自身免疫與生殖免疫學(xué)習(xí)班課件 7 169 李玉葉 子宮內(nèi)膜免疫組化檢測(cè)在不孕不育-Final 李玉葉

1運(yùn)用免疫組化定量分析子宮內(nèi)膜免疫細(xì)胞譜臨床應(yīng)用的研究李玉葉liyuye519@163.com

深圳中山泌尿外科醫(yī)院生殖免疫診療中心圍著床期生殖免疫重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室免疫組化在臨床上的應(yīng)用免疫組化是病理科的常規(guī)輔助技術(shù)，如同臨床醫(yī)生依賴B超、CT、MRI一樣，對(duì)臨床各類疾病的病理診斷、疾病治療與預(yù)后都有非常重要的意義。0102腫瘤診斷感染性疾病腫瘤診斷、鑒別診斷;協(xié)助診斷腫瘤的良惡性;確定轉(zhuǎn)移性惡性腫瘤的原發(fā)部位;對(duì)某類腫瘤進(jìn)行進(jìn)一步的病理分型;指導(dǎo)腫瘤的治療和判斷預(yù)后。在感染灶中檢測(cè)到病原體，進(jìn)行原位病因診斷。免疫組化檢測(cè)子宮內(nèi)膜免疫細(xì)胞譜診斷意義？

子宮內(nèi)膜免疫微環(huán)境子宮內(nèi)膜癌Contents目錄P01臨床意義建立參考范圍P03臨床應(yīng)用研究P04子宮內(nèi)膜免疫細(xì)胞在妊娠過程中的調(diào)節(jié)作用建立正?？稍信苑N植窗期子宮內(nèi)膜免疫細(xì)胞的參考范圍對(duì)于反復(fù)生殖失敗患者的子宮內(nèi)膜免疫細(xì)胞的譜臨床應(yīng)用的探索運(yùn)用免疫組化定量分析子宮內(nèi)膜免疫細(xì)胞譜的臨床應(yīng)用研究P02定量分析運(yùn)用免疫組化定量分析子宮內(nèi)膜免疫細(xì)胞譜Contents目錄P01臨床意義建立參考范圍P03臨床應(yīng)用研究P04子宮內(nèi)膜免疫細(xì)胞在妊娠過程中的調(diào)節(jié)作用建立正常可孕女性種植窗期子宮內(nèi)膜免疫細(xì)胞的參考范圍對(duì)于反復(fù)生殖失敗患者的子宮內(nèi)膜免疫細(xì)胞的診療與追蹤運(yùn)用免疫組化定量分析子宮內(nèi)膜免疫細(xì)胞譜的臨床應(yīng)用研究P02定量分析運(yùn)用免疫組化定量分析子宮內(nèi)膜免疫細(xì)胞譜免疫(Immunity)，顧名思義即免除瘟疫（古代的瘟疫指各種疫病）。免疫是指機(jī)體免疫系統(tǒng)識(shí)別自身與異己物質(zhì)，并通過免疫應(yīng)答排除抗原性異物，以維持機(jī)體生理平衡的功能。免疫的概念免疫在妊娠過程中的調(diào)節(jié)作用胚胎可在母體的子宮內(nèi)生長(zhǎng)而不被排斥，又要免受感染，母體對(duì)其識(shí)別和免疫耐受至關(guān)重要。懷孕會(huì)讓母親機(jī)體進(jìn)入一個(gè)獨(dú)特的免疫狀態(tài)MorG,AldoP,etal,NatRevImmunol.

2017Aug;17(8):469-482.胚胎植入孕中期孕晚期免疫在妊娠過程中的調(diào)節(jié)作用——時(shí)間上的動(dòng)態(tài)平衡9抑炎促炎抑炎促炎分娩第一階段第二階段第三階段正常妊娠抑炎促炎抑炎促炎分娩早產(chǎn)抑炎促炎促炎早期自然流產(chǎn)抑炎抑炎胚胎種植失敗促炎促炎MorG,AldoP,etal,NatRevImmunol.

2017Aug;17(8):469-482.

——時(shí)間上的動(dòng)態(tài)平衡免疫在妊娠過程中的調(diào)節(jié)作用妊娠早期子宮內(nèi)膜免疫細(xì)胞在妊娠過程中的調(diào)節(jié)作用定位黏附遷移侵襲TregMacrophagesNeutrophilNKcellsTCD8+TH17DC妊娠早期子宮內(nèi)膜免疫細(xì)胞在妊娠過程中的調(diào)節(jié)作用Day19(5%)Day24(25%)妊娠早期(70%)1）促進(jìn)胚胎粘附和植入，誘導(dǎo)免疫耐受2）調(diào)控滋養(yǎng)細(xì)胞遷移3）血管新生和重塑4）作為先天性免疫的重要組成部分保護(hù)子宮免受感染。12妊娠早期子宮內(nèi)膜NK細(xì)胞的免疫調(diào)節(jié)作用

促進(jìn)滋養(yǎng)層細(xì)胞遷移和血管新生

誘導(dǎo)免疫耐受uNK細(xì)胞妊娠早期子宮內(nèi)膜NK細(xì)胞的免疫調(diào)節(jié)作用

巨噬細(xì)胞是（macrophage）是蛻膜中最主要的APC，約占蛻膜淋巴細(xì)胞的20-25%。按功能不同，巨噬細(xì)胞可分為M1和M2兩種亞型AmericanJournalofReproductiveImmunology63(2010)460–471M1

促炎M2

抑炎14功能：1.免疫防御2.調(diào)節(jié)滋養(yǎng)細(xì)胞入侵3.血管生成調(diào)控4.誘導(dǎo)免疫耐受妊娠早期子宮內(nèi)膜巨噬細(xì)胞的免疫調(diào)節(jié)作用CD68+和CD163+巨噬細(xì)胞在首次IVF患者的失敗妊娠組中顯著增加。對(duì)Total、RM、RIF和不符合診斷人群，CD68+和CD163+巨噬細(xì)胞沒有顯著差異。15妊娠早期子宮內(nèi)膜巨噬細(xì)胞的免疫調(diào)節(jié)作用Treg細(xì)胞1,VignaliDA.etal,NatRevImmunol,2008;2,Aluvihare,V.R.,etal.,20043,Jasper,M.J.,etal.2006;4,Shima,T.,etal.2010妊娠早期子宮內(nèi)膜Treg細(xì)胞的免疫調(diào)節(jié)作用種植窗期妊娠早期妊娠晚期Shima,T.,etal.(2010).√Anti-CD25mAbCD25+Treg在種植窗期和妊娠早期起重要作用17ShigeruSaitogroup動(dòng)物實(shí)驗(yàn)妊娠早期子宮內(nèi)膜Treg細(xì)胞的免疫調(diào)節(jié)作用樹突狀細(xì)胞（DC）僅占外周血單個(gè)核細(xì)胞的0.1-0.5%，占蛻膜細(xì)胞的1-2%按功能不同，DC細(xì)胞可分為兩種亞群：非成熟DC（imDC，CD1a）抑炎，誘導(dǎo)免疫耐受成熟DC（mDC，CD83）

促炎，免疫防御，誘導(dǎo)免疫排斥

功能：1.抗原遞呈2.誘導(dǎo)免疫耐受3.血管新生

JournalofReproductiveImmunology88(2011)86–9218妊娠早期子宮內(nèi)膜樹突狀細(xì)胞的免疫調(diào)節(jié)作用PercentageofpositivecellsCD1aCD83ControlRMRIFControlRMRIFPercentageofpositivecellsunpublisheddata子宮內(nèi)膜成熟型DC增加可能與反復(fù)流產(chǎn)和種植失敗的發(fā)病機(jī)制有關(guān)19妊娠早期子宮內(nèi)膜樹突狀細(xì)胞的免疫調(diào)節(jié)作用促/抑炎因子偏向于抑炎胚胎侵入子宮內(nèi)膜能力降低子宮內(nèi)膜粘附分子、整合素表達(dá)降低血管生成降低妊娠失敗母胎界面免疫細(xì)胞活化攻擊和殺傷滋養(yǎng)細(xì)胞絨毛血管血栓形成促/抑炎因子偏向于促炎TheLancet

351.9117(1998):1670-1672.Seminarsinimmunopathology.Vol.38.No.6.SpringerBerlinHeidelberg,2016.妊娠早期子宮內(nèi)膜免疫細(xì)胞的作用NK細(xì)胞，巨噬細(xì)胞，CD8+T細(xì)胞，DC細(xì)胞NK細(xì)胞，巨噬細(xì)胞，CD8+T細(xì)胞，Treg細(xì)胞在妊娠早期，子宮內(nèi)膜免疫細(xì)胞主要發(fā)揮以下作用：免疫耐受；避免胎兒感染；滋養(yǎng)層侵襲；血管生長(zhǎng)；組織修復(fù)等。子宮內(nèi)膜免疫細(xì)胞在胚胎種植及早期發(fā)育過程中發(fā)揮重要作用。若數(shù)量發(fā)生異常，則會(huì)導(dǎo)致母體對(duì)胎兒的免疫排斥，胎兒的感染或新生血管不足，胎兒發(fā)育停止等，最終導(dǎo)致不良妊娠結(jié)局的發(fā)生。因此評(píng)估子宮內(nèi)膜免疫細(xì)胞譜可以充分了解種植窗期子宮內(nèi)膜免疫微環(huán)境的平衡及穩(wěn)定狀態(tài)，臨床醫(yī)生可以及時(shí)通過藥物糾正患者的異常免疫反應(yīng)。小結(jié)Contents目錄P01臨床意義建立參考范圍P03臨床應(yīng)用研究P04子宮內(nèi)膜免疫細(xì)胞在妊娠過程中的調(diào)節(jié)作用建立正?？稍信苑N植窗期子宮內(nèi)膜免疫細(xì)胞的參考范圍對(duì)于反復(fù)生殖失敗患者的子宮內(nèi)膜免疫細(xì)胞的診療與追蹤運(yùn)用免疫組化定量分析種子宮內(nèi)膜免疫細(xì)胞譜的臨床應(yīng)用研究P02定量分析運(yùn)用免疫組化定量分析子宮內(nèi)膜免疫細(xì)胞譜Part2運(yùn)用免疫組化定量分析子宮內(nèi)膜免疫細(xì)胞譜2.1

為什么做子宮內(nèi)膜免疫細(xì)胞譜的定量分析？2.2如何通過免疫組化實(shí)現(xiàn)子宮內(nèi)膜免疫細(xì)胞譜的定量分析？2.3

如何進(jìn)行免疫組化定量分析的質(zhì)量控制？腫瘤組織---有或無

CD56+NK細(xì)胞定性分析

健康人子宮內(nèi)膜和妊娠失敗子宮內(nèi)膜CD138+

漿細(xì)胞定性分析定量分析2.1為什么做子宮內(nèi)膜免疫細(xì)胞譜的定量分析？在健康人群中，胚胎種植窗期，子宮內(nèi)膜聚集了大量的免疫細(xì)胞以幫助胚胎種植與生長(zhǎng)。而研究證明在復(fù)發(fā)性流產(chǎn)及反復(fù)種植失敗患者中，子宮內(nèi)膜免疫細(xì)胞如NK細(xì)胞，CD8+T細(xì)胞，M1型巨噬細(xì)胞等顯著增加，Treg細(xì)胞，耐受型樹突狀細(xì)胞明顯減少。由此可看出妊娠失敗患者子宮內(nèi)膜免疫細(xì)胞并不是有或無的關(guān)系，無法靠定性去判斷患者的子宮內(nèi)膜免疫細(xì)胞異常情況。CD56CD68Foxp3CD8CD1aCD83子宮內(nèi)膜免疫細(xì)胞譜的定量分析為臨床醫(yī)生提供更加準(zhǔn)確的診斷！2.1為什么做子宮內(nèi)膜免疫細(xì)胞譜的定量分析？檢測(cè)方法優(yōu)點(diǎn)缺點(diǎn)流式細(xì)胞術(shù)可以較客觀的計(jì)算出陽性細(xì)胞的百分率在細(xì)胞懸液的制作過程中，會(huì)丟失部分細(xì)胞，并且酶消化處理等步驟可能會(huì)影響目標(biāo)分子的水平免疫組化保留了原始樣本，不僅可以觀察表達(dá)情況，還可以觀察陽性信號(hào)的分布情況。并且更易于臨床應(yīng)用。結(jié)果分析較主觀，并且目前結(jié)果展示方法各異。其中包括？個(gè)陽性細(xì)胞/mm2、？個(gè)陽性細(xì)胞/視野、陽性細(xì)胞百分比等定量分析方法的選擇2.2如何通過免疫組化實(shí)現(xiàn)子宮內(nèi)膜免疫細(xì)胞譜的定量分析？27免疫組化定量分析臨床檢測(cè)應(yīng)用難點(diǎn)引進(jìn)PE多光譜數(shù)字化病理分析系統(tǒng)Leica自動(dòng)染色儀免疫組化自動(dòng)化檢測(cè)與分析平臺(tái)多光譜數(shù)字化病理分析系統(tǒng)分析前分析后陽性細(xì)胞數(shù)：45總細(xì)胞數(shù)：2344陽性細(xì)胞率：1.92%多光譜數(shù)字化病理分析系統(tǒng)圖

2.隨機(jī)選擇不同的30個(gè)視野分析的結(jié)果比較31/50臨床問題：檢測(cè)平臺(tái)的穩(wěn)定性圖

1.30個(gè)視野與全片掃描的結(jié)果比較分析前01分析后03分析中02所有的標(biāo)本固定取樣時(shí)間（黃體中期取樣）、大?。ㄍ粡S家子宮內(nèi)膜取樣管，所有操作統(tǒng)一培訓(xùn)）自動(dòng)化檢測(cè)與分析（自動(dòng)免疫組化染色儀，自動(dòng)數(shù)字化病理分析系統(tǒng)）、標(biāo)準(zhǔn)操作流程、質(zhì)控片、根據(jù)WHO推薦公式制定人員質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn)、設(shè)備定期維護(hù)及不同批次試劑間的驗(yàn)證分析患者疾病狀態(tài)與檢測(cè)數(shù)據(jù)的相關(guān)性，如BMI，內(nèi)異癥，內(nèi)膜炎等。異常報(bào)告追蹤患者病史，與臨床醫(yī)生討論2.3

如何進(jìn)行免疫組化定量分析的質(zhì)量控制？每批次質(zhì)控指標(biāo)每月質(zhì)控指標(biāo)

每年質(zhì)控指標(biāo)1.1.利用既往數(shù)據(jù)繪制質(zhì)控片與初診患者均值L-J質(zhì)控圖，患者異常率折線圖。1.2每批次質(zhì)控片檢測(cè)值、初診均值、患者異常率，列出患者數(shù)據(jù)明細(xì)，對(duì)于異?；颊咛貏e匯報(bào)及討論。2.1利用既往數(shù)據(jù)繪制質(zhì)控片與初診患者均值L-J質(zhì)控圖，患者異常率折線圖。2.2每月質(zhì)控片檢測(cè)值、初診均值、患者異常率。3.1繪制近3年的初診患者均值L-J質(zhì)控圖，患者異常率折線圖3.2與上一年度比較，看全年的初診患者均值，患者異常率，通過不同年份的數(shù)據(jù)分析比較尋找數(shù)據(jù)波動(dòng)的原因，總結(jié)上年度新計(jì)劃、新改動(dòng)的實(shí)施效果等。2.3如何進(jìn)行免疫組化定量分析的質(zhì)量控制？免疫組化定量分析種植窗期子宮內(nèi)膜免疫細(xì)胞數(shù)量可應(yīng)用于臨床檢測(cè)。免疫組化定量分析質(zhì)量控制尤為重要，自動(dòng)化的免疫組化實(shí)驗(yàn)與分析平臺(tái)為質(zhì)量控制提供了基礎(chǔ)，子宮內(nèi)膜免疫細(xì)胞數(shù)量特有的質(zhì)控分析體系為檢測(cè)的穩(wěn)定性提供保障。

小結(jié)Contents目錄P01臨床意義建立參考范圍P03臨床應(yīng)用研究P04子宮內(nèi)膜免疫細(xì)胞在妊娠過程中的調(diào)節(jié)作用建立正常可孕女性種植窗期子宮內(nèi)膜免疫細(xì)胞的參考范圍對(duì)于反復(fù)生殖失敗患者的子宮內(nèi)膜免疫細(xì)胞的譜臨床應(yīng)用的探索運(yùn)用免疫組化定量分析子宮內(nèi)膜免疫細(xì)胞譜的臨床應(yīng)用研究P02定量分析運(yùn)用免疫組化定量分析子宮內(nèi)膜免疫細(xì)胞譜CLSI(美國臨床實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)化委員會(huì))最新制定的指南C28-A3中指出建立參考區(qū)間的基本過程為：(1)選擇參考人群；----第一周期行IVF成功并繼續(xù)妊娠的患者(2)篩選參考個(gè)體；----排除影響內(nèi)膜免疫狀態(tài)的疾病(3)形成參考樣本組；----將符合條件的患者納入對(duì)照組(4)獲得參考值；(5)得到參考分布、參考限和參考區(qū)間。Part3建立正?？稍信苑N植窗期子宮內(nèi)膜免疫細(xì)胞的參考范圍（一）入選標(biāo)準(zhǔn)1.來生殖中心行IVF初診的育齡女性，患者年齡：≤40歲；2.HE染色結(jié)果顯示：子宮內(nèi)膜腺體與間質(zhì)反應(yīng)一致，黃體中期；4.子宮內(nèi)膜厚度＞7mm；5.移植胚胎時(shí)間距離活檢子宮內(nèi)膜組織＜3個(gè)月；4.簽署手術(shù)知情同意書行IVF第一周期滿3個(gè)月繼續(xù)妊娠。（二）排除標(biāo)準(zhǔn)1.≥2次人流或藥流；2.≥2次生化妊娠丟失；3.外院IVF移植未孕；4.影響宮腔環(huán)境的因素：輸卵管炎，子宮內(nèi)膜炎，巧克力囊腫，子宮內(nèi)膜異位癥或做過子宮內(nèi)膜異位癥相關(guān)手術(shù)，子宮息肉或做過息肉相關(guān)手術(shù)，腺肌癥，多囊卵巢綜合癥，疤痕子宮（有憩室或月經(jīng)拖尾），促排卵時(shí)發(fā)現(xiàn)有積水包括宮腔積水和輸卵管積水等。入選不少于120例正?？稍信缘娜脒x標(biāo)準(zhǔn)及排除標(biāo)準(zhǔn)可孕女性CD56CD68Foxp3CD83CD1aCD8子宮內(nèi)膜免疫細(xì)胞在可孕女性中的表達(dá)情況子宮內(nèi)膜免疫細(xì)胞譜參考范圍取正常可孕女性的P5-P95區(qū)間，為子宮內(nèi)膜各免疫細(xì)胞的參考范圍。反復(fù)流產(chǎn)患者RM患者對(duì)于每個(gè)患者而言，其異常的免疫細(xì)胞類別是各不相同的子宮內(nèi)膜免疫細(xì)胞譜參考范圍反復(fù)種植失敗患者RIF患者對(duì)于每個(gè)患者而言，其異常的免疫細(xì)胞類別是各不相同的子宮內(nèi)膜免疫細(xì)胞譜參考范圍42子宮內(nèi)膜各種免疫細(xì)胞異常率Part4對(duì)于反復(fù)生殖失敗患者的子宮內(nèi)膜免疫細(xì)胞的譜臨床應(yīng)用的探索治療目標(biāo)：子宮內(nèi)膜免疫細(xì)胞回歸穩(wěn)態(tài)妊娠失敗的一種表現(xiàn)：內(nèi)膜免疫細(xì)胞失衡按照百分位分?jǐn)?shù)計(jì)算CD56與妊娠結(jié)局的關(guān)系N=112生化妊娠率臨床妊娠率<P25<2.430/00/0P25-P502.43-4.782/1020%1/1010%P50-P754.78-10.6724/4949%19/4939%P75-P9510.67-21.1627/4363%25/4358%>P95>21.163/1030%2/1020%

根據(jù)患者妊娠結(jié)局再次確認(rèn)參考范圍的有效性，以CD56為例51.9%患者服用糖皮質(zhì)激素后uNK顯著下降。QuenbyS,etal.FertilityandSterility.2005(84),4Data