遺傳性疾病的分子診斷教學(xué)課程

第十五章

遺傳性疾病分子診療

基因工程研究所南方醫(yī)科大學(xué)南方醫(yī)科大學(xué)遺傳性疾病的分子診斷教學(xué)課程第1頁教學(xué)目標與要求

了解遺傳性疾病分子診療方法學(xué)評價及產(chǎn)前（包含胚胎植入前）遺傳缺點分子診療適應(yīng)癥。熟悉遺傳性疾病分子機制及分子診療標準化。掌握遺傳性疾病及產(chǎn)前（包含胚胎植入前）遺傳缺點經(jīng)典檢測方法及臨床意義。重點遺傳性疾病及產(chǎn)前（包含胚胎植入前）遺傳缺點經(jīng)典檢測方法及臨床意義。難點遺傳性疾病分子機制。南方醫(yī)科大學(xué)遺傳性疾病的分子診斷教學(xué)課程第2頁本章目錄第一節(jié)遺傳性疾病分子診療策略***第二節(jié)遺傳病分子診療第三節(jié)產(chǎn)前（包含胚胎植入前）遺傳缺點分子診療****南方醫(yī)科大學(xué)遺傳性疾病的分子診斷教學(xué)課程第3頁第一節(jié)遺傳性疾病分子診療策略*一、直接診療策略二、基因多態(tài)性連鎖分析三、基因突變定量（dosage）診療南方醫(yī)科大學(xué)遺傳性疾病的分子診斷教學(xué)課程第4頁一、直接診療策略定義：直接檢測造成遺傳性疾病各種基因突變類型：點突變?nèi)笔Р迦氡对銮疤幔夯蛞呀?jīng)克隆，序列和結(jié)構(gòu)清楚南方醫(yī)科大學(xué)遺傳性疾病的分子診斷教學(xué)課程第5頁(一)點突變診療1、基因背景清楚點突變等位基因特異性寡核苷酸雜交(allelespecificoligonucleotide,ASO)PCR-ELISA等位基因特異性擴增(allelespecificamplification,ASAPCR-RFLP測序基因芯片技術(shù)等進行診療南方醫(yī)科大學(xué)遺傳性疾病的分子診斷教學(xué)課程第6頁2、基因背景未知點突變單鏈構(gòu)象多態(tài)性(single-strandconformationalpolymorphism,SSCP)變性梯度凝膠電泳(denaturinggradientgelelectrophoresis,DGGE)異源雙鏈分析(heteroduplexanalysis,HA)DNA序列測定蛋白截短測試（proteintruncationtest,PTT）南方醫(yī)科大學(xué)遺傳性疾病的分子診斷教學(xué)課程第7頁(二)片段性突變檢測（1）少數(shù)核苷酸缺失或插入

檢測點突變方法（2）大片段突變

Southern印跡技術(shù)、多重PCR技術(shù)。片段性突變是指DNA分子較大范圍發(fā)生突變，堿基缺失、插入、擴增和重組。南方醫(yī)科大學(xué)遺傳性疾病的分子診斷教學(xué)課程第8頁二、基因多態(tài)性連鎖分析檢測原理：多態(tài)性連鎖分析、關(guān)聯(lián)分析檢測前提：致病基因還未被定位和說明基因太大突變種類太多檢測方法：RFLP，VNTR，STR，SNP南方醫(yī)科大學(xué)遺傳性疾病的分子診斷教學(xué)課程第9頁三、基因突變定量診療檢測方法：細胞分裂中期染色體檢測固相雜交

PCR擴增檢測內(nèi)容：大范圍重復(fù)、缺失南方醫(yī)科大學(xué)遺傳性疾病的分子診斷教學(xué)課程第10頁方法分辨率(堿基數(shù))說明細胞分裂中期染色體檢測染色體常規(guī)細胞培養(yǎng)至細胞分裂期染色；CGH5x106細胞分裂中期染色體作為探針來檢測和控制不一樣雜交；FISH5x104用修飾（如纖維探針）來增強分辨率；陣列CGH5x104使用陣列化細菌人工染色體載體（Bacterialartificialchromosomes，BACs）而非細胞分裂中期染色體作為探針；MAPH不確定將探針與基因組DNA雜交，然后再擴增探針；微衛(wèi)星PCR1x102取決于缺失區(qū)已知微衛(wèi)星；差異PCR1x102要求精心控制起始DNA質(zhì)和量，結(jié)果為相對量，是一個半定量方法；競爭PCR1x102準確，結(jié)果為摩爾數(shù)，是一個絕對定量方法；Real-timePCR1x102成本較高，可有各種方法如Taqman法或分子信標法SYBRGreen染料或探針，應(yīng)用越來越廣泛；長片段PCR1x102檢測基因內(nèi)缺失比重復(fù)更有效，能夠確定突變性質(zhì)。南方醫(yī)科大學(xué)遺傳性疾病的分子診斷教學(xué)課程第11頁第二節(jié)遺傳病分子診療一、血紅蛋白病二、血友病三、肌營養(yǎng)不良癥四、苯丙酮尿癥五、囊性纖維化六、亨廷頓病七、脆性X綜合征南方醫(yī)科大學(xué)遺傳性疾病的分子診斷教學(xué)課程第12頁一、血紅蛋白病血紅蛋白含有4個亞基組成四級結(jié)構(gòu)，每個亞基可結(jié)合1個血紅素并攜帶1分子氧。Hb亞基之間經(jīng)過8對鹽鍵，使4個亞基緊密結(jié)合而形成親水球狀蛋白。南方醫(yī)科大學(xué)遺傳性疾病的分子診斷教學(xué)課程第13頁珠蛋白基因簇16p13.33-p13.11南方醫(yī)科大學(xué)遺傳性疾病的分子診斷教學(xué)課程第14頁11ｐ15.5珠蛋白基因簇:南方醫(yī)科大學(xué)遺傳性疾病的分子診斷教學(xué)課程第15頁血紅蛋白類型成人Hb：Hb

A2297～98%

Hb

A2

222～3%胎兒Hb：HbF22

α2Gγ2α2Aγ2胚胎Hb：HbGowerⅠ22

ζ2Gγ2ζ2Aγ2

(妊娠12周內(nèi))HbGowerⅡ22

HbPortland22

南方醫(yī)科大學(xué)遺傳性疾病的分子診斷教學(xué)課程第16頁血紅蛋白類型南方醫(yī)科大學(xué)遺傳性疾病的分子診斷教學(xué)課程第17頁血紅蛋白病hemoglobinopathy

結(jié)構(gòu)異常血紅蛋白病

鐮刀狀細胞貧血；不穩(wěn)定血紅蛋白病血紅蛋白M病氧親和力改變地中海貧血，

珠蛋白合成降低或消失南方醫(yī)科大學(xué)遺傳性疾病的分子診斷教學(xué)課程第18頁1、鐮刀形紅細胞貧血正常細胞鐮刀形細胞鐮刀狀貧血病—血液中大量出現(xiàn)鐮刀紅細胞，其攜帶氧功效只有正常紅細胞二分之一，患者常所以缺氧窒息。南方醫(yī)科大學(xué)遺傳性疾病的分子診斷教學(xué)課程第19頁N-val·his·leu·thr·pro·glu

·glu·····C(146)HbSβ肽鏈HbAβ肽鏈N-val·his·leu·thr·pro·val·glu·····C(146)鐮刀狀細胞貧血分子機制

GTGCATCTGACTCCTGAGGAGGTGCATCTGACTCCTGTGGAG南方醫(yī)科大學(xué)遺傳性疾病的分子診斷教學(xué)課程第20頁分子診療方法限制性內(nèi)切酶法（RE）ASOARMS、跨越斷裂點PCR(裂口PCR、gap-PCR)南方醫(yī)科大學(xué)遺傳性疾病的分子診斷教學(xué)課程第21頁Sβ肽鏈Aβ肽鏈ACTCCTGAGGAGACTCCTGTGGAGRE法(SouthernBlot)MstII

CCTNAGG

GGANTCC1.15kb0.2kb1.35kbASSA南方醫(yī)科大學(xué)遺傳性疾病的分子診斷教學(xué)課程第22頁Sβ肽鏈Aβ肽鏈ACTCCTGAGGAGACTCCTGTGGAGRE法(PCR-RFLP)DdeI

CTNAG

GANTC268bpASSA175bp175268443南方醫(yī)科大學(xué)遺傳性疾病的分子診斷教學(xué)課程第23頁思索題（作業(yè)）書中239頁中關(guān)于HbE檢測請回答以下問題（1）HbE突變堿基改變情況

(2)該突變位于蛋白質(zhì)第幾個氨基酸（3）突變位點位于氨基酸哪一個外顯子上（4）寫出基因組參考序列中另外顯子后內(nèi)含子序列（5’和3’端各5個堿基）

(5)用MnlI酶切后，請列出各種可能情況（6）結(jié)合所學(xué)習(xí)知識，請再寫出幾個可能用于診療方法。南方醫(yī)科大學(xué)遺傳性疾病的分子診斷教學(xué)課程第24頁

2.地中海貧血

因為珠蛋白鏈合成不平衡所造成一類常見單基因遺傳性、溶血性疾病。類型：α地中海貧血，β地中海貧血，γ地中海貧血，δ地中海貧血，以這類推。南方醫(yī)科大學(xué)遺傳性疾病的分子診斷教學(xué)課程第25頁地中海貧血南方醫(yī)科大學(xué)遺傳性疾病的分子診斷教學(xué)課程第26頁α地中海貧血

每條16號染色體上有兩個αGene——缺失程度不一樣，α鏈合成部分或完全受到抑制，造成不一樣類型地貧。

若一條染色體上缺失一個α基因（／α－）為α+地貧，α鏈合成降低。若一條染色體上兩個α基因均缺失（／－－）為α0地貧，α鏈不能合成。南方醫(yī)科大學(xué)遺傳性疾病的分子診斷教學(xué)課程第27頁臨床類型類型癥狀正常人靜止型+地貧雜合子無癥狀輕型（標準型）0地貧雜合子輕度貧血+地貧純合子血紅蛋白H病0地貧和+地貧雙重雜合子溶血性貧血HbBart’s胎兒水腫綜合征0地貧純合子胎兒水腫南方醫(yī)科大學(xué)遺傳性疾病的分子診斷教學(xué)課程第28頁胎兒水腫南方醫(yī)科大學(xué)遺傳性疾病的分子診斷教學(xué)課程第29頁α地貧分子基礎(chǔ)

依α基因缺點程度分為：Gene缺失型（缺失1～４個α基因）非Gene缺失型（點突變）：無義突變、移碼突變、終止密碼突變、剪接突變等結(jié)果1

生成無功效或穩(wěn)定性降低mRNA

無義突變移碼突變終止密碼突變起始密碼突變

2

RNA加工突變

3

產(chǎn)生不穩(wěn)定Hb南方醫(yī)科大學(xué)遺傳性疾病的分子診斷教學(xué)課程第30頁α地中海貧血分子機制南方醫(yī)科大學(xué)遺傳性疾病的分子診斷教學(xué)課程第31頁分子診療方法

(1)PCR法PCR法已經(jīng)成為判別缺失型α地中海貧血首選方法。(2)ARMS法該法能快速判別診療HbCS和HbQS(3)ASA法與ARMS法相類似(4)SSCP法非缺失型α2地中海貧血突變

(5)等位基因特異性擴增技術(shù)(ASPCR）法南方醫(yī)科大學(xué)遺傳性疾病的分子診斷教學(xué)課程第32頁β地中海貧血

β珠蛋白Gene突變或缺失→β珠蛋白鏈合成速率下降→溶血性貧血

β0

地貧：β鏈完全不能合成

β+地貧：β鏈可部分合成南方醫(yī)科大學(xué)遺傳性疾病的分子診斷教學(xué)課程第33頁β-地中海貧血臨床分類臨床類型基因型基因產(chǎn)物臨床表現(xiàn)重型地貧+/+、0/00/0、+/0鏈幾乎不能合成鏈合成相對增加HbF和HbA2增高地中海貧血面容溶血性貧血（需輸血）輕型地貧+/A、0/A0/A能合成適量鏈貧血不顯著或輕度貧血中間型地貧+/+

鏈部分合成介于重型和輕型之間（不需輸血）遺傳性胎兒血紅蛋白連續(xù)增多癥缺失或突變鏈和鏈合成受抑制鏈合成顯著增加成人HbF連續(xù)增加，無癥狀南方醫(yī)科大學(xué)遺傳性疾病的分子診斷教學(xué)課程第34頁患兒顱骨及面頰部骨骼增大，頭顱變大，額部隆起，顴高，鼻梁塌陷，兩眼距離增寬，眼瞼浮腫，形成地中海貧血特殊面容。南方醫(yī)科大學(xué)遺傳性疾病的分子診斷教學(xué)課程第35頁X線顱骨照片可見顱骨內(nèi)外板變薄，板障增寬，在骨皮質(zhì)間出現(xiàn)垂直短發(fā)樣骨刺南方醫(yī)科大學(xué)遺傳性疾病的分子診斷教學(xué)課程第36頁-地中海貧血分子基礎(chǔ)

地中海貧血已發(fā)覺100各種突變類型，包含點突變和基因缺失。絕大多數(shù)地中海貧血是因為基因發(fā)生點突變所致，突變包括基因內(nèi)及側(cè)翼序列。（1）編碼區(qū)突變（2）非編碼區(qū)突變（3）開啟子區(qū)突變（4）RNA裂解信號突變（5）加帽位點單個堿基突變南方醫(yī)科大學(xué)遺傳性疾病的分子診斷教學(xué)課程第37頁☆編碼區(qū)突變

——mRNA穩(wěn)定性降低或形成無功效mRNA（1）無義突變密碼子17：A→C

密碼子43：G→Tβ0地貧（2）移碼突變密碼子71/72：+A

密碼子41/42：－TCTTβ0地貧（3）起始密碼突變

ATG→AGGβ0地貧南方醫(yī)科大學(xué)遺傳性疾病的分子診斷教學(xué)課程第38頁⑴內(nèi)含子IGT→AT喪失一個剪切信號。⑵新切點產(chǎn)生同義突變→激活→I和Exon隱蔽裂解位點如：GGT→AGT產(chǎn)生新剪切點☆非編碼區(qū)突變

——影響mRNA剪切、加工過程南方醫(yī)科大學(xué)遺傳性疾病的分子診斷教學(xué)課程第39頁GT→ATGGT→AGT，激活隱蔽剪切位點南方醫(yī)科大學(xué)遺傳性疾病的分子診斷教學(xué)課程第40頁☆開啟子區(qū)突變

——降低mRNA轉(zhuǎn)錄效率-28位A→G突變破壞了TATABox。南方醫(yī)科大學(xué)遺傳性疾病的分子診斷教學(xué)課程第41頁☆RNA裂解信號突變

——不能準確裂解和加polyAβ珠蛋白基因3’側(cè)翼序列中AATAAA→AACAAA☆加帽位點單個堿基突變

——不能準確裂解和加polyA加帽位點發(fā)生A→C顛換，影響轉(zhuǎn)錄效率。通常是mRNA第一個核苷酸。南方醫(yī)科大學(xué)遺傳性疾病的分子診斷教學(xué)課程第42頁分子診療方法

PCR反向點雜交(PCR-RDB)法PCR—RFLP法基因芯片法等ND1234658710911南方醫(yī)科大學(xué)遺傳性疾病的分子診斷教學(xué)課程第43頁

二、血友病

人體凝血過程需要各種凝血因子參加。因為凝血因子基因缺點而使其中某一凝血因子蛋白表示降低或缺如即造成血友病(hemophilia)。85％血友病患者是因為血漿中缺乏凝血第8因子(FⅧ)所致，約10％患者是因為缺乏凝血第9因子(FⅨ)，前者稱為甲型血友病，后者稱為乙型血友病。南方醫(yī)科大學(xué)遺傳性疾病的分子診斷教學(xué)課程第44頁

（一）甲型血友病及其分子診療甲型血友病是因為凝血因子Ⅷ(FⅧ)即抗血友病球蛋白(antihemophilicglobulin,AHG)缺乏所造成凝血機制異常遺傳性疾病。南方醫(yī)科大學(xué)遺傳性疾病的分子診斷教學(xué)課程第45頁

2．甲型血友病分子機制

在FⅧ基因區(qū)域內(nèi)，有一個A基因存在三個拷貝，其功效不詳，其中一個A基因位于FⅧ基因第22號內(nèi)含子內(nèi)(A1)，另外兩個位于X染色體末端(A2、A3)。A1基因能夠與其上游兩個A基因拷貝中一個發(fā)生同源重組，引發(fā)FⅧ基因1-22外顯子片段倒位，這種倒位造成FⅧ功效完全喪失而發(fā)生嚴重血友病。南方醫(yī)科大學(xué)遺傳性疾病的分子診斷教學(xué)課程第46頁甲型血友病分子診療

（1）基因倒位檢測因為50％左右甲型血友病是因為FⅧ基因中22號內(nèi)含子倒位引發(fā)，所以檢測該突變成為對患者進行基因診療首選方法。在檢測基因倒位方法中首選是長距離PCR(LD-PCR)技術(shù)。南方醫(yī)科大學(xué)遺傳性疾病的分子診斷教學(xué)課程第47頁(2)非基因倒位檢測點突變是非基因倒位引發(fā)甲型血友病主要原因，所以對該類患者家系分析和攜帶者基因檢測主要是經(jīng)過點突變檢測技術(shù)進行。南方醫(yī)科大學(xué)遺傳性疾病的分子診斷教學(xué)課程第48頁1)PCR-RFLP法2)VNTR法3)STR法4)PCR-SSCP法南方醫(yī)科大學(xué)遺傳性疾病的分子診斷教學(xué)課程第49頁

（二）乙型血友病及其分子診療乙型血友病，又稱Christmas病或血漿凝血活酶成份(plasmathromboplastincomponent,PTC)

缺乏癥，是凝血因子Ⅸ(FⅨ)缺點所致一個嚴重遺傳性出血性疾病。南方醫(yī)科大學(xué)遺傳性疾病的分子診斷教學(xué)課程第50頁分子機制為編碼FⅨ基因缺點，造成FⅨ含量缺乏或結(jié)構(gòu)異常，從而凝血功效障礙。臨床表現(xiàn)與甲型血友病完全相同。南方醫(yī)科大學(xué)遺傳性疾病的分子診斷教學(xué)課程第51頁分子診療直接測序法、基因芯片法和毛細管電泳(capillaryelectrophoresis,CE)；間接檢測方法有：RFLP法、SSCP法、DGGE法、雙脫氧指紋圖譜(dideoxyfingerprint,ddF)、變性高效液相色譜法(denaturinghighperformanceliquidchromatography,DHPLC）

南方醫(yī)科大學(xué)遺傳性疾病的分子診斷教學(xué)課程第52頁三、肌營養(yǎng)不良癥

肌營養(yǎng)不良癥又稱為假性肥大性肌營養(yǎng)不良。主要有杜氏肌營養(yǎng)不良癥(Duchennemusculardystrophy,DMD)和貝氏肌營養(yǎng)不良癥(Beckermusculardystrophy,BMD)，它們是一個常見X連鎖性隱性遺傳病，所以患者都為男孩。南方醫(yī)科大學(xué)遺傳性疾病的分子診斷教學(xué)課程第53頁發(fā)病機制

主要為抗肌萎縮蛋白基因（dystrophingene)突變造成肌細胞膜上抗肌萎縮蛋白(dystrophin)發(fā)生結(jié)構(gòu)和功效改變所致。

Dystrophin是抗肌萎縮蛋白基因(DMD基因)產(chǎn)物，當DMD基因突變后Dystrophin合成缺乏，該復(fù)合物無法有效形成，使細胞膜不穩(wěn)定，最終造成肌細胞因通透性增加而變性或壞死，造成DMD發(fā)生。南方醫(yī)科大學(xué)遺傳性疾病的分子診斷教學(xué)課程第54頁

2．杜氏和貝氏肌營養(yǎng)不良癥分子診療

(1)多重PCR技術(shù)（2）短串聯(lián)重復(fù)序列(shorttandemrepeat,STR)連鎖分析（3）定量PCR技術(shù)（4）RT-PCR技術(shù)南方醫(yī)科大學(xué)遺傳性疾病的分子診斷教學(xué)課程第55頁四、苯丙酮尿癥PKU是由挪威科學(xué)家Folling發(fā)覺，當初被命名為“苯丙酮尿性智力發(fā)育不全”，1937年P(guān)enrose和Quastel將之命名為苯丙酮尿癥(phenylketonuria,PKU)。其主要是因為肝內(nèi)苯丙氨酸羥化酶（phenylalaninehydroxylase,PAH）嚴重缺失所致苯丙氨酸代謝異常，為常染色體隱性遺傳病。南方醫(yī)科大學(xué)遺傳性疾病的分子診斷教學(xué)課程第56頁(二)苯丙酮酸尿癥分子診療1．PCR－STR連鎖分析2．PCR-SSCP法3．PCR-RFLP4．多重ASPCR法南方醫(yī)科大學(xué)遺傳性疾病的分子診斷教學(xué)課程第57頁

五、囊性纖維化(cysticfibrosis,CF)CF是由囊性纖維化穿膜傳導(dǎo)調(diào)整因子(cysticfibrosistransmembraneconductanceregulator,CFTR)基因突變所致，為白種人中最常見一個家族常染色體隱性遺傳性先天性致死性疾病，多累及兒童和青年，發(fā)病率以西、北歐及北美人群為高。CF常累及胃腸道和呼吸道，極易發(fā)生呼吸道感染而引發(fā)氣道梗阻及呼吸功效不全，多數(shù)病人僅能成活多年到十余年。南方醫(yī)科大學(xué)遺傳性疾病的分子診斷教學(xué)課程第58頁CF分子機制

CFTR基因突變已達1000余種，已知CF突變在CFTR基因中分布是非隨機，絕大多數(shù)集中于編碼CFTR蛋白NBFs區(qū)外顯子9、10、11、12、19、20、21、22，跨膜區(qū)外顯子3、4、7、14a、14b、17b以及R區(qū)第13外顯子，其中除ΔF508及另外十余種較為常見突變外，其余均為罕見突變或僅見于個別病例。南方醫(yī)科大學(xué)遺傳性疾病的分子診斷教學(xué)課程第59頁CF分子診療早期CF基因診療基于RFLP連鎖分析，采取探針多為基因克隆過程中取得基因側(cè)翼DNA片段。在CF基因克隆和測序以后，PCR技術(shù)被用于直接基因診療。同時，新突變分析方法也相繼問世。南方醫(yī)科大學(xué)遺傳性疾病的分子診斷教學(xué)課程第60頁

六、亨廷頓病

亨廷頓病（Huntington'sdisease,HD)是一個有IT15基因上CAG重復(fù)序列一場擴展所致常染色體顯性遺傳以舞蹈運動為主要特征神經(jīng)退行性疾病。南方醫(yī)科大學(xué)遺傳性疾病的分子診斷教學(xué)課程第61頁HD分子機制

HD即由CAG重復(fù)序列異常擴展突變引發(fā)，CAG重復(fù)范圍在正常染色體為9～35個拷貝，而在HD患者染色體上，重復(fù)長度大于拷貝，CAG拷貝數(shù)目與HD發(fā)病年紀負相關(guān)，其基因突變率在人類單基因遺傳性疾病中最低。南方醫(yī)科大學(xué)遺傳性疾病的分子診斷教學(xué)課程第62頁HD分子診療

針對不一樣個體利用三條引物進行PCR擴增，擴增產(chǎn)物變性聚丙烯酰胺凝膠電泳放射自顯影判定IT15基因（CAG)ｎ串聯(lián)重復(fù)序列拷貝數(shù)，此法能對超出95％HD患者診療和排除診療。南方醫(yī)科大學(xué)遺傳性疾病的分子診斷教學(xué)課程第63頁

七脆性X綜合征

脆性X綜合征（fragileXsyndrome,FraX）是僅次于Down’s綜合征又