實(shí)時(shí)熒光定量技術(shù)

實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)的原理及應(yīng)用(RealtimeQuantitativePCR)

分子生物學(xué)技術(shù)平臺(tái)江燕瓊現(xiàn)在是1頁(yè)\一共有38頁(yè)\編輯于星期五提綱：

實(shí)時(shí)熒光定量PCR原理數(shù)學(xué)原理化學(xué)原理實(shí)時(shí)熒光定量PCR的方法應(yīng)用絕對(duì)定量相對(duì)定量定量PCR的實(shí)驗(yàn)要素平臺(tái)定量PCR儀器介紹現(xiàn)在是2頁(yè)\一共有38頁(yè)\編輯于星期五實(shí)時(shí)熒光定量PCR定義：在PCR反應(yīng)體系中加入熒光基團(tuán)，利用熒光信號(hào)累積實(shí)現(xiàn)了實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)整個(gè)PCR進(jìn)程，對(duì)起始模板進(jìn)行定量分析的方法?，F(xiàn)在是3頁(yè)\一共有38頁(yè)\編輯于星期五

與普通PCR的區(qū)別

普通PCR技術(shù)：在PCR結(jié)束后對(duì)終點(diǎn)產(chǎn)物進(jìn)行定量分析。實(shí)時(shí)定量PCR技術(shù)：實(shí)時(shí)檢測(cè)PCR擴(kuò)增，在擴(kuò)增的指數(shù)期對(duì)起始模板進(jìn)行定量。現(xiàn)在是4頁(yè)\一共有38頁(yè)\編輯于星期五現(xiàn)在是5頁(yè)\一共有38頁(yè)\編輯于星期五現(xiàn)在是6頁(yè)\一共有38頁(yè)\編輯于星期五現(xiàn)在是7頁(yè)\一共有38頁(yè)\編輯于星期五熒光閾值是在熒光擴(kuò)增曲線上人為設(shè)定的一個(gè)值，它可以設(shè)定在熒光信號(hào)指數(shù)擴(kuò)增階段任意位置上，一般熒光域值的設(shè)置是基線（背景）熒光信號(hào)的標(biāo)準(zhǔn)偏差的10倍。每個(gè)反應(yīng)管內(nèi)的熒光信號(hào)到達(dá)設(shè)定的域值時(shí)所經(jīng)歷的循環(huán)數(shù)被稱為CT值（thresholdvalue）?，F(xiàn)在是8頁(yè)\一共有38頁(yè)\編輯于星期五現(xiàn)在是9頁(yè)\一共有38頁(yè)\編輯于星期五

定量PCR的數(shù)學(xué)原理

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斜率與擴(kuò)增效率現(xiàn)在是12頁(yè)\一共有38頁(yè)\編輯于星期五現(xiàn)在是13頁(yè)\一共有38頁(yè)\編輯于星期五

熒光定量PCR化學(xué)原理

非特異性熒光標(biāo)記：

1、SYBRGreen

特異性熒光標(biāo)記：

2、TaqMan現(xiàn)在是14頁(yè)\一共有38頁(yè)\編輯于星期五1、SYBRGreen法現(xiàn)在是15頁(yè)\一共有38頁(yè)\編輯于星期五SYBRGreen熔解曲線分析

現(xiàn)在是16頁(yè)\一共有38頁(yè)\編輯于星期五SYBRGreen法優(yōu)缺點(diǎn)優(yōu)點(diǎn):對(duì)DNA模板沒(méi)有選擇性適用于任何DNA使用方便--不必設(shè)計(jì)復(fù)雜探針?lè)浅ｌ`敏便宜現(xiàn)在是17頁(yè)\一共有38頁(yè)\編輯于星期五2、TaqMan探針?lè)?/p>

現(xiàn)在是18頁(yè)\一共有38頁(yè)\編輯于星期五TaqMan作用機(jī)理

現(xiàn)在是19頁(yè)\一共有38頁(yè)\編輯于星期五

TaqMan法優(yōu)缺點(diǎn)

現(xiàn)在是20頁(yè)\一共有38頁(yè)\編輯于星期五Real-timePCR方法應(yīng)用現(xiàn)在是21頁(yè)\一共有38頁(yè)\編輯于星期五?絕對(duì)定量(AbsoluteQuantification，AQ)

病原體檢測(cè)轉(zhuǎn)基因食品檢測(cè)基因表達(dá)研究?相對(duì)定量(RelativeQuantification，RQ)

基因在不同組織中的表達(dá)差異藥物療效考核耐藥性研究現(xiàn)在是22頁(yè)\一共有38頁(yè)\編輯于星期五

絕對(duì)定量與相對(duì)定量的定義

現(xiàn)在是23頁(yè)\一共有38頁(yè)\編輯于星期五絕對(duì)定量通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)品定量絕對(duì)定量的標(biāo)準(zhǔn)樣品：已知拷貝數(shù)的質(zhì)粒DNA，做系列稀釋。標(biāo)準(zhǔn)樣品的種類：?含有和待測(cè)樣品相同擴(kuò)增片段的克隆質(zhì)粒?含有和待測(cè)樣品相同擴(kuò)增片段的cDNA?PCR的產(chǎn)物現(xiàn)在是24頁(yè)\一共有38頁(yè)\編輯于星期五絕對(duì)定量：從熒光到拷貝數(shù)

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相對(duì)定量通過(guò)內(nèi)標(biāo)定量

內(nèi)標(biāo)（EndogenousControl）通常是β-actin、GAPDH基因等看家基因在細(xì)胞中的表達(dá)量或在基因組中的拷貝數(shù)恒定，受環(huán)境因素影響小內(nèi)標(biāo)定量結(jié)果代表了樣本中所含細(xì)胞或基因組數(shù)量現(xiàn)在是26頁(yè)\一共有38頁(yè)\編輯于星期五

相對(duì)定量：參照因子Calibrator

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相對(duì)定量分析方法1-ΔΔCt

前提：目標(biāo)序列和內(nèi)參序列的擴(kuò)增效率接近100％且偏差在5％以內(nèi)

1、用內(nèi)參基因的CT值歸一目標(biāo)基因的CT值：

ΔCT（test)=CT（target,test)-CT（ref,test)ΔCT（calibrator)=CT（target,calibrator)-CT（ref,calibrator)2、用校準(zhǔn)樣本的ΔCT值歸一試驗(yàn)樣本的ΔCT值：

ΔΔCT=ΔCT（test)-ΔCT（calibrator)3、計(jì)算表達(dá)水平比率：

2–ΔΔCT=表達(dá)量的比值現(xiàn)在是28頁(yè)\一共有38頁(yè)\編輯于星期五

相對(duì)定量分析方法2：雙標(biāo)準(zhǔn)曲線法

目標(biāo)基因與內(nèi)參基因擴(kuò)增效率不同

待測(cè)樣品目的基因濃度

待測(cè)樣品內(nèi)參基因濃度

F=

對(duì)照樣品目的基因濃度對(duì)照樣品內(nèi)參基因濃度現(xiàn)在是29頁(yè)\一共有38頁(yè)\編輯于星期五

定量PCR的實(shí)驗(yàn)要素現(xiàn)在是30頁(yè)\一共有38頁(yè)\編輯于星期五

樣品

●DNA純度：OD260/OD280=1.8，1.6~2.0之間●DNA用量：0.05ng–100ng●RNA純度：OD260/OD280=2.0●cDNA用量：1-100ng總RNA反轉(zhuǎn)錄的cDNA取1uL現(xiàn)在是31頁(yè)\一共有38頁(yè)\編輯于星期五

標(biāo)準(zhǔn)品

現(xiàn)在是32頁(yè)\一共有38頁(yè)\編輯于星期五

標(biāo)準(zhǔn)品梯度稀釋方法

現(xiàn)在是33頁(yè)\一共有38頁(yè)\編輯于星期五復(fù)管測(cè)試●樣品和標(biāo)準(zhǔn)品都要重復(fù)●重復(fù)次數(shù)須遵循統(tǒng)計(jì)學(xué)要求現(xiàn)在是34頁(yè)\一共有38頁(yè)\編輯于星期五平臺(tái)PCR儀介紹ABI7500fast特征：使用96孔板，樣品量大，儀器穩(wěn)定，結(jié)果分析直觀ABI試劑ROX校正物理方面的誤差：槍的誤差（如試劑體積）、耗材質(zhì)量（如管蓋厚度、透光性能不一致）所導(dǎo)致的光能損失、儀器穩(wěn)定性（如孔間、批間溫度的波動(dòng)）Rn=Normalization=Reporter/Referenc現(xiàn)在是35頁(yè)\一共有38頁(yè)\編輯于星期五Rotorgene6500HRM特征：36孔(普通透明0.2mlPCR管)或者7