結(jié)核病實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)新診斷技術(shù)

結(jié)核病實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)新診斷技術(shù)第1頁/共43頁發(fā)光二極管熒光顯微鏡（LED）方法液基夾層杯技術(shù)線性探針耐多藥檢測(cè)技術(shù)（HAIN）基因芯片耐多藥檢測(cè)技術(shù)（GENECHIP）TB和利福平耐藥快速分子鑒定（X-Pert）第2頁/共43頁一、發(fā)光二極管熒光顯微鏡（LED）方法適用范圍：痰涂片鏡檢所需試劑/儀器：LED顯微鏡、熒光染色液中蓋項(xiàng)目：淮安市（淮陰區(qū)、楚州區(qū)）原理：第3頁/共43頁發(fā)光二極管熒光顯微鏡（LED）鏡下視野第4頁/共43頁發(fā)光二極管熒光顯微鏡（LED）

不需要加熱玻片，步驟簡單視野比普通的顯微鏡大大2-4倍對(duì)數(shù)目少的不必使用鏡油節(jié)省人力時(shí)間，時(shí)間為普通的1/4每天可檢查至少60個(gè)涂片可幫助早期診斷肺結(jié)核–

即使菌濃度較低桿菌也有很高的靈敏度，與ZN相比陽性發(fā)現(xiàn)率平均增加10%第5頁/共43頁

不需要空調(diào)設(shè)施不需要暗室診斷性能優(yōu)于標(biāo)準(zhǔn)熒光顯微鏡壽命長（~15-20,000小時(shí)）熒光染色液有致癌作用，推薦自動(dòng)染色機(jī)。涂片需避光低溫保存。需加強(qiáng)操作人員的培訓(xùn)和質(zhì)量控制。成本低廉，價(jià)格低于現(xiàn)有的光學(xué)顯微鏡。適合縣、鄉(xiāng)級(jí)基層實(shí)驗(yàn)室使用。第6頁/共43頁二、液基夾層杯技術(shù)

適用范圍：痰涂片鏡檢十一五國家重大科技專項(xiàng)：泰興、江陰廠家：湖南天騎公司原理：集菌法第7頁/共43頁流程圖痰標(biāo)本消化滅活基片的夾層杯離心細(xì)菌附著在基片在夾層杯中直接染色取出基片于載玻片上鏡檢自動(dòng)閱片計(jì)算機(jī)報(bào)告系統(tǒng)。所需儀器設(shè)備：普通的抗酸染色液、彭氏杯（專利）、涂片機(jī)、KP21型快速干片機(jī)、抗酸桿菌自動(dòng)閱片計(jì)算機(jī)報(bào)告系統(tǒng)。第8頁/共43頁

陽性檢出率標(biāo)本及性狀液基法直涂法754份痰標(biāo)本23.50%16.80%膿性痰47.50%40.90%非膿性痰13.50%4.66%即時(shí)痰20.48%15.06%夜間痰25.6%17.01%重大專項(xiàng)：泰興、江陰地區(qū)部分實(shí)驗(yàn)結(jié)果比較第9頁/共43頁三、線性探針耐多藥檢測(cè)方法（HAIN）適用范圍：1、TB的診斷2、一線抗結(jié)核藥物耐藥診斷3、二線抗結(jié)核藥物耐藥的診斷4、目前，利福平（rpoB基因）、異煙肼（Kat基因、inhA基因）耐藥的診斷所需儀器設(shè)備：生安柜、超聲振蕩儀、PCR擴(kuò)增儀、可調(diào)溫振蕩儀第10頁/共43頁原理：基于分子生物學(xué)擴(kuò)增技術(shù)。rpoB基因突變位點(diǎn)有：4個(gè)Kat基因、inhA基因突變位點(diǎn)有：2個(gè)、4個(gè)第11頁/共43頁正確流程雜交PCRDNA提取MIX制備痰液前處理第12頁/共43頁操作步驟一、痰標(biāo)本處理去污染前處理液：氫氧化鈉+檸檬酸三鈉+N-乙酰半胱氨酸。痰標(biāo)本+等體積去污染前處理液：振蕩-離心-靜置-PBS清洗-離心-留取沉淀。二、DNA提取處理后痰標(biāo)本沉淀：95°C孵育-超聲裂解-取上清液用于PCR擴(kuò)增。三、擴(kuò)增產(chǎn)物雜交PCR產(chǎn)物變性，與探針試條上的標(biāo)記突變位點(diǎn)雜交，標(biāo)記物顯色。第13頁/共43頁四、結(jié)果判讀試劑質(zhì)控位點(diǎn)質(zhì)控第14頁/共43頁第15頁/共43頁第16頁/共43頁HAIN和目前常規(guī)藥敏方法比較比較項(xiàng)目HAIN常規(guī)藥敏方法時(shí)間1-2天2-3個(gè)月生物安全級(jí)別要求較低二級(jí)實(shí)驗(yàn)室人員培訓(xùn)2-3天2-3個(gè)月操作簡易程度簡單復(fù)雜儀器設(shè)備性價(jià)比較高--對(duì)環(huán)境潔凈度要求較高，易出現(xiàn)假陽性較高第17頁/共43頁適用范圍：1、TB復(fù)合群鑒定。2、TB菌種鑒定。3、利福平和異煙肼耐藥檢測(cè)。原理：多重PCR擴(kuò)增和反向雜交來識(shí)別。四、GENECHIP基因芯片耐多藥檢測(cè)技術(shù)第18頁/共43頁基因芯片將核酸片段有序地固化于支持物（如玻片、硅片、聚丙烯酰胺凝膠、尼龍膜等載體）的表面，組成密集二維分子排列。采用光導(dǎo)原位合成或微量點(diǎn)樣等方法。然后與已標(biāo)記的待測(cè)生物樣品中靶分子雜交。通過特定的儀器比如激光共聚焦掃描或電荷偶聯(lián)攝影像機(jī)（CCD）對(duì)雜交信號(hào)的強(qiáng)度進(jìn)行快速、并行、高效地檢測(cè)分析，從而判斷樣品中靶分子的數(shù)量。，第19頁/共43頁耐藥檢測(cè)基因芯片

基因芯片是基于特定基因位點(diǎn)突變與耐藥性的相關(guān)性，通過PCR擴(kuò)增和核酸雜交技術(shù)，檢測(cè)熒光信號(hào)的有無，判斷特定位點(diǎn)的突變情況和細(xì)菌耐藥性的檢測(cè)方法。結(jié)核分枝桿菌耐藥檢測(cè)基因芯片基于rpoB/katG/inhA的基因突變，快速檢測(cè)分離株或者痰樣本中結(jié)核桿菌耐藥性（利福平、異煙肼）。rpoB基因突變位點(diǎn)：13個(gè)位點(diǎn)。katG基因突變位點(diǎn)：2個(gè)位點(diǎn)。/inhA基因突變位點(diǎn)：2個(gè)突變位點(diǎn)。第20頁/共43頁耐藥分子診斷的基本原理第21頁/共43頁第22頁/共43頁第23頁/共43頁第24頁/共43頁第25頁/共43頁第26頁/共43頁第27頁/共43頁第28頁/共43頁第29頁/共43頁第30頁/共43頁第31頁/共43頁第32頁/共43頁操作較復(fù)雜。特異度與靈敏度不高?；蛐酒投嗨帣z測(cè)試劑已獲得歐盟體外診斷試劑證書（CE-IVD）。中國藥品食品監(jiān)督管理局的醫(yī)療器械證書?？梢宰鳛榕R床耐藥結(jié)核病臨床診斷和治療的依據(jù)。第33頁/共43頁五、結(jié)核和利福平耐藥的快速分子鑒定（x-pert）適用范圍：1、TB復(fù)合群鑒定。2、利福平耐藥檢測(cè)。原理：多重PCR擴(kuò)增和反向雜交來識(shí)別?？梢栽?小時(shí)出報(bào)告結(jié)果。第34頁/共43頁實(shí)驗(yàn)室方法痰標(biāo)本的前處理：同前方法。試劑加入去污處理的痰標(biāo)本中。室溫下手工晃動(dòng)密閉痰盒，15分鐘內(nèi)2次，然后取2ml滅活后的物質(zhì)加入檢測(cè)盒(其內(nèi)含相當(dāng)于0.7ml未處理痰液或0.5ml已去污處理的痰液)，檢測(cè)盒放入檢測(cè)平臺(tái)。MTB/RIF檢測(cè)系統(tǒng)直接輸出電子結(jié)果。第35頁/共43頁實(shí)驗(yàn)室方法陽性培養(yǎng)物經(jīng)MPT64抗原檢測(cè)以確定其是否屬于結(jié)核分枝桿菌菌屬。L-J培養(yǎng)基比例法藥敏/MIGT快速藥敏法。常規(guī)的DNA核酸擴(kuò)增hain方法檢測(cè)耐藥第36頁/共43頁實(shí)驗(yàn)室方法試劑分別按2:1和3:1加入未經(jīng)處理的痰標(biāo)本和去污處理的痰標(biāo)本中。室溫下手工晃動(dòng)密閉痰盒，15分鐘內(nèi)2次，然后取2ml滅活后的物質(zhì)加入檢測(cè)盒(其內(nèi)含相當(dāng)于0.7ml未處理痰液或0.5ml已去污處理的痰液)，檢測(cè)盒放入檢測(cè)平臺(tái)。MTB/RIF檢測(cè)系統(tǒng)直接輸出電子結(jié)果。第37頁/共43頁第38頁/共43頁

靈敏度特異度培陽97.60%-涂陽培陽99.80%-涂陰培陽90.20%-檢測(cè)一份標(biāo)本72.50%99.20%檢測(cè)兩份標(biāo)本85.10%98.60%檢測(cè)三份標(biāo)本90.20%98.10%檢測(cè)HIV合并感染93.90%-檢測(cè)HIVTB98.40%-與HAIN比較無差異無差異與PCR比較高無差異第39頁/共43頁

靈敏度特異度211例利福平耐藥99.10%506例利福平敏感

100%第40頁/共43頁討論該檢測(cè)方法適用于低收入國家精確診斷肺結(jié)核并能夠進(jìn)行福平耐藥篩選的快速檢測(cè)方法。以培養(yǎng)方法作金標(biāo)準(zhǔn)，該方法可以檢測(cè)出97%以上的肺結(jié)核患者，包括90%的涂陰病人。南非有60%-80%的人感染HIV，鑒于合并HIV+TB陽性出率較低，尤其HIV+TB-，MTB/RIF有較高的檢出率。第41