目的基因的連接與轉(zhuǎn)化

目的基因的連接與轉(zhuǎn)化第1頁(yè)/共15頁(yè)目的基因的連接、轉(zhuǎn)化第2頁(yè)/共15頁(yè)分類及原理分類：

根據(jù)限制性內(nèi)切酶酶切后產(chǎn)生的末端的類型，分為非互補(bǔ)突出末端的連接、相同粘性末端的連接、平末端連接第3頁(yè)/共15頁(yè)DNA連接示意圖第4頁(yè)/共15頁(yè)載體自連及去磷酸化第5頁(yè)/共15頁(yè)常用堿性磷酸酶BAP（大腸桿菌）CIAP(小牛腸)分子量80,000溫度60℃—65℃最適PH8.0熱穩(wěn)定性好，100℃暫時(shí)性失活，室溫放置可恢復(fù)活性，苯酚完全失活分子量100,000溫度37℃最適PH10.0附近（高底物濃度）PH8.0附近（低底物濃度）65℃30分鐘處理99％的活性不可逆失活，隨具體條件改變有變動(dòng)，完全失活苯酚處理第6頁(yè)/共15頁(yè)本實(shí)驗(yàn)連接材料及連接體系第7頁(yè)/共15頁(yè)連接示意圖第8頁(yè)/共15頁(yè)連接體系載體DNA17ng目的DNA50ng連接緩沖液（5×）1.2ul用蒸餾水稀釋至6ul附注：目的DNA的總體積是3ul，如果不夠總質(zhì)量以總體積為準(zhǔn)第9頁(yè)/共15頁(yè)1.載體和插入片段的摩爾濃度比載體：插入片段的摩爾數(shù)的變化范圍可為8：1到1：16，但通常的變化范圍是3：1到1：3。插入片段的長(zhǎng)度和序列的變化會(huì)影響和同一載體的連接效果。每一個(gè)連接反應(yīng)都需要作實(shí)驗(yàn)，來(lái)選擇最佳的載體和插入片段的摩爾數(shù)比。在最小的反應(yīng)體積中，通常一個(gè)連接反應(yīng)用10-50ng的載體DNA。2.進(jìn)行連接反應(yīng)時(shí)的保溫的時(shí)間和溫度也需優(yōu)化。一般而言，平末端連接在22℃保溫4-16小時(shí)，粘性末端在22℃保溫3小時(shí)，或16℃保溫16小時(shí)。大多數(shù)連接反應(yīng)用T4DNA連接酶，但大腸桿菌的DNA連接酶可用于粘性末端的連接，平末端連接時(shí)用此酶，活力較低。3.載體和插入片段的純度應(yīng)較高，融解的溶劑最好使用滅菌的雙蒸水而不是TE，畢竟TE中含有離子，可能影響連接反應(yīng)。第10頁(yè)/共15頁(yè)感受態(tài)細(xì)胞的制備Hanahan法是制備高效感受態(tài)細(xì)菌的標(biāo)準(zhǔn)方法。這種化學(xué)方法制備的感受態(tài)細(xì)菌的轉(zhuǎn)化效率可達(dá)到109cfu/μgDNA。注：1.低溫培養(yǎng)，18℃培養(yǎng)至OD600約為0.5；

2.超凈臺(tái)無(wú)菌操作，低溫操作；

3.標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒的種類不同同種感受態(tài)的轉(zhuǎn)化率不同，不同質(zhì)粒形態(tài)轉(zhuǎn)化率也不相同。第11頁(yè)/共15頁(yè)轉(zhuǎn)化原理1.0℃的CaCl2低滲溶液中，使細(xì)胞膨脹，同時(shí)Ca2+使細(xì)胞膜磷脂層形成液晶結(jié)構(gòu)，使得位于外膜與內(nèi)膜間隙中的部分核酸酶離開所在區(qū)域，這就構(gòu)成了大腸桿菌人工誘導(dǎo)的感受態(tài)；2.加入DNA，Ca2+又與DNA結(jié)合形成抗脫氧核糖核酸酶（DNase）的羥基-磷酸鈣復(fù)合物，并粘附在細(xì)菌細(xì)胞膜的外表面上；3.經(jīng)短暫的42℃熱脈沖處理后，細(xì)菌細(xì)胞膜的液晶結(jié)構(gòu)發(fā)生劇烈擾動(dòng)，隨之出現(xiàn)許多間隙，致使通透性增加，DNA分子便趁機(jī)進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)。Mg2+的存在對(duì)DNA的穩(wěn)定性起很大的作用，MgCl2與CaCl2又對(duì)大腸桿菌某些菌株感受態(tài)細(xì)胞的建立具有獨(dú)特的協(xié)同效應(yīng)。二甲基亞砜（DMSO）和二巰基蘇糖醇（DTT）進(jìn)一步誘導(dǎo)細(xì)胞產(chǎn)生高頻感受態(tài)的程序，大大提高了大腸桿菌的轉(zhuǎn)化效率。第12頁(yè)/共15頁(yè)轉(zhuǎn)化示意圖第13頁(yè)/共15頁(yè)連接效率的計(jì)算連接