和陰性質(zhì)控。2．．9．l．2．l．cDNA的合成。對CDNA合成的效率進行監(jiān)控的關(guān)鍵性的質(zhì)控是使用一個內(nèi)反應(yīng)質(zhì)控。cDNA的合成可以從存在子每一個RNA提取物中的cRNA轉(zhuǎn)錄本開始(即普遍表達的mRNA，如核糖體蛋白轉(zhuǎn)錄本這一類的所謂的管家基因），也可從在制備時加入樣本中的作為內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)的RNA開始。cDNA合成的內(nèi)質(zhì)控是能夠產(chǎn)生確定產(chǎn)物的陽性質(zhì)控；如果擴增不成功，質(zhì)控就顯示出有RNA的降解、cDNA合成的過程中錯誤啟動或酶活性喪失。加入確定量的擴增質(zhì)控物可以檢測RT�PCR的靈敏度。對于RT－PCR方法所必須的污染質(zhì)控為無逆轉(zhuǎn)錄靶RNA的陰性質(zhì)控。2．9．1．2．2．PCR反應(yīng)。內(nèi)反應(yīng)質(zhì)控是陽性質(zhì)控?？墒褂脤τ袡C體存活所必須的靶基因作質(zhì)按，這些基因至少以豐臺子狀態(tài)存在，因為如果基因組缺失這些基因，將使有機體致死（所謂的致死因子），一個比較好的例子就是維生素D血漿結(jié)合蛋白的基因；在世界范圍內(nèi)的許多種族已發(fā)現(xiàn)其廣泛的多態(tài)性，并且還沒有發(fā)現(xiàn)基因活性的同源性丟失，因此，通過PCR共同擴增這種基因的一個片段，在所有患者中均可獲得成功，并且也會證明擴增反應(yīng)是成功的。在測定血清／血漿病原體核酸如HBVDNA、HCVRNA等時，應(yīng)使用已知的弱陽性血清／血漿作為質(zhì)控樣本，與持測臨床標(biāo)本等同處理提取核酸及擴增，以判斷擴增檢測的有效性。使用這些外加弱陽性質(zhì)控不但可檢測擴增反應(yīng)液的質(zhì)量，還可獲得有關(guān)PCR檢測下限和特異性的信息。這些質(zhì)控必須使用與診斷實驗（即患者的標(biāo)本）所使用的相同的主反應(yīng)混合液。如果懷疑方法的檢測下限不足以檢測出產(chǎn)物時，則每一個反應(yīng)管都必須加擴增質(zhì)控。外加陰性質(zhì)控（污染質(zhì)控）在每一個PCR實驗中都必須設(shè)有，應(yīng)該包括幾種陰性質(zhì)控。通常，這些質(zhì)控是民來指明PCR過程中污染出現(xiàn)的階段。包括在樣品制備的整個過程中所帶的空白反應(yīng)管、含有樣品制備時所用的所有反應(yīng)液但不含可擴增的模板（所謂的模擬制備）的反應(yīng)管等。模擬質(zhì)援可以評估PCR實驗的綜合質(zhì)量。此外，為對吸樣過程進行質(zhì)控，可以水質(zhì)控樣本來代替核酸樣本加入至反應(yīng)管，反應(yīng)管中含所有的反應(yīng)成分。實際工作中僅通過水樣本來檢測污染是否存在的方法是不可取的，因為它不能發(fā)現(xiàn)樣本處理過程中的污染源，水僅可作為擴增試劑的質(zhì)控。在擴增靶RNA的PCR實驗中，應(yīng)做省略逆轉(zhuǎn)錄的污染質(zhì)控，通過這種方法，可發(fā)現(xiàn)以前擴增的DNA片段所引起的污染。2．9．l．3．對測定結(jié)果評價的質(zhì)控．2．9．1