生物化學(xué)-DNA的生物合成

第十六章

DNA的生物合成

中心法則半保留復(fù)制DNA聚合酶岡崎片段KeyTerms

B-DNAhelixA-DNAhelixmajorgrooveminorgrooveZ-DNAhelixDNApolymerasetemplateprimerexonucleasehelicasesupercoillinkingnumber(Lk)topoisomertwist(Tw)writhe(Wr)topoisomeraseoriginofreplicationprimasereplicationforkOkazakifragmentlaggingstrandleadingstandDNAligaseprocessivitycellcycletelomeretelomeraserecombinaseHollidayjunctionrecombinationsynapsetransitiontransversionmutagenTheDoubleHelixIsStabilizedbyHydrogenBondsandHydrophobicInteractionsTheexistenceofspecificbase-pairinginteractionswasdiscoveredinthecourseofstudiesdirectedatdeterminingthethree-dimensionalstructureofDNA.MauriceWilkinsandRosalindFranklinobtainedx-raydiffractionphotographsoffibersofDNAThecharacteristicsofthesediffractionpatternsindicatedthatDNAwasformedoftwochainsthatwoundinaregularhelicalstructure.Fromtheseandotherdata,JamesWatsonandFrancisCrickinferredastructuralmodelforDNAthataccountedforthediffractionpatternandwasalsothesourceofsomeremarkableinsightsintothefunctionalpropertiesofnucleicacids.ThefeaturesoftheWatson-CrickmodelofDNAdeducedfromthediffractionpatternsare:

1.Twohelicalpolynucleotidechainsarecoiledaroundacommonaxis.Thechainsruninoppositedirections.2.Thesugar-phosphatebackbonesareontheoutsideand,therefore,thepurineandpyrimidinebaseslieontheinsideofthehelix.3.Thebasesarenearlyperpendiculartothehelixaxis,andadjacentbasesareseparatedby3.4?.Thehelicalstructurerepeatsevery34?,sothereare10bases(=34?perrepeat/3.4?perbase)perturnofhelix.Thereisarotationof36degreesperbase(360degreesperfullturn/10basesperturn).4.Thediameterofthehelixis20?.X-RayDiffractionPhotographofaHydratedDNAFiber.Thecentralcrossisdiagnosticofahelical

structure.Thestrongarcsonthemeridianarisefromthestackofnucleotidebases,whichare3.4?apart.[Courtesyof

Dr.MauriceWilkins.]

MajorandMinorGroovesinB-FormDNA.Themajorgrooveisdepictedinorange,andtheminor

grooveisdepictedinyellow.Thecarbonatomsofthebackboneareshowninwhite.Watson-CrickModelofDouble-HelicalDNA.

Onepolynucleotidechainisshowninblueandtheotherin

red.Thepurineandpyrimidinebasesareshowninlightercolorsthanthesugar-phosphatebackbone.(A)Axialview.

Thestructurerepeatsalongthehelicalaxis(vertical)atintervalsof34?,whichcorrespondsto10nucleotidesoneach

chain.(B)Radialview,lookingdownthehelixaxis.StructuresoftheBasePairs

ProposedbyWatsonandCrick.BasecompositionsexperimentallydeterminedforavarietyoforganismsSpeciesA:TG:CA:GHumanbeing1.001.001.56Salmon1.021.021.43Wheat1.000.971.22Yeast1.031.021.67Escherichiacoli1.090.991.05Serratia

0.950.860.70Marcescens

一

中心法則一中心法則大多數(shù)生物的遺傳物質(zhì)DNA和某些病毒的遺傳物質(zhì)RNA，通過復(fù)制把親代的遺傳信息傳遞到子代。DNA中的遺傳信息還可以傳遞到RNA中（轉(zhuǎn)錄），并通過RNA再傳遞到蛋白質(zhì)中（翻譯）。在個別生物中遺傳信息可以由RNA傳遞到DNA，即反轉(zhuǎn)錄.二半保留復(fù)制

（Semiconservativereplication）

在復(fù)制開始時親代DNA雙鏈間的氫鍵斷裂；雙鏈分開，然后以第一條鏈為模板，分別復(fù)制出與其互補的子代鏈，從而使一個DNA分子轉(zhuǎn)變?yōu)榕c之完全相同的兩個DNA分子?？梢姲凑者@種方式復(fù)制出來的每個子代雙鏈DNA分子中，都含有一半來自親代的舊鏈和一條新合成的DNA鏈，所以把這種復(fù)制方式稱為半保留復(fù)制。DNA的半保留復(fù)制的發(fā)現(xiàn)

Watson&Crick發(fā)表DNA雙螺旋結(jié)構(gòu)后不久由Meselson&

Stahl1957年發(fā)表的精巧實驗。含重氮的氯化銨培養(yǎng)基中繁殖14代（繁殖一代約需30分）轉(zhuǎn)入含輕氮的氯化銨培養(yǎng)基中培養(yǎng)，氯化銫CsCl密度梯度離心。

氯化銫CsCl密度梯度離心每立方厘米1.650g（離心管頂部）每立方厘米1.800g（離心管底部）全重DNA（N15）pH等于7時密度為每立方厘米1.710g，全輕DNA（N14）

pH等于7時密度為每立方厘米1.695g，其他DNA介于這兩個密度值之間。實驗結(jié)果含重氮的氯化銨培養(yǎng)基中繁殖14代時是每立方厘米1.710g，離心區(qū)帶靠近管口，只有一個區(qū)帶。含輕氮的氯化銨培養(yǎng)基中準確復(fù)制一代后離心出現(xiàn)新的區(qū)帶，每立方厘米1.703g，只有一個區(qū)帶。繼續(xù)培養(yǎng)多代出現(xiàn)新的區(qū)帶，每立方厘米1.695g，隨著代數(shù)的增加而增強。有二個區(qū)帶。DiagramofSemiconservativeReplication.ParentalDNAisshowninblueandnewlysynthesizedDNA

inred.[AfterM.MeselsonandF.W.Stahl.Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.44(1958):671.]三DNA聚合酶DNA復(fù)制的關(guān)鍵酶底物；dATP,dGTP,dCTP,dTTP鎂離子參與引物摸扳DNA5′→3′方向聚合合成DNA

具有5′→3′3′→5′方向的外切活力DNAPolymeraseStructure.ThefirstDNApolymerasestructuredeterminedwasthatofafragmentofE.coliDNApolymeraseIcalledtheKlenowfragment.LikeotherDNApolymerases,thepolymeraseunitresemblesarighthandwithfingers(blue),palm(yellow),andthumb(red).TheKlenowfragmentalsoincludesanexonucleasedomain.酶的結(jié)構(gòu)中有很深的裂縫，足以容納B-DNA的一部分，并成為酶活性中心，復(fù)制過程中裂縫完全封閉。DNAPolymerasesRequireaTemplateandaPrimer大腸桿菌DNA聚合酶DNA聚合酶有三種(真核生物有6種)修復(fù)DNA的酶是Ⅰ型（單鏈多肽，10-20核苷酸/秒，具有5′→3′3′→5′方向的外切活力)★生理功能：修復(fù)DNA的損傷、DNA復(fù)制過程中切除RNA引物。Ⅱ型作用可能參與DNA的修復(fù)，無5′→3′外切活力合成DNA鏈的聚合酶是Ⅲ型(1000核苷酸/秒，

無5′→3′外切活力),加工能力極強，催化能力強，準確性高，DNA聚合酶Ⅲ型發(fā)揮作用時是二聚體，每個單體由10個不同亞基組成PolymerizationReactionCatalyzedbyDNAPolymerases.

DNAReplication.TheformationofaphosphodiesterbridgeiscatalyzedbyDNApolymerases.

DNA聚合酶Ⅰ型

1957年ArthurKornberg發(fā)現(xiàn)（1959年獲諾貝爾獎）100公斤細菌中得到0.5克純酶。故稱Kornberg酶。全酶:單鏈；109kD；含1個Zn；蛋白酶處理可分解為1大和1小兩部分。大片段（C端）：具有5′→3′聚合活力

3′→5′外切活力小片段（N端）：具有5′→3′

外切活力DNA聚合酶III:四DNA連接酶（Ligase）1967年幾個實驗室同時發(fā)現(xiàn)了DNA連接酶該酶催化兩條DNA鏈之間形成磷酸二酯鍵。DNA雙鏈中缺口處5‘磷酸和3’羥基共價連接，酶要求3′端有自由羥基，5′端有一磷酸基團。動物需要ATP（形成酶-AMP復(fù)合體）大腸桿菌需要NADH酶-AMP復(fù)合體3′端有自由羥基5′端有一磷酸基團?！铩镂褰忾_DNA螺旋有關(guān)的

酶和蛋白質(zhì)Rep

解鏈酶HDP

螺旋降穩(wěn)蛋白（單鏈結(jié)合蛋白SSB）拓撲異構(gòu)酶引物酶TheSeparationofDNAStrandsRequiresSpecificHelicasesandATP

Hydrolysis解鏈（旋）酶（Helicase）

Helicase

又稱Rep蛋白。DnaB

蛋白。能在復(fù)制叉處活躍的解開親代DNA分子的雙股螺旋鏈。每解開一對堿基需水解兩個ATP分子。DnaB

蛋白主要在復(fù)制起始體中起作用。HelicaseStructure.Thebacterialhelicase

PcrAcomprisesfourdomains:A1,A2,B1,andB2.TheA1domainincludesaP-loopNTPasefold,whereastheB1domainhasasimilaroverallstructurebutlacksaP-loopanddoesnotbindnucleotides.Single-strandedDNAbindstotheA1andB1domainsneartheinterfaceswithdomainsA2andB2.HelicaseMechanism.Initially,bothdomainsA1andB1ofPcrAbindsingle-strandedDNA.Onbinding

ofATP,thecleftbetweenthesedomainsclosesanddomainA1slidesalongtheDNA.OnATPhydrolysis,thecleft

opensup,pullingtheDNAfromdomainB1towarddomainA1.Asthisprocessisrepeated,double-strandedDNAis

unwound.

III.SynthesizingtheMoleculesofLife27.DNAReplication,Recombination,andRepair27.2.DNAPolymerasesRequireaTemplateandaPrimerHelicasesconstitutealargeanddiverseclassofenzymes.Someoftheseenzymesmoveina5→3direction,whereasothersunwindRNAratherthanDNAandparticipateinprocessessuchasRNAsplicingandtheinitiationofmRNAtranslation.AcomparisonoftheaminoacidsequencesofhundredsoftheseenzymesrevealssevenregionsofstrikingconservationMappingtheseregionsontothePcrAstructureshowsthattheylinetheATPbindingsiteandthecleftbetweenthetwodomains,consistentwiththenotionthatotherhelicasesundergoconformationalchangesanalogoustothosefoundinPcrA.However,whereasPcrAappearstofunctionasamonomer,othermembersofthehelicaseclassfunctionasoligomers.ThehexamericstructuresofoneimportantgrouparesimilartothatoftheF1componentofATPsynthase

，suggestingpotentialmechanisticsimilarities.ConservedResiduesamongHelicases.Acomparisonoftheaminoacidsequencesofhundredsof

helicasesrevealedsevenregionsofstrongsequenceconservation(shownincolor).Whenmappedontothe

structureofPcrA,theseconservedregionsliealongtheinterfacebetweentheA1andB1domainsandalongthe

ATPbindingsurface.復(fù)制叉

DNA雙螺旋解開，分別以其中一條鏈為模板開始DNA新鏈的合成。此時形成一種動態(tài)的Y字形結(jié)構(gòu)，稱為復(fù)制叉。實驗證明細菌復(fù)制從起點開始雙向復(fù)制，如果是環(huán)形DNA分子，兩個復(fù)制叉在復(fù)制起點的對面會合。復(fù)制叉HDP螺旋降穩(wěn)蛋白（單鏈結(jié)合蛋白SSB）

螺旋降穩(wěn)蛋白（HDP），又稱單鏈結(jié)合蛋白（SSB）。這一類蛋白結(jié)合到由解鏈酶解鏈作用而形成的單鏈DNA上，使其穩(wěn)定下來。單鏈結(jié)合蛋白SSB引發(fā)體解鏈酶Double-StrandedDNACanWrapAroundItselftoFormSupercoiledStructuresTheseparationofthetwostrandsofDNAinreplicationrequiresthelocalunwindingofthedoublehelix.ThislocalunwindingmustleadeithertotheoverwindingofsurroundingregionsofDNAortosupercoiling.Topreventthestraininducedbyoverwinding,aspecializedsetofenzymesispresenttointroducesupercoilsthatfavorstrandseparation.Topoisomers.AnelectronmicrographshowingnegativelysupercoiledandrelaxedDNA.[CourtesyofDr.JackGriffith.]拓撲異構(gòu)酶

（DNATopoisomerase）a.它的作用是將松馳型環(huán)狀雙鏈DNA分子切開一條鏈，并水解ATP供能，引入負的超螺旋應(yīng)力，而后封口。使松馳型閉環(huán)雙鏈DNA變成具有負應(yīng)力的超螺旋分子（拓撲異構(gòu)酶ⅱ型）。b.無ATP時它具有解鏈酶的作用，通過切口，再封口，放出超螺旋應(yīng)力(拓撲異構(gòu)酶ⅰ型)。這兩種作用都有利于親代DNA雙股鏈在復(fù)制叉處分開。切口，再封口，放出超螺旋應(yīng)力Topoisomers.AnelectronmicrographshowingnegativelysupercoiledandrelaxedDNA.[Courtesyof

Dr.JackGriffith.]StructureofaTopoisomerase.Thestructureofacomplexbetweenafragmentofhumantopoisomerase

IandDNA.TopoisomeraseIIMechanism.TopoisomeraseIIfirstbindsoneDNAduplextermedtheG(forgate)segment.ThebindingofATPtothetwoN-terminaldomainsbringsthesetwodomainstogether.Thisconformational

changeleadstothecleavageofbothstrandsoftheGsegmentandthebindingofanadditionalDNAduplex,theTsegment.ThisTsegmentthenmovesthroughthebreakintheGsegmentandoutthebottomoftheenzyme.ThehydrolysisofATPresetstheenzymewiththeGsegmentstillbound.引物酶（Primase）

引物酶又稱DnaG蛋白。它的作用是合成RNA引物（primer）。但是它不能直接結(jié)合到復(fù)制叉上。必須在SSB

結(jié)合的某一部位,DnaB蛋白取代SSB。在DnaB蛋白與DNA結(jié)合之后，引物酶可以與DnaB蛋白結(jié)合，并合成RNA引物?！镆驗镈NA聚合酶不能直接合成DNA，需要引物提供游離的3′羥基。六DNA的復(fù)制DNA復(fù)制包括起始，DNA鏈的延長和終止復(fù)制起點（Originofreplication）★大腸桿菌環(huán)狀染色體DNA中只有

一個復(fù)制起點?！镎婧松锩恳粭l染色體DNA中，有許多個復(fù)制起點。復(fù)制從起點開始，而后向兩個相反方向伸展進行DNA復(fù)制。DNAReplicationofBothStrandsProceedsRapidlyfromSpecificStartSites★復(fù)制起點★復(fù)制終點復(fù)制叉（Replicationfork）

DNA雙螺旋解開，分別以其中一條鏈為模板開始DNA新鏈的合成。此時形成一種動態(tài)的Y字形結(jié)構(gòu)，稱為復(fù)制叉。實驗證明細菌復(fù)制從起點開始雙向復(fù)制，如果是環(huán)形DNA分子，兩個復(fù)制叉在復(fù)制起點的對面會合。復(fù)制叉復(fù)制叉復(fù)制子DNA復(fù)制的功能單位稱為復(fù)制子，一個復(fù)制子只含一個專一復(fù)制起點和復(fù)制結(jié)束的終點。一個完整的復(fù)制子在一個細胞周期中只復(fù)制一次。細菌病毒和線粒體只有單一復(fù)制子。真核生物染色體則有多個復(fù)制子組成。（一）復(fù)制的起始大腸桿菌復(fù)制起點稱為為oriC,245bp構(gòu)成其序列和控制元件在細菌復(fù)制起點中十分保守關(guān)鍵序列含有；三個13bp的重復(fù)序列四個9bp的重復(fù)序列★復(fù)制終止位點★復(fù)制起點大約20—40個DnaA

蛋白各自帶一個ATP結(jié)合在四個9bp的序列上(位點)，DNA纏繞其上，形成復(fù)合物。HU蛋白與DNA結(jié)合，促使雙鏈DNA彎曲。受其影響三個富含AT的13bp序列被變性，稱為開鏈復(fù)合物。

DnaB在DnaC的協(xié)助下與解鏈區(qū)結(jié)合。DnaB借助水解ATP產(chǎn)生的能量，5‘→3’方向解開DNA的雙鏈。DNA起始復(fù)合體的形成DNA起始復(fù)合體E.coliDNA復(fù)制起始需要的蛋白（至少8種以上）

前導(dǎo)鏈的合成后隨鏈合成

岡崎片段半不連續(xù)復(fù)制（二）DNA鏈的延長DNA鏈的延長

延長包括新DNA鏈的延伸和復(fù)制叉的移動過程。復(fù)制叉處DNA解鏈酶（helicase）解開親代DNA鏈，DNA拓撲酶消除由解螺旋所產(chǎn)生的拓撲應(yīng)力，SSB蛋白穩(wěn)定分開的單鏈。引物酶合成RNA引物。前導(dǎo)鏈和后隨鏈合成過程完全不同。前導(dǎo)鏈合成前導(dǎo)鏈合成時，引物酶和DNA聚合酶共同作用。開始在復(fù)制起點合成一個10~66個核苷酸RNA引物，然后由DNA聚合酶Ⅲ將脫氧核苷加在引物上，一旦合成開始，前導(dǎo)鏈的合成就連續(xù)進行，并與復(fù)制叉移動保持同步，每一DNA片段都有自己的RNA引物。前導(dǎo)鏈后隨鏈模板鏈模板鏈BothstrandsofparentalDNAserveastemplatesforthesynthesisofnewDNA.ThesiteofDNAsynthesisiscalledthereplicationforkbecausethecomplexformedbythenewlysynthesizeddaughterstrandsarisingfromtheparentalduplexresemblesatwo-prongedfork.Recallthatthetwostrandsareantiparallel;thatis,theyruninoppositedirections.AsshowninFigure27.3,bothdaughterstrandsappeartogrowinthesamedirectiononcursoryexamination.However,allknownDNApolymerasessynthesizeDNAinthe5→3directionbutnotinthe3→5direction.HowthendoesoneofthedaughterDNAstrandsappeartogrowinthe3→5direction?ThisdilemmawasresolvedbyReijiOkazaki,whofoundthatasignificantproportionofnewlysynthesizedDNAexistsassmallfragments.OneStrandofDNAIsMadeContinuously,WhereastheOtherStrandIsSynthesizedinFragmentsTheseunitsofaboutathousandnucleotides(calledOkazakifragments)arepresentbrieflyinthevicinityofthereplicationforkAsreplicationproceeds,thesefragmentsbecomecovalentlyjoinedhroughtheactionofDNAligasetoformoneofthedaughterstrands.Theothernewstrandissynthesizedcontinuously.ThestrandformedfromOkazakifragmentsistermedthelaggingstrand,whereastheonesynthesizedwithoutinterruptionistheleadingstrand.BoththeOkazakifragmentsandtheleadingstrandaresynthesizedinthe5→3direction.Thediscontinuousassemblyofthelaggingstrandenables5→3polymerizationatthenucleotideleveltogiverisetooverallgrowthinthe3→5direction.ReplicationFork.SchematicrepresentationoftheenzymaticeventsatareplicationforkinE.coli.Enzymesshadedinyellowcatalyzechaininitiation,elongation,andligation.Thewavylinesonthelaggingstrand

denoteRNAprimers.[AfterA.KornbergandT.Baker,DNAReplication,2ded.(W.H.FreemanandCompany,1992).]后隨鏈的合成后隨鏈的合成是一個較為復(fù)雜的過程，是與復(fù)制移動方向相反的方向不連續(xù)合成。二聚體DNA聚合酶Ⅲ和一些專一的蛋白質(zhì)參與這一合成過程。聚合酶Ⅲ的一個單體、催化后隨鏈的復(fù)制，另一個催化前導(dǎo)鏈的復(fù)制。后隨鏈模板繞成一個環(huán)，這樣兩條親代鏈就可以同一方向通過聚合酶。引物酶與后隨鏈模板上的預(yù)引物蛋白形成引發(fā)體。引發(fā)體催化RNA引物的合成。引發(fā)體以5?→3?方向和復(fù)制叉移動保持同步，沿著后隨鏈模板移動，由于它的移動，引發(fā)體促使引物酶間斷地合成一段短的（10-60殘基）RNA，然后DNA聚合酶Ⅲ在引物上延伸DNA。合成一些短的DNA片段，稱為岡崎（Okazaki）片段。引物酶合成方向與DNA聚合酶Ⅲ合成方向相反。當一段新的岡崎片段合成后DNA聚合酶Ⅰ利用5?→3?外切酶活性將RNA引物切除，又用同一酶再合成一段DNA作為替換，留下的缺口由DNA連接在封口。原核生物聚合酶Ⅲ是二聚體。一個單體、催化后隨鏈的復(fù)制，另一個催化前導(dǎo)鏈的復(fù)制。后隨鏈模板繞成一個環(huán)，這樣兩條親代鏈就可以同一方向通過聚合酶。岡崎（Okazaki）片斷

由岡崎令治提出（Ogawa.T&Okazaki.T,1980）。他們發(fā)現(xiàn)新合成的DNA以小片段，短時間存在于復(fù)制叉附近。岡崎片斷約1000-2000個左右核苷酸。

真核生物中約100-200個核苷酸。前導(dǎo)鏈后隨鏈模板鏈模板鏈引發(fā)體（Primosome）RecallthatallknownDNApolimerases

requieaprimerwithafree3′-hadroxylgroupforDNAsynthsis.Howisthisprimerformed?AnimportantcluecamefromtheobservationthatRNAsynthsisisessentialfortheDNAsysthsis.Infact,RNAprimesthesynthsisofDNA.AspecializedRNApolimerasecalledprimasejoinsthepreprimingcomplexinamultisubunitassemblycalledtheprimosome.P760（大生化）★引發(fā)體★★★★★★★

復(fù)制的終止終止位點位于前一個岡崎片段的起始位點引物切除（DNA聚合酶I）另一個岡崎片段3’OH處合成新DNA（DNA聚合酶I）DNA連接酶連接缺口引物切除引物合成DNA片段連接酶連接缺口前導(dǎo)鏈

后隨鏈岡崎片段的加工（三）復(fù)制終止

復(fù)制終止是在一個特殊的終止位點。有一種蛋白質(zhì)稱為終止利用基質(zhì)（TUS）和終止位點結(jié)合，抑制復(fù)制體的解旋酶的活性，防止復(fù)制叉通過終止位點。在環(huán)形E.coli染色體的雙向復(fù)制、復(fù)制終止位點是在兩個復(fù)制叉會合處。即在復(fù)制起點的對面的終止點。復(fù)制終止位點七、DNA復(fù)制具有高度的真實性1．具有3?→5?外切酶活性的DNA聚合酶是保證DNA復(fù)制真實性的主要因素。酶可以切除參入的錯誤堿基。DNA聚合酶Ⅰ和Ⅲ具有這種糾正功能。2．復(fù)制體的組成復(fù)雜性是第二個主要因素。復(fù)制體是由大量的各種不同的酶的蛋白質(zhì)組成的聚集物，這些成分在性質(zhì)和活性上相互依賴。這樣形成的網(wǎng)絡(luò)的復(fù)雜性有助于保證所有的反應(yīng)過程都是以極高的精確性進行。

3．增強DNA復(fù)制的精確性是在復(fù)制時使用RNA引物而不是DNA引物。復(fù)制的早期階段最易發(fā)生堿基參入錯誤。復(fù)制起始是用核糖核苷酸，而不是脫氧核苷酸，這樣很有好處。它可通過DNA聚合酶Ⅰ的5?→3?外切活性和5?→3?聚合酶活性切除RNA引物，并以脫氧核苷酸替代，從而可以消除最初階段所出現(xiàn)的錯誤。4.具有多種修復(fù)被損壞的DNA的機制。光恢復(fù)、切除、重組修復(fù)、錯配修復(fù)、SOS修復(fù)等。

八、真核細胞DNA的復(fù)制與原核生物DNA復(fù)制的基本機制一致差別：

a.真核生物DNA復(fù)制前導(dǎo)鏈和后隨鏈合成的酶不同

b.真核生物引物酶與聚合酶相連，原核中引物酶與解旋酶相連

c.真核復(fù)制是多起點,原核生物為單一起點十一、DNA復(fù)制后的加工復(fù)制后DNA需要再加工，包含兩組反應(yīng)

一組是起修飾作用的甲基化酶催化堿基甲基化，以防止DNA被限制性內(nèi)切酶（Restrictionendonucleases）降解。另一組反應(yīng)是由多種不同的DNA修復(fù)機制組成。

十二

逆轉(zhuǎn)錄

RNA指導(dǎo)下的DNA合成cDNA反轉(zhuǎn)錄1962年HowardTemin提出假設(shè)。他認為致癌RNA病毒含有一種能將RNA轉(zhuǎn)錄成DNA的酶。1970年Temin和DavidBultimore證實了致癌RNA病毒中有這種酶的存在，因此Temin1975年獲諾貝爾獎。一、反轉(zhuǎn)錄酶：反轉(zhuǎn)錄酶即可以利用DNA又可以利用RNA作為模板合成與之互補和反平行的DNA鏈，像其他DNA聚合酶一樣，反轉(zhuǎn)錄酶以5?→3?方向合成DNA，該酶需要一個專一的tRNA分子作為引物和提供啟動合成所需的3?-OH末端。反轉(zhuǎn)錄酶有兩個結(jié)構(gòu)域：一個催化DNA合成（即可使用RNA又可使用DNA作為模板），另一個催化RNA水解。二、反轉(zhuǎn)錄作用反轉(zhuǎn)錄酶催化下列三類效應(yīng)。1．首先以自身的RNA為模板合成與RNA互補的DNA鏈。（cDNA）2．該酶有核酸酶活性，專一催化RNA-DNA雜交鏈中RNA降解。3．以上述cDNA為模板合成與之互補的DNA鏈，形成雙鏈DNA。合成的雙鏈病毒DNA參入到被感染的真核細胞雙鏈DNA基因組中，宿主細胞基因組因此而發(fā)生改變，正常的細胞轉(zhuǎn)變?yōu)榘┘毎?。細胞分裂后病毒DNA被轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生病毒RNA，病毒RNA翻譯產(chǎn)生病毒蛋白。病毒RNA和病毒蛋白結(jié)合形成新的病毒顆粒并與細胞膜結(jié)合，最后從細胞中釋放出來，侵入另一個正常細胞。FlowofInformationfromRNAtoDNAinRetroviruses.TheRNAgenomeofaretrovirusisconverted

intoDNAbyreversetranscriptase,anenzymebroughtintothecellbytheinfectingvirusparticle.Reversetranscriptase

catalyzesthesynthesisofacomplementaryDNAstrand,thedigestionoftheRNA,andthesubsequentsynthesisofthe

DNAstrand.十三DNA的突變突變(Mutation）定義點突變（轉(zhuǎn)換和巔換）插入或缺失突變（移碼突變）誘發(fā)突變及誘變劑

堿基類似物，堿基的修飾劑，嵌入

染料，紫外線等十四DNA損傷與修復(fù)

物理，化學(xué)，紫外線等因素造成DNA的損傷。生物體在進化過程中獲得的一種保護功能，使損傷的DNA得到修復(fù)?！?/p>

DNA的修復(fù)的方式錯配修復(fù)光修復(fù)切除修復(fù)（復(fù)制前修復(fù)）重組修復(fù)（復(fù)制后修復(fù)）應(yīng)急反應(yīng)和易錯修復(fù)（SOS）★錯配修復(fù)(MismatchRepair)DNA合成后親代鏈充分甲基化，因為甲基化滯后于DNA合成。新的子代鏈在合成的大部分時間里，保持著非甲基化。被識別的非甲基化序列作為修復(fù)的目標鏈舊鏈大腸桿菌的錯配修復(fù)系統(tǒng)

☆大腸桿菌參與錯配修復(fù)系統(tǒng)的蛋白質(zhì)至少12種。☆

MutS二聚體識別并結(jié)合錯配堿基部位→MutL與MutS二聚體結(jié)合→復(fù)合體沿DNA雙鏈向兩個方向移動，直至遇到GATC，ATP水解供能。MutH

核酸內(nèi)切酶與復(fù)合體結(jié)合，將未甲基化的GATC從5‘段切開?！罴谆腉ATC是舊鏈。未甲基化的GATC是新鏈。限制性核酸內(nèi)切酶限制性核酸內(nèi)切酶能識別DNA雙螺旋中特異的堿基順序。多種原核生物中都含有限制性核酸內(nèi)切酶其生物功能是裂解外來DNA分子，細胞本身的ＤＮＡ不受降解。因為該酶的識別位點都甲基化。識別４－６個堿基對組成呢公的特異序列，并使此區(qū)域中個鏈的一個磷酸二酯鍵水解。5′G↓GATCC３′

BamH1

３′CCTAG↑G5′5′G↓AATTC３′EcoR1

３′CTTAA↑G5′5′GG↓CC３′Haeⅲ

３′CC↑GG5′★切除修復(fù)(Excisionrepair)

切除修復(fù)(Excisionrepair)需要DNA復(fù)制酶。核酸內(nèi)切酶切開DNA中的胸腺嘧啶二聚體的5′端

↓3′端正常堿基填充缺口（DNA聚合酶ⅰ型）

↓

5′→3′外切活力切除核苷酸（DNA聚合酶ⅰ型）

↓DNA連接酶連接原有的和新合成的DNA★切除修復(fù)(Excisionrepair)

★重組修復(fù)★光修復(fù)細菌含有光裂合酶（Photplyase）光裂合酶酶通過吸收可見光（波長300-500nm）而被激活，并催化兩個相鄰米頂尖級的C-CT-T鍵斷裂，使環(huán)丁而嘧啶結(jié)構(gòu)恢復(fù)正常。當細菌受到致死性突變劑的作用而產(chǎn)生的應(yīng)激反應(yīng)。DNA損傷嚴重時停止正常DNA復(fù)制，啟動應(yīng)激反應(yīng)，導(dǎo)致細胞內(nèi)多種蛋白質(zhì)水平有規(guī)律的增加，稱為SOS反應(yīng)。誘導(dǎo)的蛋白質(zhì)是專一復(fù)制系統(tǒng)的成分，

由于在DNA聚合酶ⅲ被阻斷的情況下復(fù)制，損壞的部位正確配對是不可能的。復(fù)制出的DNA是易錯修復(fù)（Error-pronerepair

）。突變的細胞活下來比細胞死亡更有利。并通過幾種酶的協(xié)同誘導(dǎo)作用修復(fù)損傷的DNA?！?/p>

SOS修復(fù)（SOSrepair

）誘導(dǎo)產(chǎn)生校對功能差的DNA聚合酶Summary

DNACanAssumeaVarietyofStructuralFormsDNAisastructurallydynamicmoleculethatcanexistinavarietyofhelicalforms:A-DNA,B-DNA(theclassicWatson-Crickhelix),andZ-DNA.DNAcanbebent,kinked,andunwound.InA-,B-,andZ-DNA,twoantiparallelchainsareheldtogetherbyWatson-Crickbasepairsandstackinginteractionsbetweenbasesinthesamestrand.Thesugarphosphatebackboneisontheoutside,andthebasesareinsidethedoublehelix.A-andB-DNAareright-handedhelices.InB-DNA,thebasepairsarenearlyperpendiculartothehelixaxis.InA-DNA,thebasesaretiltedratherthanperpendicular.AnimportantstructuralfeatureoftheBhelixisthepresenceofmajorandminorgrooves,whichdisplaydifferentpotentialhydrogen-bondacceptorsanddonorsaccordingtothebasesequence.X-rayanalysisofasinglecrystalofB-DNArevealsthatthestructureismuchmorevariablethanwasoriginallyimagined.DehydrationinducesthetransitionfromB-toA-DNA.Z-DNAisaleft-handedhelix.ItcanbeformedinregionsofDNAinwhichpurinesalternatewithpyrimidines,asinCGCGorCACA.MostoftheDNAinacellisintheB-form.DNAPolymerasesRequireaTemplateandaPrimer

DNApolymerasesaretemplate-directedenzymesthatcatalyzetheformationofphosphodiesterbondsbythe3–hydroxylgroup'snucleophilicattackontheinnermostphosphorusatomofadeoxyribonucleoside5-triphosphate.Theycannotstartchainsdenovo;aprimerwithafree3-hydroxylgroupisrequired.DNApolymerasesfromavarietyofsourceshaveimportantstructuralfeaturesincommonaswellasacatalyticmechanismrequiringthepresenceoftwometalions.ManyDNApolymerasesproofreadthenascentproduct;their3→5

exonucleaseactivitypotentiallyeditstheoutcomeofeachpolymerizationstep.Amispairednucleotideisexcisedbeforethenextstepproceeds.InE.coli,DNApolymeraseIrepairsDNAandparticipatesinreplication.Fidelityisfurtherenhancedbyaninducedfitthatresultsinacatalyticallyactiveconformationonlywhenthecomplexofenzyme,DNA,andcorrectdNTPisformed.HelicasespreparethewayforDNAreplicationbyusingATPhydrolysistoseparatethestrandsofthedoublehelix.Double-StrandedDNACanWrapAroundItselftoFormSupercoiledStructures

AkeytopologicalpropertyofDNAisitslinkingnumber(Lk),whichisdefinedasthenumberoftimesonestrandofDNAwindsaroundtheotherintheright-handdirectionwhentheDNAaxisisconstrainedtolieinaplane.MoleculesdifferinginlinkingnumberaretopoisomersofoneanotherandcanbeinterconvertedonlybycuttingoneorbothDNAstrands;thesereactionsarecatalyzedbytopoisomerases.Changesinlinkingnumbergenerallyleadtochangesinboththenumberofturnsofdoublehelixandthenumberofturnsofsuperhelix.

TopoisomeraseII(DNAgyrase)catalyzestheATP-drivenintroductionofnegativesupercoils,whichleadstothecompactionofDNAandrendersitmoresusceptibletounwinding.SupercoiledDNAisrelaxedbytopoisomeraseI.TheunwindingofDNAatthereplicationforkiscatalyzedbyanATP-drivenhelicase.DNAReplicationofBothStrandsProceedsRapidlyfromSpecificStartSites

DNAreplicationinE.colistartsatauniqueorigin(oriC)andproceedssequentiallyinoppositedirections.Morethan20proteinsarerequiredforreplication.AnATP-drivenhelicaseunwindstheoriC

regiontocreateareplicationfork.Atthisfork,bothstrandsofparentalDNAserveastemplatesforthesynthesisofnewDNA.AshortstretchofRNAformedbyprimase,anRNApolymerase,primesDNAsynthesis.OnestrandofDNA(theleadingstrand)issynthesizedcontinuously,whereastheotherstrand(thelaggingstrand)issynthesizeddiscontinuously,intheformof1-kbfragments(Okazakifragments).BothnewstrandsareformedsimultaneouslybytheconcertedactionsofthehighlyprocessiveDNApolymeraseIIIholoenzyme,anasymmetricdimer.Thediscontinuousassemblyofthelaggingstrandenables53polymerizationattheatomicleveltogiverisetooverallgrowthofthisstrandinthe3→5direction.TheRNAprimerstretchishydrolyzedbythe5→3nucleaseactivityofDNApolymeraseI,whichalsofillsgaps.Finally,nasce