實(shí)驗(yàn)五血清蛋白醋酸纖維素薄膜電泳分離

實(shí)驗(yàn)五血清蛋白醋酸纖維素薄膜電泳分離1第1頁(yè)，共19頁(yè)，2023年，2月20日，星期六

電泳技術(shù)--電泳的基本概念和原理一、概念：電泳是指帶電質(zhì)點(diǎn)在電場(chǎng)中向本身所帶電荷相反的電極移動(dòng)的現(xiàn)象。二、原理：在一定PH條件下，不同的物質(zhì)具有不同的等電點(diǎn)就帶不同性質(zhì)的電荷，因而在一定的電場(chǎng)中它們的移動(dòng)方向和移動(dòng)速度也不同，因此，可使它們分離。質(zhì)點(diǎn)在電場(chǎng)中的移動(dòng)方向決定于顆粒所帶電荷的種類：帶正電荷的顆粒向電場(chǎng)的負(fù)極移動(dòng)；帶負(fù)電荷的顆粒向正極移動(dòng)；凈電荷為零的顆粒在電場(chǎng)中不移動(dòng)。顆粒在電場(chǎng)中移動(dòng)的速度主要決定于顆粒帶電荷的量，同時(shí)受顆粒形狀和顆粒相對(duì)分子質(zhì)量的大小的影響。2第2頁(yè)，共19頁(yè)，2023年，2月20日，星期六在電場(chǎng)中，顆粒的移動(dòng)速度，通常用泳動(dòng)度（或遷移率）來(lái)表示。泳動(dòng)度是帶電顆粒在單位電場(chǎng)強(qiáng)度下的泳動(dòng)速度即：

vd/tdLμ＝---=-------=----·----EV/LVt

式中：μ－泳動(dòng)度（即遷移率），cm2/（V·s）；v－泳動(dòng)速度，cm/s；E－電場(chǎng)強(qiáng)度，V/cm；d－顆粒泳動(dòng)距離，cm；V－實(shí)際電壓，V（伏特）；

t－通電時(shí)間，s（秒）；

L－介質(zhì)的有效長(zhǎng)度（cm）。通過(guò)測(cè)量d、L、V、t即可計(jì)算出顆粒的泳動(dòng)度。

在一定條件下，任何帶電顆粒都具有自己特定的泳動(dòng)度，它是膠體顆粒的一個(gè)物質(zhì)常數(shù)，可用其鑒定蛋白質(zhì)等物質(zhì)。3第3頁(yè)，共19頁(yè)，2023年，2月20日，星期六三、影響電泳泳動(dòng)度的因素：1、顆粒性質(zhì)：顆粒的直徑、形狀及所帶靜電荷量對(duì)泳動(dòng)速度有較大影響。一般來(lái)說(shuō)顆粒帶凈電荷量越多，或其形狀越接近球形，在電場(chǎng)中的泳動(dòng)速度就越快。反之則越慢。2、電場(chǎng)強(qiáng)度：電場(chǎng)強(qiáng)度是指每一厘米的電位降。又稱為電位梯度或電勢(shì)梯度。它對(duì)泳動(dòng)速度起著十分重要的作用。電場(chǎng)強(qiáng)度越高，帶電顆粒的泳動(dòng)速度越快。反之，則越慢。根據(jù)電場(chǎng)強(qiáng)度（電壓的高低）大小，又可將電泳分為常壓電泳（100－500V）和高壓電泳（500－10000V）。前者電場(chǎng)強(qiáng)度為2－10伏特/厘米，后者為70－200伏特/厘米。常壓電泳多用于分離大分子物質(zhì)。高壓電泳常需要冷卻裝置。高壓電泳時(shí)間短，有時(shí)僅需數(shù)分鐘，多用于分離小分子物質(zhì)。4第4頁(yè)，共19頁(yè)，2023年，2月20日，星期六3、溶液的性質(zhì)：主要是指電極溶液（緩沖溶液）和蛋白質(zhì)樣品溶液的pH值、離子強(qiáng)度和粘度等。（1）pH值：溶液pH值決定帶電顆粒的解離程度，也即決定其帶凈電荷的量。對(duì)蛋白質(zhì)而言，溶液的pH值離其等電點(diǎn)越遠(yuǎn)，則其帶凈電荷量就越多，從而泳動(dòng)速度就越快。反之，則越慢。當(dāng)pH值等于其PI時(shí)，凈電荷為0，μ也為0。因此電泳時(shí)應(yīng)選擇適宜的PH值，并需采用緩沖溶液，使溶液的pH值恒定。（2）離子強(qiáng)度：溶液的離子強(qiáng)度一般在0.02－0.2之間時(shí)，電泳較合適。若離子強(qiáng)度過(guò)高，則會(huì)降低顆粒的泳動(dòng)速度。其原因是，帶電顆粒能把溶液中與其電荷相反的離子吸引在自己周圍形成離子擴(kuò)散層。若離子強(qiáng)度過(guò)低，則緩沖能力差，往往會(huì)因溶液PH值變化而影響泳動(dòng)的速率。5第5頁(yè)，共19頁(yè)，2023年，2月20日，星期六離子強(qiáng)度的計(jì)算公式為：

I＝1/2Σmizi2=1/2(m1z12+m2z22+…mnzn2)I－溶液的離子強(qiáng)度；

mi－離子的摩爾濃度；

zi－離子的價(jià)數(shù)1，2，…n－代表各種離子。（3）溶液粘度：泳動(dòng)度與溶液粘度是成反比關(guān)系。因此，粘度過(guò)大或過(guò)小，必然影響泳動(dòng)度。4、電滲：當(dāng)支持物不是絕對(duì)惰性物質(zhì)時(shí)，常常會(huì)有一些離子基團(tuán)如羧基、磺酸基、羥基等吸附溶液中的正離子，使靠近支持物的溶液相對(duì)帶電。在電場(chǎng)作用下，此溶液層會(huì)向負(fù)極移動(dòng)。反之，若支持物的離子基團(tuán)吸附溶液中的負(fù)離子，則溶液層會(huì)向正極移動(dòng)。這種溶液層的泳動(dòng)現(xiàn)象稱為電滲。6第6頁(yè)，共19頁(yè)，2023年，2月20日，星期六

因此，當(dāng)顆粒的泳動(dòng)方向與電滲方向一致時(shí)，則加快顆粒的泳動(dòng)速度；當(dāng)顆粒的泳動(dòng)方向與電滲方向相反時(shí)，則降低顆粒的泳動(dòng)速度。

AB//////////////////////////////////////////

－－－－++++++++++－++++++++++－－－－+A支持物B支持物7第7頁(yè)，共19頁(yè)，2023年，2月20日，星期六5、焦耳熱：在電泳過(guò)程中，電流強(qiáng)度與釋放出熱量（Q）之間的關(guān)系可列成如下公式：Q＝I2Rt

式中R為電阻；t為電泳時(shí)間；I為電流強(qiáng)度。公式表明，電泳過(guò)程中釋放出的熱量與電流強(qiáng)度的平方成正比。當(dāng)電場(chǎng)強(qiáng)度或電極緩沖液中離子強(qiáng)度增高時(shí)，電流強(qiáng)度會(huì)隨著增大。這不僅降低分辨率，而且在嚴(yán)重時(shí)會(huì)燒斷濾紙或熔化瓊脂糖凝膠支持物。6、分子篩（篩孔）：支持物瓊脂和聚丙烯酰胺凝膠都有大小不等的篩孔--分子篩，在篩孔大的凝膠中溶質(zhì)顆粒泳動(dòng)速度快。反之，則泳動(dòng)速度慢。除上述影響泳動(dòng)速度的因子外，溫度和儀器裝置等因子的影響也應(yīng)考慮。8第8頁(yè)，共19頁(yè)，2023年，2月20日，星期六四、電泳的分類目前，電泳（electrophoresis）方法大致可分為三類顯微電泳、自由界面電泳（沒(méi)有支持物）及區(qū)帶電泳。以區(qū)帶電泳應(yīng)用比較廣泛。顯微電泳是用顯微鏡直接觀察細(xì)胞等大顆粒物質(zhì)電泳行為的過(guò)程。目前已用于研究膜結(jié)構(gòu)及癌細(xì)胞和正常細(xì)胞的差異性等方面。自由界面電泳是被分離的溶質(zhì)顆粒經(jīng)電泳后與緩沖溶液之間形成界面的電泳過(guò)程。利用適當(dāng)?shù)墓鈱W(xué)系統(tǒng)可觀察到界面的移動(dòng)。在電泳過(guò)程中，每個(gè)移動(dòng)界面（峰）相當(dāng)于某一特定的蛋白質(zhì)。如：用于血漿蛋白成分的電泳。

9第9頁(yè)，共19頁(yè)，2023年，2月20日，星期六10第10頁(yè)，共19頁(yè)，2023年，2月20日，星期六區(qū)帶電泳（zoneelectrophoresis）是由于在支持物上電泳時(shí)各組分因遷移速度不同分布成區(qū)帶而得名。區(qū)帶電泳按其支持物性狀（物理性狀）不同可以分為四類：1、濾紙和薄膜電泳：如醋酸薄膜電泳、聚酰胺薄膜電泳2、粉末電泳：支持介質(zhì)是淀粉、纖維素粉、硅膠粉等，粉末與適當(dāng)?shù)娜軇┱{(diào)和，鋪成平板。3、細(xì)絲電泳：如尼龍絲、人造絲電泳。此為微量電泳。4、凝膠電泳：最常用的支持介質(zhì)有：聚丙烯酰胺、瓊脂糖凝膠，凝膠可制作成平板或柱子。11第11頁(yè)，共19頁(yè)，2023年，2月20日，星期六

按儀器裝置形式可分為：

1、平板電泳：將支持物質(zhì)鋪在平板上（玻璃或有機(jī)玻璃）進(jìn)行電泳，此法最為常用。

2、垂直板電泳：將支持物鋪在平板上，作垂直裝置后進(jìn)行電泳。

3、垂直柱形電泳：將支持物質(zhì)裝在垂直的圓形玻璃柱內(nèi)進(jìn)行電泳。（圓盤電泳：將支持物質(zhì)裝入同一規(guī)格的玻璃管內(nèi)，在一不連續(xù)系統(tǒng)中進(jìn)行電泳，樣品分離后的區(qū)帶類似圓盤。）

12第12頁(yè)，共19頁(yè)，2023年，2月20日，星期六血清蛋白醋酸纖維素薄膜電泳法分離

實(shí)驗(yàn)?zāi)康?掌握醋酸纖維薄膜電泳法分離蛋白質(zhì)

的原理和方法。

13第13頁(yè)，共19頁(yè)，2023年，2月20日，星期六相關(guān)知識(shí)血清蛋白

蛋白質(zhì)名稱等電點(diǎn)（pI）相對(duì)分子質(zhì)量白蛋白α1－球蛋白α2－球蛋白β－球蛋白γ－球蛋白4.85.065.065.126.85~7.56900020000030000090000~150000156000~30000014第14頁(yè)，共19頁(yè)，2023年，2月20日，星期六

血清蛋白醋酸纖維薄膜電泳一、原理：采用醋酸纖維薄膜作為支持物的電泳方法稱為醋酸纖維素薄膜電泳。醋酸纖維素是纖維素的羥基乙?；纬傻睦w維素醋酸酯。將它溶于有機(jī)溶劑（如：丙酮、氯仿、氯乙烯、乙酸乙酯等）后，涂抹成均勻的薄膜則成為醋酸纖維素薄膜。該膜具有均一的泡沫狀的結(jié)構(gòu)，厚度約為120微米，有很強(qiáng)的通透性，對(duì)分子移動(dòng)阻力很小。醋酸纖維素薄膜電泳具有微量、快速、簡(jiǎn)便、分辨力高，對(duì)樣品無(wú)拖尾和吸附現(xiàn)象等優(yōu)點(diǎn)。已廣泛應(yīng)用于科學(xué)實(shí)驗(yàn)、生化產(chǎn)品分析和臨床化驗(yàn)，如：血清蛋白、血紅蛋白、脂蛋白、球蛋白、糖蛋白等的分離和鑒定。二、操作要點(diǎn)15第15頁(yè)，共19頁(yè)，2023年，2月20日，星期六（一）儀器與薄膜的準(zhǔn)備：1、醋酸纖維薄膜的潤(rùn)濕和選擇：將醋酸纖維薄膜條浸于盛有巴比妥緩沖液的培養(yǎng)皿中，用鑷子輕壓，使它全部浸入緩沖液內(nèi)，待膜完全浸透（約半小時(shí)）后取出，夾在清潔的濾紙中間，輕輕吸去多余的緩沖液，同時(shí)分辨出光澤面和無(wú)光澤面，并用鉛筆在無(wú)光澤面上作記號(hào)。2、制作“濾紙橋”。（二）點(diǎn)樣：將此血清涂在薄載玻片的一端截面上，然后輕輕與距纖維薄膜一端2cm處接觸，樣品即呈一條帶狀滲透在纖維薄膜上。切不可用力過(guò)大把薄膜弄破。將薄膜平貼在濾紙橋上，點(diǎn)樣端放在陰極，加蓋密封平衡十分鐘。

（三）電泳：電壓穩(wěn)定在100～120V，時(shí)間45～60分鐘，待電泳區(qū)帶展開約3～3.5cm后關(guān)閉電源。16第16頁(yè)，共19頁(yè)，2023年，2月20日，星期六（四）染色：電泳完畢后立即取出薄膜，直接浸入染色液中，染色5～10分鐘。然后，用漂洗液浸洗，每10分鐘左右換一次漂洗液，連續(xù)更換3～5次，至背景無(wú)色為止。染色完后將薄膜夾在干凈的濾紙中，吸去多余的溶液。（五）結(jié)果判斷：一般在染色后的薄膜上可顯現(xiàn)清楚的五條區(qū)帶。從正極端起，依次為清蛋白，α1球蛋白，α2球蛋白，β球蛋白，γ球蛋白。

17第17頁(yè)，共19頁(yè)，2023年，2月20日，星期六

A清蛋白

12清蛋白

12B血清蛋白電泳圖譜18第18頁(yè)，共19頁(yè)，2023年，2月20日，星期