結(jié)核病分子生物學(xué)及分子流行病學(xué)

結(jié)核病分子生物學(xué)及分子流行病學(xué)第1頁/共78頁結(jié)核病實(shí)驗(yàn)室診斷及新診斷工具第2頁/共78頁一.結(jié)核病細(xì)菌學(xué)基礎(chǔ)二.結(jié)核病實(shí)驗(yàn)室診斷方法三.結(jié)核病實(shí)驗(yàn)室新診斷工具第3頁/共78頁一.結(jié)核病細(xì)菌學(xué)基礎(chǔ)

—結(jié)核分枝桿菌第4頁/共78頁

分枝桿菌

1882年KOCH發(fā)現(xiàn)，至今已經(jīng)發(fā)現(xiàn)100多種，有結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群、非結(jié)核分枝桿菌、麻風(fēng)桿菌。引起肺結(jié)核的主要有人型、牛型、非洲、田鼠等結(jié)核分枝桿菌，稱結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群；(結(jié)核分枝桿菌是緩慢生長菌）大部分非結(jié)核分枝桿菌不致病,部分非結(jié)核分枝桿菌可引起人體類似結(jié)核樣病變—非結(jié)核分枝桿菌肺??；麻風(fēng)分枝桿菌引起麻風(fēng)病。

第5頁/共78頁分枝桿菌分類

分類生長速度菌落和色素產(chǎn)生代表菌種致病性結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群生長緩慢結(jié)核分枝桿菌、結(jié)核病牛分枝桿菌非結(jié)核分枝桿菌RunyonⅠ組生長緩慢菌落不見光時(shí)為淡黃色,堪薩斯分枝桿菌肺結(jié)核樣病變光照后則變?yōu)辄S色或橙色海分枝桿菌

結(jié)節(jié)與潰瘍RunyonⅡ組在37℃生長緩慢在暗處培養(yǎng)時(shí)菌落瘰癘分枝桿菌兒童淋巴結(jié)炎呈橘紅色

RunyonⅢ組40～42℃下生長慢通常不產(chǎn)生色素鳥-胞內(nèi)分枝桿菌結(jié)核樣病變，多見于肺與腎RunyonⅣ組在25～45℃快速生長。培養(yǎng)5～7天即可見到菌落個(gè)別種產(chǎn)生色素偶發(fā)分枝桿菌極少致病麻風(fēng)分枝桿菌人工培養(yǎng)基上不生長麻風(fēng)病第6頁/共78頁結(jié)核分枝桿菌是一類細(xì)長略彎曲的長桿菌，由于細(xì)胞壁含有大量脂質(zhì)，能抵抗酸酒精脫色能力，抗酸染色陽性。緩慢生長菌。致病性與菌體成分有關(guān)，莢膜-多糖；脂質(zhì)-索狀因子、磷脂、蠟質(zhì)D；蛋白質(zhì)。易發(fā)生形態(tài)、耐藥、毒力、免疫性變異。對(duì)干燥抵抗力強(qiáng)，對(duì)濕熱、紫外線敏感。第7頁/共78頁

病灶中結(jié)核分枝桿菌菌群：

結(jié)核病變中有四種不同代謝狀態(tài)的結(jié)核菌群,它們對(duì)化學(xué)藥物的反應(yīng)各不相同：A群：快速生長菌，生長繁殖旺盛，致病力和傳染性強(qiáng)，存在于細(xì)胞外，多在疾病早期的活動(dòng)性病灶和空洞內(nèi)，容易被抗結(jié)核藥物所殺滅，異煙肼效果最好，起主要?dú)⒕饔?，鏈霉素及利福平亦有效。B群：緩慢繁殖菌，存在于干酪壞死灶內(nèi)，結(jié)核桿菌常呈休眠狀態(tài)，偶爾發(fā)生短暫的生長繁殖，僅對(duì)少數(shù)藥物如利福平敏感。C群：間斷繁殖菌，存在于巨噬細(xì)胞內(nèi)，細(xì)菌得到酸性細(xì)胞質(zhì)的保護(hù)，但繁殖緩慢。吡嗪酰胺在pH<5.5時(shí)，殺菌效果較好。B群與C群為頑固菌，可存活數(shù)月、數(shù)年，亦稱“持續(xù)存活菌”，是日后復(fù)發(fā)的根源。D群：完全休眠菌，病灶內(nèi)有少量結(jié)核桿菌完全處于休眠狀態(tài)，無致病力及傳染性，藥物對(duì)其無作用。第8頁/共78頁結(jié)核病化療抗結(jié)核藥物的治療目的是快速殺滅病灶內(nèi)的大量快速生長A群菌，以及緩慢和間歇繁殖的B、C菌群，已達(dá)到治愈。結(jié)核病化療應(yīng)該是高效殺菌，低不良反應(yīng)。INH對(duì)A群結(jié)核桿菌有抑制和殺滅作用；A、B、C菌群對(duì)RFP高度敏感，均有殺菌作用，是治療結(jié)核病標(biāo)志性藥物；SM對(duì)細(xì)胞外結(jié)核桿菌（A）有殺菌或抑制作用；PZA僅對(duì)細(xì)胞內(nèi)（C)有殺菌作用；EMB對(duì)細(xì)胞內(nèi)外有相仿的抑制作用。第9頁/共78頁體積相同性質(zhì)不同病灶與含菌量

肺結(jié)核的傳染性決定病人痰中結(jié)核菌的數(shù)量和病人的咳嗽癥狀。涂陽病人排菌量大，是主要傳染源，涂陰培陽病人傳染性小。

直徑2cm的空洞含菌數(shù)108-9

直徑2cm的干酪病灶菌量約105-6

直徑2cm的結(jié)節(jié)病灶或閉合干酪灶102-3第10頁/共78頁化療前后結(jié)核桿菌的定量分析對(duì)痰菌陽性病人在化療前后做結(jié)核桿菌培養(yǎng)的定量分析化療前每ml細(xì)菌數(shù)106(1000000/ml-4+）化療2周后減少至5％（50000/ml-2+）4周減少至0.25％(2500/ml-陰性）,化療后結(jié)核桿菌呈對(duì)數(shù)減少以至消失，降低了傳染性第11頁/共78頁二.結(jié)核病實(shí)驗(yàn)室診斷方法細(xì)菌學(xué)檢查－涂片、培養(yǎng)、藥敏免疫學(xué)檢查－皮試、結(jié)核抗體第12頁/共78頁

痰涂片檢查的意義

1、發(fā)現(xiàn)傳染性肺結(jié)核的主要方法目前，控制結(jié)核病流行以發(fā)現(xiàn)和控制傳染源為主。我國優(yōu)先控制痰涂片陽性肺結(jié)核。

2、評(píng)價(jià)傳染性肺結(jié)核的化療效果抗結(jié)核藥物的化療機(jī)理是殺滅病灶中結(jié)核桿菌，評(píng)價(jià)結(jié)核病的化療效果，必須以抗酸桿菌檢查結(jié)果作為依據(jù)。

3、為結(jié)核病疫情的流行病學(xué)統(tǒng)計(jì)服務(wù)傳染性結(jié)核病在流行病學(xué)中有特殊的意義，在反映一個(gè)國家或地區(qū)結(jié)核病疫情的嚴(yán)重程度的指標(biāo)中，涂陽患病率等被更多關(guān)注。第13頁/共78頁痰標(biāo)本的含菌量與痰涂片陽性檢出率的關(guān)系標(biāo)本菌量(個(gè)/ml)鏡檢可檢出菌量數(shù)(個(gè))檢出陽性結(jié)果的幾率(%)<10000/100或更多視野05000~100001~8/300視野50.0（報(bào)告實(shí)數(shù)）300003~9/100視野80.0（1+）500001~9/10視野90.0（2+）1000001~9/每視野96.2（3+）500000>10/每視野99.9（4+）初診的肺結(jié)核可疑癥狀者要進(jìn)行3次痰涂片檢查，強(qiáng)化期末和療程結(jié)束前均應(yīng)查2次痰涂片。查痰宣教，告知病人。第14頁/共78頁涂片檢查法

優(yōu)點(diǎn)：適用于痰、尿、便、體液、組織等幾乎一切標(biāo)本，有重要的臨床診斷價(jià)值；是發(fā)現(xiàn)和確定傳染源的主要方法，是考核和評(píng)價(jià)療效的重要指標(biāo)，有重要的流行病學(xué)意義；操作簡便、快速，成本低廉，適于各級(jí)實(shí)驗(yàn)室開展；約10-20肺結(jié)核病人痰涂片陽性。缺點(diǎn)：敏感性低：每毫升含5000-10000條以上抗酸菌才可得到陽性結(jié)果；特異性較低：只能報(bào)告“抗酸桿菌陽性”，不能區(qū)分結(jié)核和非結(jié)核分支桿菌；鏡下只能觀察菌體形態(tài)，不能辨別死、活菌。第15頁/共78頁TB

可疑者TB

病人標(biāo)本收集及保存標(biāo)本接收和登記涂片染色顯微鏡檢結(jié)果記錄材料準(zhǔn)備涂片保存用于EQA標(biāo)本/污染物的安全丟棄結(jié)果報(bào)告痰涂片顯微鏡檢查流程第16頁/共78頁查痰對(duì)象結(jié)核病可疑者咳嗽、咳痰超過2周咳血或伴有血痰發(fā)熱或胸痛超過2周胸部X線異常少量查痰代胸片的受檢者第17頁/共78頁痰標(biāo)本收集容器：廣口、螺旋蓋、可密閉、不易泄漏標(biāo)本性狀：干酪痰、血痰、粘液痰、唾液采集時(shí)間：即時(shí)痰、晨痰、夜間痰第18頁/共78頁痰標(biāo)本采集宣教指導(dǎo)病人：深吸氣2-3次，每次用力呼出從肺部深處咳出將打開蓋的痰盒靠近嘴邊收集痰液擰緊盒蓋可能需要反復(fù)嘗試，才能留取一份理想的痰標(biāo)本第19頁/共78頁只有高質(zhì)量的痰液才能有準(zhǔn)確可信的抗酸菌結(jié)果第20頁/共78頁涂片 編號(hào) 涂抹痰標(biāo)本 自然干燥第21頁/共78頁

載玻片：一張載玻片上只能涂抹一份痰標(biāo)本。每張載玻片只能使用一次，不得清洗后再次用于抗酸桿菌涂片檢查。應(yīng)使用95%乙醇擦拭或浸泡脫脂，用干燥、清潔、無劃痕的新載玻片涂片，在玻片背面左側(cè)1/3處注明實(shí)驗(yàn)序號(hào)及標(biāo)本序號(hào)（如載玻片有磨砂面，可用2B鉛筆書寫編號(hào)。如載玻片沒有磨砂面，必須用玻璃筆(或臘筆)書寫編號(hào)。第22頁/共78頁顯微鏡檢查1.接通電源，打開開關(guān)

上升聚光鏡至最高，調(diào)節(jié)光圈70－80％大小

2.將涂片放在載物臺(tái)上，痰膜朝上在油鏡下，至少檢查300個(gè)有用的和有代表性的視野（至少5分鐘）第23頁/共78頁8、結(jié)果報(bào)告陰性未發(fā)現(xiàn)抗酸菌/300視野報(bào)告實(shí)際菌數(shù)1-8條/300視野陽性1＋1-9條/100視野陽性2＋1-9條/10視野陽性3＋1-9條/每視野陽性4＋達(dá)到或超過10條/每視野第24頁/共78頁

結(jié)果按規(guī)定記錄在結(jié)核病細(xì)菌學(xué)實(shí)驗(yàn)室登記本和化驗(yàn)單上，報(bào)告痰涂片結(jié)果應(yīng)注明痰標(biāo)本的性狀。

陰性結(jié)果應(yīng)觀察300視野，觀察時(shí)間不少于5分鐘。陰性結(jié)果應(yīng)填寫“陰性”，不得以“—”表達(dá)。

第25頁/共78頁

分支桿菌分離培養(yǎng)意義1、在結(jié)核病診斷上具有重要意義，是目前結(jié)核病診斷的“黃金標(biāo)準(zhǔn)”;2、提高陽性率,使少數(shù)細(xì)菌也能長出來;3、進(jìn)一步進(jìn)行藥敏試驗(yàn)、菌型鑒定、DNA分析等。培養(yǎng)的主要方法有：1、傳統(tǒng)的改良羅氏培養(yǎng)基，需4-8W才能報(bào)告結(jié)果；2、快速液體培養(yǎng)，5-7天報(bào)告結(jié)果，可做藥敏。

什么情況下要做培養(yǎng)：1.涂陰要做鑒別診斷時(shí)，培養(yǎng)陽性可確診為肺結(jié)核；2.抗結(jié)核治療失敗，要做培養(yǎng)進(jìn)行菌型鑒定和藥敏試驗(yàn)。第26頁/共78頁常規(guī)培養(yǎng)（羅氏培養(yǎng)基）

優(yōu)點(diǎn)：靈敏度高于涂片法；可以鑒定死菌與活菌；可進(jìn)一步進(jìn)行菌種鑒定和藥敏試驗(yàn)

缺點(diǎn)：需時(shí)長久，4—8周；陽性率偏低，約30-40%；無法鑒定結(jié)核與非結(jié)核分支桿菌。被譽(yù)為診斷結(jié)核病的“黃金標(biāo)準(zhǔn)”第27頁/共78頁培養(yǎng)操作方法標(biāo)本前處理目的：液化標(biāo)本、去除雜菌、分離出分枝桿菌原理：分枝桿菌對(duì)酸堿有相對(duì)強(qiáng)的耐受力原則：盡可能殺滅標(biāo)本中的雜菌，盡可能保存標(biāo)本中的分枝桿菌步驟：取1－2ml痰標(biāo)本至前處理管視標(biāo)本性狀加入1－2倍體積的4％氫氧化鈉震蕩30－60秒至標(biāo)本完全液化室溫靜置15分鐘（整個(gè)處理時(shí)間不得超過20分鐘）第28頁/共78頁培養(yǎng)操作方法接種用無菌吸管取前處理后的標(biāo)本接種0.1ml至酸性羅氏培養(yǎng)基斜面盡量使菌液均勻鋪滿斜面每份標(biāo)本接種2支培養(yǎng)基第29頁/共78頁結(jié)果的觀察與報(bào)告接種后第3、7天各觀察一次菌落生長情況此后每周觀察一次，直至滿8周，每次觀察記錄菌落生長及污染情況分枝桿菌培養(yǎng)陰性：斜面無菌落生長分枝桿菌培養(yǎng)陽性（1+）：菌落生長占斜面面積的1/4分枝桿菌培養(yǎng)陽性（2+）：菌落生長占斜面面積的1/2分枝桿菌培養(yǎng)陽性（3+）：菌落生長占斜面面積的3/4分枝桿菌培養(yǎng)陽性（4+）：菌落生長布滿整個(gè)斜面菌落生長不足斜面面積1/4者，報(bào)實(shí)際菌落數(shù)。培養(yǎng)操作方法第30頁/共78頁結(jié)核分枝桿菌耐藥性測定（常規(guī)）我國是27個(gè)耐藥結(jié)核病高負(fù)擔(dān)國家之一，當(dāng)前耐藥結(jié)核病診斷主要依據(jù)DST，DST對(duì)有效化療方案的建立和預(yù)后的預(yù)測具有重要意義。方法：結(jié)核桿菌耐藥性測定的方法有絕對(duì)濃度法、比例法、儀器快速法和耐藥基因檢測法等。意義：指導(dǎo)用藥：化療前藥敏—選擇用藥;療效不佳時(shí)藥敏—觀察有無耐藥性、調(diào)整用藥。監(jiān)測社會(huì)中耐藥結(jié)核菌株的流行情況評(píng)價(jià)和改進(jìn)國家結(jié)核病控制措施的重要參考因素之一。第31頁/共78頁耐藥結(jié)核病相關(guān)定義判斷耐藥結(jié)核病需要通過體外藥敏試驗(yàn)證實(shí)結(jié)核桿菌是否耐藥。單耐藥：對(duì)一種一線抗結(jié)核藥物耐藥。多耐藥：對(duì)一種以上的一線抗結(jié)核藥物耐藥。耐多藥（MDR－TB）：至少同時(shí)對(duì)INH和RFP耐藥。嚴(yán)重耐多藥（XDR－TB）：至少同時(shí)對(duì)INH和RFP耐藥外，還對(duì)任何氟喹諾酮類抗生素（如：氧氟沙星）產(chǎn)生耐藥，以及三種二線抗結(jié)核注射藥物（如：卷曲霉素、卡那霉素、丁胺卡那霉素等）中的至少一種耐藥。第32頁/共78頁耐藥結(jié)核病疫情現(xiàn)狀

來自于2007-2008年全國結(jié)核病耐藥性基線調(diào)查：1.從涂陽肺結(jié)核病患者分離的結(jié)核分枝桿菌總耐藥率為37.79%，其中初治肺結(jié)核總耐藥率35.16%、復(fù)治肺結(jié)核總耐藥率55.17%。2.從涂陽肺結(jié)核病患者分離的結(jié)核分枝桿菌總耐多藥（MDR-TB）率為8.32%，其中初治肺結(jié)核總耐多藥率5.71%，復(fù)治肺結(jié)核總耐多藥率25.64%，3.總廣泛耐藥（XDR-TB）率為0.68%，其中初治患者為0.47%，復(fù)治患者為2.06%。第33頁/共78頁耐藥結(jié)核病疫情現(xiàn)狀4.根據(jù)此次調(diào)查結(jié)果估算，我國每年新發(fā)耐多藥肺結(jié)核患者約12萬例，其中廣泛耐藥肺結(jié)核患者近1萬例。

5.耐多藥肺結(jié)核患者分布以農(nóng)村為主，青壯年患者比例較高，耐藥結(jié)核病的性別分布沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。

6.不規(guī)范抗結(jié)核治療及患者依從性差是耐藥性產(chǎn)生的主要危險(xiǎn)因素。第34頁/共78頁免疫學(xué)檢查1、細(xì)胞免疫學(xué)診斷--結(jié)核菌素試驗(yàn)是常用的診斷與輔助診斷方法，其原理為IV型超敏反應(yīng)。臨床意義:(1)為接種卡介苗提供依據(jù)；(2)為測定免疫效果提供依據(jù)；(3)用于診斷與鑒別診斷。

2、體液免疫學(xué)診斷（血清學(xué)診斷）

是檢測結(jié)核抗體，細(xì)胞免疫隨者病情的加重而減弱，體液免疫隨著病變的加重（或血行播散）而增加，這種細(xì)胞免疫與體液免疫分離的現(xiàn)象在結(jié)核病方面表現(xiàn)非常明顯。

臨床意義：活動(dòng)性肺結(jié)核的診斷與鑒別診斷；各種肺外結(jié)核的診斷與鑒別診斷；器官移植并發(fā)結(jié)核感染的診斷。第35頁/共78頁三.結(jié)核病實(shí)驗(yàn)室新診斷工具（一）細(xì)菌學(xué)診斷技術(shù)（二）免疫學(xué)診斷技術(shù)（三）分子診斷技術(shù)第36頁/共78頁（一）細(xì)菌學(xué)診斷新技術(shù)

1、快速培養(yǎng)基

液體培養(yǎng)基—米氏7H9液體培養(yǎng)基雙相培養(yǎng)基—同時(shí)含有液體培養(yǎng)基變色培養(yǎng)基—固體、液體培養(yǎng)基

2、快速檢測方法

噬菌體法檢測技術(shù)液體培養(yǎng)結(jié)合顯微鏡觀察技術(shù)第37頁/共78頁1、快速培養(yǎng)基-液體培養(yǎng)基

米氏7H9液體培養(yǎng)基（肉湯基礎(chǔ)）

營養(yǎng)豐富：油酸、白蛋白、葡萄糖、過氧化氫酶等

細(xì)菌可獲得充足的養(yǎng)料：營養(yǎng)添加劑對(duì)于許多分枝桿菌生長至關(guān)重要

抑制污染：添加PANTA抑菌劑（多粘菌素B、兩性霉素B、萘啶酸、甲氧芐氨嘧啶、阿洛西林）第38頁/共78頁

全自動(dòng)分枝桿菌檢測系統(tǒng)（液體培養(yǎng)基）BACTEMGIT960System全自動(dòng)分枝桿菌檢測系統(tǒng)BacT-ALERT3D全自動(dòng)快速微生物/分枝桿菌培養(yǎng)偵測系統(tǒng)第39頁/共78頁先進(jìn)靈敏的檢測技術(shù)性能優(yōu)異--高檢出率、低檢出時(shí)間安全可靠--工作人員得到最佳保護(hù)大容量：960個(gè)培養(yǎng)管/臺(tái)，操作簡單完善的培養(yǎng)、鑒定和藥敏實(shí)驗(yàn)解決方案高性能價(jià)格比國際市場上唯一的專業(yè)分枝桿菌培養(yǎng)、鑒定和藥敏實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)BACTECMGIT960System全自動(dòng)分枝桿菌檢測系統(tǒng)第40頁/共78頁BactecMGIT960的基本原理是其所使用的培養(yǎng)瓶底部含有包被于樹脂上的熒光顯示劑，由于該顯示劑為氧抑制性，當(dāng)分支桿菌生長使氧消耗后，熒光顯示劑被激活，而發(fā)出熒光。檢測系統(tǒng)每隔60分鐘連續(xù)測定培養(yǎng)管內(nèi)熒光強(qiáng)度，從而判斷管內(nèi)分枝桿菌生長情況。該培養(yǎng)儀可用于痰、支氣管盥洗液、胸水、腹水、腦脊液、尿液、膿液、關(guān)節(jié)液、病灶組織或干酪塊各種臨床標(biāo)本的分枝桿菌培養(yǎng)、初步菌種鑒定和藥物敏感試驗(yàn)。結(jié)果表明：BactecMGIT960與BactecTB460、L-J三種方法的陽性率分別為80%、85%和71%，本平均報(bào)告時(shí)間為分別為13.3天、14.8天和25.7天。第41頁/共78頁

3D-240型血液、結(jié)核分枝桿菌培養(yǎng)儀

可同時(shí)進(jìn)行血培養(yǎng)、無菌體液微生物培養(yǎng)及快速結(jié)核桿菌培養(yǎng)。全自動(dòng)快速微生物/分枝桿菌培養(yǎng)偵測系統(tǒng)

—可同時(shí)處理血液、體液的待檢標(biāo)本第42頁/共78頁BacTALERT3D檢測原理：產(chǎn)色檢測技術(shù)細(xì)菌生化代謝細(xì)菌生長產(chǎn)生CO2CO2

降低pH值顏色感應(yīng)器轉(zhuǎn)為黃色培養(yǎng)瓶底的顏色感應(yīng)器含有溶解染料的硅膠不可逆顏色改變黃色陽性培養(yǎng)結(jié)果3D系統(tǒng)和常規(guī)培養(yǎng)法檢測分支桿菌平均報(bào)告時(shí)間分別為11.7天和26.8天。第43頁/共78頁

液體培養(yǎng)基

培養(yǎng)時(shí)間短（8~14天）陽性率高（比L-J增加15~20%）可做藥敏試驗(yàn)（儀器5~7天）

優(yōu)點(diǎn)缺點(diǎn)不能觀察菌落特征費(fèi)用較貴第44頁/共78頁分枝桿菌快速培養(yǎng)和耐藥性測定

分枝桿菌快速耐藥性測定主要有BACTEC460、BACTEC960、BacT/ALERT3D系統(tǒng)，標(biāo)本的前處理方法和接種方法基本一致，但檢測原理不同。

Bactec—960測定系統(tǒng)BacTALERT3D測定系統(tǒng)第45頁/共78頁分枝桿菌快速耐藥性測定陽性培養(yǎng)管取出后直接涂片進(jìn)行抗酸染色以確定是否為AFB。用陽性培養(yǎng)管制備菌懸液，接種于含有抗結(jié)核藥物的培養(yǎng)管中，然后置培養(yǎng)儀中進(jìn)行培養(yǎng)，根據(jù)分枝桿菌的生長情況而判斷該藥物敏感性。分枝桿菌快速培養(yǎng)檢出時(shí)間平均≦10天；快速藥敏檢出時(shí)間平均≦5天藥敏試驗(yàn)檢測包括RFP、SM、EMB、INH、PZA，同時(shí)用戶可進(jìn)行自定義藥敏試驗(yàn)第46頁/共78頁2.免疫學(xué)診斷新技術(shù)

(1)結(jié)核蛋白芯片

(2)特異性T細(xì)胞檢測

—酶聯(lián)免疫斑點(diǎn)試驗(yàn)（T-SPOT）

第47頁/共78頁

(1)結(jié)核蛋白芯片蛋白芯片始創(chuàng)于90年代初，又稱DNA芯片。其原理是將結(jié)核桿菌多種特異性蛋白抗原（16KDa、38KDa、LAM）固定在固相載體上，然后與待測樣本的抗體結(jié)合，通過檢測每個(gè)探針分子的雜交信號(hào)強(qiáng)度，進(jìn)而獲取樣品中抗體分子的數(shù)量和序列信息。該方法同時(shí)將大量蛋白抗原固定于支持物上，所以一次可以檢測多種抗體等信號(hào)?；蛐酒夹g(shù)也可應(yīng)用于結(jié)核桿菌的基因分型與菌種鑒定、耐藥性測定。第48頁/共78頁蛋白芯片法檢測結(jié)核抗體

結(jié)核蛋白芯片可以檢測結(jié)核分枝桿菌脂阿拉伯甘露聚糖（LAM）抗體，結(jié)核分枝桿菌蛋白16-KDa抗體和38-KDa抗體三種。臨床意義（1）鑒別痰涂片陽性者是否屬于結(jié)核桿菌感染。（2）提高痰涂片陰性患者的檢出率。（3）肺外結(jié)核的檢測。第49頁/共78頁

結(jié)核蛋白芯片檢測結(jié)核抗體的靈敏度38.5%，特異度96.5%。

不同類型結(jié)核病陽性率：培養(yǎng)陽性結(jié)核病61.2%、培養(yǎng)陰性結(jié)核病45.7%、結(jié)腦29.9%、結(jié)核性胸膜炎23.3%、骨結(jié)核27.3%。結(jié)核蛋白芯片診斷結(jié)核病是較有效的方法之一，具有較好的特異性和快速診斷等優(yōu)點(diǎn)。第50頁/共78頁(2)特異性T細(xì)胞檢測

酶聯(lián)免疫斑點(diǎn)試驗(yàn)（T-SPOT）

原理：結(jié)核菌感染者體內(nèi)存在特異的效應(yīng)T淋巴細(xì)胞，效應(yīng)T淋巴細(xì)胞再次受到結(jié)核抗原刺激時(shí)會(huì)分泌多種細(xì)胞因子（IFN-γ），通過高靈敏度的酶免法使IFN-γ滯留在微孔板表面，顯色底物在反應(yīng)部位被酶分解成沉淀的色素斑點(diǎn)。每一個(gè)斑點(diǎn)代表一個(gè)γ干擾素分泌細(xì)胞，從而對(duì)結(jié)核桿菌感染進(jìn)行輔助診斷。又稱γ干擾素釋放試驗(yàn)。

檢測用的抗原：ESAT-6和CFP-10

ESAT-6和CFP-10二種蛋白只存在于結(jié)核分枝桿菌中。第51頁/共78頁

潛伏性結(jié)核的診斷和治療

大量的潛伏性結(jié)核感染者是新發(fā)結(jié)核病患者的主要來源，潛伏感染的人群數(shù)量非常龐大，因此，我們必須通過努力鑒別并治療這些潛伏期的結(jié)核感染者。

以前潛伏感染主要依賴于皮膚試驗(yàn)診斷，該試驗(yàn)特異性低，與BCG和其他分枝桿菌感染有交叉；靈敏度低，活動(dòng)性結(jié)核病中靈敏度75~90%，特別在播散性結(jié)核病和免疫功能低下更低。

第52頁/共78頁臨床意義及應(yīng)用價(jià)值陽性結(jié)果：說明患者體內(nèi)存在針對(duì)結(jié)核桿菌的效應(yīng)T淋巴細(xì)胞。陰性結(jié)果：說明患者體內(nèi)不含有針對(duì)結(jié)核桿菌的效應(yīng)T淋巴細(xì)胞?；顒?dòng)性結(jié)核病的診斷結(jié)核潛伏感染者的診斷HIV合并結(jié)核感染的檢測區(qū)別結(jié)核感染者與BCG接種者第53頁/共78頁

ELISPOT技術(shù)優(yōu)點(diǎn)特異性好：只針對(duì)結(jié)核分枝桿菌，對(duì)絕大多數(shù)環(huán)境分枝桿菌和卡介苗無交叉反應(yīng)。靈敏度高：基本不受免疫力低下/受抑制影響，在肺外結(jié)核患者中有很高的檢出率，快速簡便。

ELISPOT技術(shù)缺點(diǎn)缺點(diǎn)是操作繁瑣，需特殊儀器設(shè)備試劑費(fèi)用昂貴第54頁/共78頁

結(jié)核病實(shí)驗(yàn)室新診斷工具世界衛(wèi)生組織建議使用分子生物學(xué)方法來檢測耐多藥結(jié)核病第55頁/共78頁分枝桿菌復(fù)合群中的耐藥基因結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群耐藥基因第56頁/共78頁

利福平：rpoB基因通常檢測rpoB基因的常見突變位置(codingfortheα-subunitoftheRNApolymerase)來判斷利福平耐藥性rpoB基因是編碼結(jié)核分枝桿菌RNA聚合酶β亞單位，90~95%的利福平耐藥由該基因突變引起，主要集中于509~533的利福平耐藥決定區(qū)，為高水平耐藥。第57頁/共78頁利福平：rpoB基因rpoB基因的常見突變位點(diǎn)及頻率從高至低依次為：531位、526位、516位、513位、533位。

GenoType?MTBDRplus檢測：耐藥突變位點(diǎn)

531、526A、526B、516第58頁/共78頁

異煙肼：katG和inhA基因檢測KatG基因(codingforthecatalaseperoxidase)及inhA基因(codingforthe

NADHenoylACPreductase)來判斷異煙肼耐藥性；katG基因：編碼觸酶-過氧化物酶，40-100%異煙肼耐藥是由該基因突變引起且為高水平耐藥。inhA基因：編碼NADH（還原型輔酶Ⅰ）烯?；鵄CP還原酶，25%異煙肼耐藥是由該基因突變引起且為低水平耐藥。

GenoType?MTBDRplus檢測：katG基因有2個(gè)耐藥突變位點(diǎn)；inhA基因有4個(gè)耐藥突變位點(diǎn)。檢測原理第59頁/共78頁三、耐多藥結(jié)核病新診斷工具（二）耐多藥結(jié)核病新診斷工具

—分子生物學(xué)診斷技術(shù)1、基因芯片（Genechip）：診斷結(jié)核感染及對(duì)異煙肼和利福平的藥物敏感性2、線性探針雜交（HainLPA）：診斷結(jié)核感染及對(duì)異煙肼和利福平的藥物敏感性3、實(shí)時(shí)PCR技術(shù)（GeneXpert）：診斷結(jié)核感染及對(duì)異煙肼和利福平的藥物敏感性4、DNA測序：診斷異煙肼和利福平的藥物敏感性60第60頁/共78頁1.基因芯片激光共焦掃描儀軟件判讀樣品制備儀雜交儀

結(jié)核分枝桿菌耐藥檢測基因芯片是基于結(jié)核分枝桿菌rpoB/katG/inhA（利福平、異煙肼）的基因位點(diǎn)突變與耐藥性相關(guān)，通過PCR擴(kuò)增和核酸雜交，檢測熒光信號(hào)的有無，判斷特定位點(diǎn)突變情況的耐藥性檢測方法。獲國家醫(yī)療器械證書和歐盟CE認(rèn)證61第61頁/共78頁1.基因芯片

基因芯片始創(chuàng)于90年代初，是近年來發(fā)展起來的進(jìn)行大規(guī)模遺傳多態(tài)性檢測的新方法。

基因芯片測定耐藥性的主要步驟為：1)制備測定耐藥性的基因芯片；2)獲得待測樣品DNA并進(jìn)行PCR擴(kuò)增和標(biāo)記；3)擴(kuò)增產(chǎn)物與芯片探針進(jìn)行雜交、顯色；4)掃描檢測、數(shù)據(jù)處理、結(jié)果判定。

目前，基因芯片技術(shù)已在結(jié)核分枝桿菌的基因分型與菌種鑒定、耐藥性測定及基因組比較分析研究中得以應(yīng)用，其中尤以耐藥性測定最為引人關(guān)注。第62頁/共78頁1.基因芯片63雜交反應(yīng)生化反應(yīng)清洗干燥掃描檢測數(shù)據(jù)分析檢測分析PCR擴(kuò)增DNA提取樣品制備第63頁/共78頁1.基因芯片應(yīng)用：耐多藥結(jié)核病篩查，國內(nèi)在4個(gè)省的4個(gè)地市級(jí)評(píng)估。64敏感性（%）特異性（%）RFP8297INH8195MDR7397第64頁/共78頁1.基因芯片標(biāo)本：涂陽痰標(biāo)本、培養(yǎng)陽性菌株時(shí)間：約8小時(shí)注冊：通過國內(nèi)SFDA注冊65第65頁/共78頁2.線性探針耐多藥結(jié)核病檢測技術(shù)

Hain-MTBDRplus

原理：是多重PCR，用4對(duì)引物包括16S鑒定、rpoB、katG和inhA基因進(jìn)行PCR擴(kuò)增，PCR擴(kuò)增后的產(chǎn)物與預(yù)先固化在膜上的27條野生和突變特異性探針雜交，檢測rpoB、katG和inhA基因突變位點(diǎn),診斷利福平和異煙肼耐藥性及分型。

在核酸探針基礎(chǔ)上發(fā)展起來的線性探針雜交技術(shù)（LiPA）已應(yīng)用于耐藥基因突變的檢測。有報(bào)道RFP耐藥菌的敏感性為94.4％，與藥敏結(jié)果的符合率為96.4％。本法快速、簡便，有一定的實(shí)用價(jià)值。缺點(diǎn)是價(jià)格太貴。66第66頁