精減分子生物學技術(shù)簡介碩

精減分子生物學技術(shù)簡介碩第1頁/共43頁第九章分子生物學技術(shù)簡介第2頁/共43頁核酸純化技術(shù)與電泳技術(shù)PCR技術(shù)分子雜交與印跡技術(shù)基因靶向技術(shù)Contents第3頁/共43頁一、核酸純化技術(shù)DNA純化

1.核酸混合物成分:

結(jié)構(gòu)類-細胞碎片，細胞器，其他大分子-DNA，RNA，Protein，糖類，脂類等小分子-氨基酸，小分子糖類和脂類，水，無機物等

2.關(guān)鍵:DNA，RNA—Protein

3.方案：

Protein變性苯酚：強變性25氯仿：弱變性24異戊醇：消泡1酚氯仿抽提法第4頁/共43頁4.苯酚的處理：重蒸-飽和-pH

重蒸：去除醌類氧化物飽和：防止核酸損耗

pH：pH7.0-8.0-核酸最適合

方法：蒸餾（183℃）-收集（棕色瓶）-飽和與調(diào)pH（Tris-HClpH8.0）-0.1%8-羥基喹啉-4℃或-20℃保存一、核酸純化技術(shù)DNA純化第5頁/共43頁方法樣品+等體積飽和苯酚10kb以上輕柔混勻；10kb以下振蕩離心（12000*g）取上清第6頁/共43頁核酸相Protein變性相有機相第7頁/共43頁電泳影響因素1.DNA物理性質(zhì)質(zhì)粒：CC＞L＞OC

線形：長度與泳動速度成負相關(guān)2.介質(zhì)性質(zhì)

分離范圍：agrose：100bp-60kbPAGE：5-500bp3.電壓：5v/cm4.緩沖液：TAE，TBE，TPETris堿三羥甲基氨基甲烷第8頁/共43頁●不同二級結(jié)構(gòu)形態(tài)及其電泳速度LinearDNA.

LOpenCircleDNAOCrelexedformSupercoiledcircleCovalentClosedCircle

CCC點樣孔第9頁/共43頁核酸定量的原理核酸的紫外吸收嘌呤堿和嘧啶堿具有共軛雙鍵，使堿基、核苷、核苷酸和核酸在240-290nm的紫外波段有一強烈吸收峰，最大吸收值在260nm附近。純核酸能用此法定量測定含量，但不純樣品不能用此法作定量檢測。瓊脂糖凝膠電泳分離出區(qū)帶，用EB染色后在紫外燈下粗略估計含量。第10頁/共43頁核酸定量的原理雙螺旋DNA：1OD260=50ug/ml單鏈DNA/RNA：1OD260=40ug/mloligonucleotide：1OD260=20g/ml純度：OD260/OD280=1.8-2.0小于1.8，表明有蛋白質(zhì)污染大于2.0，表明有RNA污染。第11頁/共43頁配10μM的引物貯液加多少μL

ddH2ODouble-distilled第12頁/共43頁核酸純化技術(shù)與電泳技術(shù)PCR技術(shù)分子雜交與印跡技術(shù)基因靶向技術(shù)Contents第13頁/共43頁二、PCR技術(shù)

PCR(polymerasechainreaction)即聚合酶鏈反應技術(shù)，是指利用耐熱DNA聚合酶的反復作用，通過變性-延伸-復性的循環(huán)操作，在體外迅速將DNA模板擴增數(shù)百萬倍的一種操作技術(shù)。理論上可在2小時內(nèi)將一個DNA分子擴增到106-109倍，從而大大提高了對其進行分析研究的速度。第14頁/共43頁PCR技術(shù)與NobelPrize

KaryB.MullisMichaelSmith第15頁/共43頁PolymeraseChainReaction

acopyingmachineforDNAmolecules

DNAmoleculescanbemass-producedfromincrediblysmallamountsofmaterialwithPCR.Mullis'discoveryallowsthechemisttomimicthecell'sownnaturalDNAreplicationprocessinatesttube.Ithasnowbecomemucheasiertocharacteriseandcomparethegeneticmaterialfromdifferentindividualsandorganisms.第16頁/共43頁FromadropofbloodExtractedDNAAbout95℃,thedsareseparated

About55℃,theprimersbindtothestrandsatthecorrectpositionsAbout72℃,theDNApolymerasewhichisaddedbuildsuptwonewcompletecopiesoftheDNAstrandsBycyclingthroughthethreetemperaturesthestrandsareseparatedandbuiltupagain.

第17頁/共43頁PCR反應系統(tǒng)的組成

PCR反應系統(tǒng)應包括：1．耐熱DNA聚合酶（Taq酶）：這是由耐熱細菌體內(nèi)提取的一種DNA聚合酶，可保證在95℃，30分鐘以上不會變性失活。2．模板DNA(template)：即待分析的目的DNA。3．兩種引物(primers)：為了保證DNA聚合酶能夠?qū)蓷l互補鏈均能進行延伸，需要兩種引物，分別位于兩條互補模板DNA鏈的3’-端。第18頁/共43頁4．四種脫氧核糖核苷酸(dNTP)：用作底物的dNTPS。5．緩沖溶液（buffer）：保證DNA聚合酶催化時所需的適當?shù)娜芤簆H值。

第19頁/共43頁PCR的反應原理

PCR反應時，一般采用變性-復性-延伸三步循環(huán)，也可采用變性-延伸兩步循環(huán)。1．變性：通常采用加熱變性，即將模板DNA或延伸后的雙鏈DNA加熱到950C，使雙螺旋DNA解開成為單鏈。

第20頁/共43頁2．復性：通過降低反應溫度至550C，使兩種引物能與兩條解開的DNA互補鏈的3`端粘合，以提供DNA聚合酶催化聚合所需的3`-OH。3．延伸：將反應溫度提高到約700C，在耐熱DNA聚合酶的催化下，根據(jù)模板DNA提供的堿基順序，合成兩條互補鏈，從而使模板DNA擴增一倍。按照上述步驟重復操作約30次，即可將模板DNA擴增數(shù)百萬倍。

第21頁/共43頁Cycle#1Cycle#2Cycle#3flashfilm第22頁/共43頁PCR的主要用途

（一）目的基因的克隆：①利用特異性引物以cDNA或基因組DNA為模板，獲得已知的目的基因；②利用簡并引物從cDNA文庫或基因組文庫中獲得具有同源性的DNA片段；③利用隨機引物從cDNA文庫或基因組文庫中隨機獲得目的基因。第23頁/共43頁（二）基因的體外突變：采用隨意設計的引物，在體外對基因進行嵌合、缺失、點突變等改造。（三）DNA的微量分析：由于PCR技術(shù)具有高度敏感性，故可用于微量DNA的分析檢測。

第24頁/共43頁核酸純化技術(shù)與電泳技術(shù)PCR技術(shù)分子雜交與印跡技術(shù)基因靶向技術(shù)Contents第25頁/共43頁（一）分子雜交：不同來源的單鏈核酸（DNA或RNA），只要它們具有大致相同的堿基序列，經(jīng)過退火處理，就能重新形成雜種雙螺旋，這一現(xiàn)象稱為分子雜交（molecularhybridization）。利用這一原理，就可以使用已知序列的單鏈核酸片段作為探針，去查找各種不同來源的基因組DNA分子中的同源基因或同源序列。三、分子雜交與印漬技術(shù)第26頁/共43頁（二）印跡技術(shù)：首先由EdwenSouthern在1975年提出。其基本操作過程是：將DNA片段在瓊脂糖凝膠中電泳分離后，置NaOH液中浸泡，從而將凝膠中的DNA變性為單鏈；然后將一張硝酸纖維素膜鋪在凝膠上，上面放上大量吸水紙巾，利用吸水紙巾的毛細作用，將單鏈DNA從凝膠中轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素膜上，再將膜置80℃烘干并使單鏈DNA分子固定在膜上，再用于分子雜交分析。用于DNA印漬的技術(shù)又稱為SouthernBlotting或Southern雜交。

第27頁/共43頁SouthernBlotting第28頁/共43頁酶標記的探針雜交顯色不同內(nèi)切酶切基因組DNA變性、轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜上酶切后的基因組DNA電泳第29頁/共43頁（三）探針技術(shù)：將已知序列的核酸片段用放射性同位素、生物素、酶或熒光染料進行標記，然后用于分子雜交，雜交后通過放射自顯影、熒光檢測或顯色技術(shù)，使雜交區(qū)帶顯現(xiàn)出來。第30頁/共43頁印跡技術(shù)的類別及應用

（一）DNA印跡技術(shù)：又稱Southern雜交，即DNA-DNA雜交分析。（二）RNA印跡技術(shù)：又稱Northern雜交，即RNA-DNA雜交分析。（三）蛋白質(zhì)印跡技術(shù)：又稱Western雜交，或免疫印跡技術(shù)，即利用抗原-抗體反應，檢測轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素膜上的特異性蛋白質(zhì)。（四）Eastern雜交，通過電轉(zhuǎn)移法將等電聚焦分離的蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素膜上，利用抗原-抗體反應，檢測轉(zhuǎn)移到膜上特異性蛋白質(zhì)。第31頁/共43頁*

是Southern于1975年創(chuàng)建用以鑒定DNA中某一特定的基因片段的技術(shù)，也稱為Southern印跡（SouthernBlot）。*通過標記的探針DNA與靶DNA結(jié)合，檢測目的基因的存在及大小。Southern雜交第32頁/共43頁Northern雜交*也稱為Northern印跡（NorthernBlot），用以檢測某一特定的RNA（通常是mRNA）片段的存在及表達量。*因與DNA的雜交（Southern雜交）相對應，故被趣稱為Northern雜交。第33頁/共43頁Western(印跡)雜交*蛋白質(zhì)水平上的雜交技術(shù)，又稱為免疫印跡，即檢測蛋白質(zhì)與標記的特定蛋白抗體結(jié)合，經(jīng)放射自顯影顯示條帶，根據(jù)條帶密度確定蛋白質(zhì)表達量。*與DNA、RNA水平上的Southern雜交、Northern雜交相對應，稱為Western雜交。*常結(jié)合Northern印跡技術(shù)，檢測基因表達調(diào)控。第34頁/共43頁核酸純化技術(shù)與電泳技術(shù)PCR技術(shù)分子雜交與印跡技術(shù)基因靶向技術(shù)Contents第35頁/共43頁四、基因靶向技術(shù)“基因靶向”技術(shù)是指利用細胞脫氧核糖核酸(DNA)可與外源性DNA同源序列發(fā)生同源重組的性質(zhì)，定向改造生物某一基因的技術(shù)。CapecchiEvansSmithies2007NobelPrizeforphysiologyormedicine第36頁/共43頁四、基因靶向技術(shù)Genetargetingisagenetictechniquethatuseshomologousrecombinationtochangeanendogenousgene.Themethodcanbeusedtodeleteagene,removeexons,andintroducepointmutations.Genetargetingcanbepermanentorconditional.Conditionscanbeaspecifictimeduringdevelopment/lifeoftheorganismorlimitationtoaspecifictissue,forexample.Genetargetingrequiresthecreationofaspecificvectorforeachgeneofinterest.However,itcanbeusedforanygene,regardlessoftranscriptionalactivityorgenesize.

第37頁/共43頁基因敲除基因敲除（gene

knock-out）：利用基因打靶技術(shù)，用無功能的外源基因轉(zhuǎn)入細胞與基因組中同源序列進行同源重組，把具有功能的同源序列置換出來，造成功能基因的缺失或失活，這一技術(shù)叫基因敲除。第38頁/共43頁第39頁/共43頁關(guān)于諾貝爾獎兩次獲得NP的科學家波蘭裔法國女物理學家、化學家居里