臨床免疫學(xué)檢驗(yàn)技術(shù)

臨床免疫學(xué)檢驗(yàn)技術(shù)江西省胸科醫(yī)院：熊國(guó)亮臨床免疫學(xué)檢驗(yàn)技術(shù)第1頁(yè)一、概述免疫學(xué)檢驗(yàn)是研究免疫學(xué)技術(shù)及其在醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)領(lǐng)域應(yīng)用一門學(xué)科。免疫檢驗(yàn)技術(shù)則重點(diǎn)闡述各類免疫學(xué)技術(shù)基本原理、方法類型和臨床應(yīng)用。19世紀(jì)末相繼建立了凝集試驗(yàn)、沉淀試驗(yàn)和補(bǔ)體結(jié)合試驗(yàn)等三大經(jīng)典血清學(xué)試驗(yàn)，用于檢測(cè)病原微生物抗原或抗體對(duì)傳染病診療起到主要作用。臨床免疫學(xué)檢驗(yàn)技術(shù)第2頁(yè)一、概述伴隨免疫學(xué)理論和試驗(yàn)技術(shù)發(fā)展，放射免疫技術(shù)、熒光免疫技術(shù)、酶免疫技術(shù)、化學(xué)發(fā)光免疫技術(shù)、流式細(xì)胞免疫分析技術(shù)等免疫標(biāo)識(shí)技術(shù)應(yīng)用于臨床免疫學(xué)檢驗(yàn)，加緊了免疫學(xué)檢驗(yàn)自動(dòng)化、標(biāo)準(zhǔn)化進(jìn)程，極大地提升了免疫學(xué)檢驗(yàn)靈敏度，拓展了免疫學(xué)檢測(cè)范圍，從檢測(cè)免疫相關(guān)物質(zhì)（抗原、抗體、補(bǔ)體、免疫活性細(xì)胞和細(xì)胞因子等）到檢測(cè)體液中微量物質(zhì)（激素、酶、血漿微量蛋白、血藥濃度、微量元素等）。臨床免疫學(xué)檢驗(yàn)技術(shù)第3頁(yè)一、概述免疫檢驗(yàn)技術(shù)以其特有特異性、敏感性和微量、快速、穩(wěn)定等優(yōu)勢(shì)被廣泛應(yīng)用于臨床醫(yī)學(xué)。臨床免疫學(xué)檢驗(yàn)技術(shù)第4頁(yè)二、免疫檢驗(yàn)技術(shù)在臨床免疫學(xué)檢驗(yàn)應(yīng)用1.傳染病免疫學(xué)檢驗(yàn)機(jī)體被細(xì)菌、病毒、支原體、衣原體、螺旋體等微生物感染后，?？稍谘逯谐霈F(xiàn)與病原體相對(duì)應(yīng)特異性抗體，檢測(cè)這類抗體有利于明確疾病診療（血清學(xué)診療）。另外，還能夠用含有特異性抗體診療血清判定對(duì)應(yīng)病原體及相關(guān)抗原，為確定傳染病原提供依據(jù)。臨床免疫學(xué)檢驗(yàn)技術(shù)第5頁(yè)二、免疫檢驗(yàn)技術(shù)在臨床免疫學(xué)檢驗(yàn)應(yīng)用2.機(jī)體天然免疫檢測(cè)主要是對(duì)各種吞噬細(xì)胞如中性粒細(xì)胞、NK細(xì)胞、單核巨噬細(xì)胞功效進(jìn)行檢測(cè)以及檢測(cè)在機(jī)體組織損傷、局部缺血、急性感染與炎癥反應(yīng)時(shí)升高血漿蛋白，如C反應(yīng)性蛋白，血漿中CRP濃度在急性心肌梗死、創(chuàng)傷、感染、炎癥、外科手術(shù)、腫瘤浸潤(rùn)時(shí)快速顯著地增高，可達(dá)正常水平倍。CRP是引發(fā)心臟病最強(qiáng)烈危險(xiǎn)原因。臨床免疫學(xué)檢驗(yàn)技術(shù)第6頁(yè)二、免疫檢驗(yàn)技術(shù)在臨床免疫學(xué)檢驗(yàn)應(yīng)用3.免疫球蛋白、循環(huán)免疫復(fù)合物和補(bǔ)體測(cè)定包含測(cè)定五類免疫球蛋白含量、血清總補(bǔ)體活性及補(bǔ)體成份含量和在各種疾病時(shí)血清中升高循環(huán)免疫復(fù)合物。臨床免疫學(xué)檢驗(yàn)技術(shù)第7頁(yè)二、免疫檢驗(yàn)技術(shù)在臨床免疫學(xué)檢驗(yàn)應(yīng)用4.細(xì)胞免疫相關(guān)指標(biāo)測(cè)定檢測(cè)淋巴細(xì)胞亞群和淋巴細(xì)胞功效以及白細(xì)胞介素—2等各種細(xì)胞因子，用于判斷機(jī)體細(xì)胞免疫功效情況。臨床免疫學(xué)檢驗(yàn)技術(shù)第8頁(yè)二、免疫檢驗(yàn)技術(shù)在臨床免疫學(xué)檢驗(yàn)應(yīng)用5.本身抗體測(cè)定機(jī)體在發(fā)生本身免疫性疾病時(shí)，?？沙霈F(xiàn)各本身抗體，用免疫學(xué)方法檢測(cè)這些抗體，可為本身免疫性病診療、疾病狀態(tài)判斷和療效監(jiān)測(cè)提供依據(jù)。臨床免疫學(xué)檢驗(yàn)技術(shù)第9頁(yè)二、免疫檢驗(yàn)技術(shù)在臨床免疫學(xué)檢驗(yàn)應(yīng)用6.腫瘤標(biāo)志物測(cè)定免疫學(xué)方法定性或定量檢測(cè)在腫瘤發(fā)生和增殖過(guò)程中由腫瘤細(xì)胞合成、釋放或機(jī)體對(duì)腫瘤反應(yīng)產(chǎn)生一些生化物質(zhì)，對(duì)腫瘤篩查、判別診療、治療后病情監(jiān)測(cè)及預(yù)后判斷都有主要意義。臨床免疫學(xué)檢驗(yàn)技術(shù)第10頁(yè)三、酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（enzyme-linkedimmunosorbentassay,ELISA）原理：酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)是免疫酶技術(shù)固相酶免疫測(cè)定一個(gè)技術(shù)，是將待測(cè)抗原或抗體先固定于固相載體表面，再用酶標(biāo)識(shí)抗原或抗體與已被固定對(duì)應(yīng)抗體或抗原發(fā)生特異性反應(yīng)，加入酶底物及色原后呈色，呈色程度用吸光度（A）值表示，所測(cè)A值與待測(cè)抗體或抗原水平呈相關(guān)關(guān)系。臨床免疫學(xué)檢驗(yàn)技術(shù)第11頁(yè)三、酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（enzyme-linkedimmunosorbentassay,ELISA）此法慣用多孔聚苯乙烯反應(yīng)板作為固相載體，讀取結(jié)果需用酶標(biāo)儀。標(biāo)識(shí)抗原或抗體所用酶常選擇辣根過(guò)氧化物酶（HRP）、堿性磷酸酶（AP）等，HRP慣用底物有鄰苯二胺（OPD）或四甲基聯(lián)苯胺（TMB），堿性磷酸酶普通采取對(duì)硝基苯磷酸酯（P-NPP）作為底物，產(chǎn)物為黃色對(duì)硝基酚，在405nm波優(yōu)點(diǎn)有最高吸收峰。臨床免疫學(xué)檢驗(yàn)技術(shù)第12頁(yè)三、酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（enzyme-linkedimmunosorbentassay,ELISA）根椐方法和步驟不一樣可分為以下幾個(gè)基本反應(yīng)模式。1.間接法是檢測(cè)樣本中特異性抗體最慣用方法。將已知特異性抗原包被于固相載體上，加待檢樣本，若其中含特異性抗體則與固相抗原結(jié)合形成抗原—抗體復(fù)合物；洗棄未反應(yīng)成份，加酶標(biāo)識(shí)抗抗體（普通為酶標(biāo)識(shí)抗人IgG或葡萄球菌A蛋白），使在固相載體上形成抗原—待檢抗體—標(biāo)識(shí)抗體（或SPA）復(fù)合物；洗棄未反應(yīng)成份，加酶底物，終止反應(yīng)后，在一定波長(zhǎng)下用酶標(biāo)儀測(cè)吸光度（A）值判定待測(cè)抗體有沒(méi)有或含量。間接法優(yōu)點(diǎn)是制備一個(gè)酶標(biāo)識(shí)抗抗體（或SPA），只需更換不一樣固相抗原，便可檢測(cè)各種抗體。如HCV-IgG抗體檢測(cè)臨床免疫學(xué)檢驗(yàn)技術(shù)第13頁(yè)三、酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（enzyme-linkedimmunosorbentassay,ELISA）2.夾心法夾心法有雙抗體夾心法（測(cè)抗原）和雙抗原夾心法（測(cè)抗體），二者試驗(yàn)步驟相同，但包被物、酶結(jié)合物和檢測(cè)對(duì)象不一樣。雙抗體夾心法用于檢測(cè)相對(duì)分子質(zhì)量較大蛋白質(zhì)抗原。先將已知特異性抗體包被于固相載體上，加待測(cè)樣本，若其中有對(duì)應(yīng)抗標(biāo)準(zhǔn)與固相抗體特異性結(jié)合；洗板后加入酶標(biāo)識(shí)特異性抗體，使成包被抗體—待測(cè)抗原—酶標(biāo)抗體復(fù)合物；抗原或抗體含量與所測(cè)吸光度（A）值呈正相關(guān)。如乙型肝炎HBsAg檢測(cè)、抗HBs檢測(cè)、HBeAg檢測(cè)。臨床免疫學(xué)檢驗(yàn)技術(shù)第14頁(yè)三、酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（enzyme-linkedimmunosorbentassay,ELISA）3.競(jìng)爭(zhēng)法用于檢測(cè)待檢樣本中未知抗原或抗體。以測(cè)定抗體競(jìng)爭(zhēng)法為例，將已知抗體吸附于固相載體，洗滌除去未結(jié)合抗體，；加特異性抗原與包被抗體形成固相抗原抗體復(fù)合物，洗滌除去游離抗原，加標(biāo)本和酶標(biāo)抗體，標(biāo)本中抗體與酶標(biāo)抗體競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合固相復(fù)合物中抗原。標(biāo)本中抗體越多，其競(jìng)爭(zhēng)力越強(qiáng)，與固相抗原結(jié)合酶標(biāo)抗體越少，加酶底物顯色，有色產(chǎn)物多少與酶標(biāo)抗體量成正比，與被測(cè)抗體量成反比。如乙型肝炎總抗HBc檢測(cè)、抗HBe檢測(cè)。臨床免疫學(xué)檢驗(yàn)技術(shù)第15頁(yè)三、酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（enzyme-linkedimmunosorbentassay,ELISA）4.捕捉法用于測(cè)定特異性IgM類抗體。被檢血清中針對(duì)某抗原特異性IgM和IgG常同時(shí)存在，為防止IgG干擾，普通采取捕捉法來(lái)測(cè)定IgM。先將已知特異性抗體（如抗人μ鏈）包被于固相載體上，加待測(cè)人血清樣本，其中IgM（IgM分子相對(duì)于固相抗μ鏈又是一個(gè)抗原）被固相抗μ鏈抗體特異性捕捉，形成IgM-抗IgM復(fù)合物。洗滌除去血清中其它Ig和雜質(zhì)；加特異性抗原試劑，該抗原只與固相上特異性IgM結(jié)合。臨床免疫學(xué)檢驗(yàn)技術(shù)第16頁(yè)三、酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（enzyme-linkedimmunosorbentassay,ELISA）洗滌除去未結(jié)合特異性抗原；加入針對(duì)特異性抗原酶標(biāo)抗體，此酶標(biāo)抗體只與固相上特異性抗原結(jié)合。洗滌除去未結(jié)合酶標(biāo)抗體，加酶底物反應(yīng)，色多少與標(biāo)本中特異性IgM量成正比。如甲肝(抗HAV-IgM)檢測(cè)、抗HBc-IgM檢測(cè)。臨床免疫學(xué)檢驗(yàn)技術(shù)第17頁(yè)三、酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（enzyme-linkedimmunosorbentassay,ELISA）5.生物素—親合素ELISA（avidin—biotin—peroxi—dasecomplex，ABC-ELISA）是將生物素（biotin）和親合素(avidin)或鏈霉親合素(streptavidin,SA)引入ELISA方法。生物素是一個(gè)小分子物質(zhì)，經(jīng)活化后可高比度偶聯(lián)抗體或抗原等大分子。親合素（或鏈霉親合素）與生物素結(jié)協(xié)力極強(qiáng)，一分子親合素可與4個(gè)生物素分子結(jié)合。在反應(yīng)系統(tǒng)中引入生物素和酶標(biāo)識(shí)親合素，可將ELISA反應(yīng)多級(jí)放大，顯著提升檢測(cè)方法敏感性。臨床免疫學(xué)檢驗(yàn)技術(shù)第18頁(yè)四、臨床免疫室內(nèi)質(zhì)控（一）ELISA檢測(cè)室內(nèi)質(zhì)控1．現(xiàn)實(shí)狀況：ELISA法檢測(cè)影響原因多，多為手工操作，極難標(biāo)準(zhǔn)化；未得到試驗(yàn)室重視，質(zhì)控品起源有限或價(jià)格原因，操作人員意識(shí)不夠，有些基層單位不是天天做或者根本沒(méi)有做，有不知從何做起。臨床免疫學(xué)檢驗(yàn)技術(shù)第19頁(yè)四、臨床免疫室內(nèi)質(zhì)控2．質(zhì)控品選擇：除了試劑盒附帶陰陽(yáng)性對(duì)照以外，試驗(yàn)室還應(yīng)該選擇最少一個(gè)弱陽(yáng)性質(zhì)控品，靠近Cutoff值，S/CO值應(yīng)該為2-4之間（最好是購(gòu)置商品）。臨床免疫學(xué)檢驗(yàn)技術(shù)第20頁(yè)四、臨床免疫室內(nèi)質(zhì)控3．臨界值與弱陽(yáng)性質(zhì)控血清不一樣點(diǎn)（1）臨界值血清：試驗(yàn)結(jié)果處于（陰、陽(yáng)性）分界點(diǎn)時(shí)樣品中分析物濃度值，低于此值，定性試驗(yàn)結(jié)果為陰性，高于此值，定性試驗(yàn)結(jié)果為陽(yáng)性。對(duì)于定性試驗(yàn)來(lái)講，臨界值是唯一醫(yī)學(xué)決定水平，當(dāng)樣品中被測(cè)物濃度處于臨界水平時(shí)，定性試驗(yàn)重復(fù)檢驗(yàn)同一樣品，將產(chǎn)生50%陽(yáng)性結(jié)果和50%陰性結(jié)果。當(dāng)樣品濃度在臨界值以上增加時(shí)，陽(yáng)性結(jié)果比率增加；而當(dāng)樣品濃度在臨界值以下減低時(shí)，陰性結(jié)果比率增加。臨床免疫學(xué)檢驗(yàn)技術(shù)第21頁(yè)四、臨床免疫室內(nèi)質(zhì)控（2）弱陽(yáng)性質(zhì)控血清：A《醫(yī)療機(jī)構(gòu)臨床試驗(yàn)室管理方法》弱陽(yáng)性定為S/CO=2-4；B用陰性混合血清梯度稀釋陽(yáng)性混合血清，用現(xiàn)用檢測(cè)系統(tǒng)進(jìn)行檢測(cè)所能測(cè)出陽(yáng)性結(jié)果最低濃度。C質(zhì)控品S/CO值-3S≥1最低濃度水平。臨床免疫學(xué)檢驗(yàn)技術(shù)第22頁(yè)四、臨床免疫室內(nèi)質(zhì)控4．測(cè)定頻度：每次檢測(cè)患者樣本時(shí)最少測(cè)定一次室內(nèi)質(zhì)控品；ELISA測(cè)定每塊板都要測(cè)定室內(nèi)質(zhì)控品。5．質(zhì)控圖繪制：定性測(cè)定可采取弱陽(yáng)性質(zhì)控品S/CO值作質(zhì)控圖。判定規(guī)則為12S（警告限），13S。臨床免疫學(xué)檢驗(yàn)技術(shù)第23頁(yè)四、臨床免疫室內(nèi)質(zhì)控（二）標(biāo)本量少定量測(cè)定項(xiàng)目標(biāo)質(zhì)控方法是“即刻法”質(zhì)控（Grubs異常值取舍法）（1）對(duì)于一些不是天天開(kāi)展項(xiàng)目、使用期限較短試劑盒項(xiàng)目，用上述方法計(jì)算取得平均數(shù)和標(biāo)準(zhǔn)差有很大難度。采取Crubbs氏法，只需連續(xù)測(cè)定3次，即可對(duì)第3次檢驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行檢驗(yàn)和控制。含有計(jì)算方法以下：臨床免疫學(xué)檢驗(yàn)技術(shù)第24頁(yè)四、臨床免疫室內(nèi)質(zhì)控

A.計(jì)算出測(cè)定結(jié)果（最少3次）平均值（X）和標(biāo)準(zhǔn)差（S）。

B.計(jì)算SI上限值和下限值:SI上限值=(X最大值-X)/SSI下限值=(X-X最小值)/S臨床免疫學(xué)檢驗(yàn)技術(shù)第25頁(yè)四、臨床免疫室內(nèi)質(zhì)控C.查表，將SI上限SI下限與SI值表中數(shù)值進(jìn)行比較

nn3s

n2snn3s

n2s31.151.15122.552.2941.491.46132.612.3351.751.67142.66

2.3761.941.82152.702.4172.101.94162.752.4482.222.03172.792.4792.322.11182.822.50102.412.18192.852.53112.482.23202.882.56臨床免疫學(xué)檢驗(yàn)技術(shù)第26頁(yè)四、臨床免疫室內(nèi)質(zhì)控當(dāng)SI上限和SI下限值〈n2s時(shí)，表示處于控制范圍之內(nèi)，能夠繼續(xù)進(jìn)行測(cè)定，并重復(fù)以上計(jì)算；當(dāng)SI上限和SI下限有一值處于n2s和n3s值之間時(shí)，說(shuō)明該值在2s-3s臨床免疫學(xué)檢驗(yàn)技術(shù)第27頁(yè)四、臨床免疫室內(nèi)質(zhì)控范圍，處于“警告”狀態(tài)；當(dāng)SI上限和SI下限值有一值處于>n3s時(shí)說(shuō)明該值在3s范圍以外，屬“失控”。數(shù)字處于“警告”和“失控”狀態(tài)應(yīng)舍去，重新測(cè)定該項(xiàng)目質(zhì)控品和病人樣本。舍去只是失控這次數(shù)值，其它次測(cè)定值仍可繼續(xù)使用。當(dāng)檢測(cè)數(shù)字超出20次以后，可轉(zhuǎn)入使用常規(guī)質(zhì)控方法進(jìn)行質(zhì)控。臨床免疫學(xué)檢驗(yàn)技術(shù)第28頁(yè)四、臨床免疫室內(nèi)質(zhì)控（三）其它免疫檢測(cè)質(zhì)控1．定量測(cè)定參考臨床化學(xué)規(guī)則和失控判定（如化學(xué)發(fā)光儀檢測(cè)腫瘤標(biāo)識(shí)物項(xiàng)目）。2．膠體金、膠體硒等試紙條快速檢測(cè)可不做室內(nèi)質(zhì)控品測(cè)定。3．凝集試驗(yàn)：血凝及乳膠凝集試驗(yàn)室內(nèi)質(zhì)控品可采取試劑盒帶陰陽(yáng)對(duì)照。臨床免疫學(xué)檢驗(yàn)技術(shù)第29頁(yè)五、ELISA檢測(cè)中注意事項(xiàng)臨床免疫學(xué)檢驗(yàn)技術(shù)第30頁(yè)試劑原因:抗原抗體純度,抗體親和力、標(biāo)識(shí)物比活性或免疫活性等均對(duì)測(cè)定結(jié)果產(chǎn)生直接影響。試劑盒穩(wěn)定使用期,運(yùn)輸條件及儲(chǔ)存方式等也均會(huì)對(duì)結(jié)果產(chǎn)生一定程度影響。ELISA檢測(cè)主要影響原因臨床免疫學(xué)檢驗(yàn)技術(shù)第31頁(yè)ELISA檢測(cè)主要影響原因標(biāo)本原因:內(nèi)源性物質(zhì)和外源性物質(zhì)干擾。內(nèi)源性物質(zhì)常見(jiàn)有:類風(fēng)濕因子(RF)、嗜異性抗體(Id)、補(bǔ)體、人抗動(dòng)物抗體(HAAA)、藥品及其致代謝產(chǎn)物和交叉反應(yīng)物質(zhì)等等。RF、Id和等干擾機(jī)制相同,均為固相抗體和標(biāo)識(shí)抗體之間橋聯(lián)抗原,在夾心法中易產(chǎn)生假陽(yáng)性。臨床免疫學(xué)檢驗(yàn)技術(shù)第32頁(yè)ELISA檢測(cè)主要影響原因?qū)τ诤袃?nèi)源性干擾物標(biāo)本能夠作以下處理:(1)去除分析用抗體Fc片段,用F(ab)2替換完整IgG,能夠降低RF、Id和HAAA等對(duì)分析結(jié)果影響;(2)用63℃,10min或56℃,30min熱處理來(lái)降低RF和補(bǔ)體等對(duì)結(jié)果影響;(3)用2巰基乙醇加入標(biāo)本稀釋液中,可使RF降解,用EDTA稀釋標(biāo)本可緩解補(bǔ)體對(duì)結(jié)果干擾;臨床免疫學(xué)檢驗(yàn)技術(shù)第33頁(yè)ELISA檢測(cè)主要影響原因設(shè)備：加樣系統(tǒng)、孵育設(shè)備、洗板機(jī)、酶標(biāo)儀環(huán)境原因：水質(zhì)操作：標(biāo)本處理、加樣、溫育、洗板、顯色、終止臨床免疫學(xué)檢驗(yàn)技術(shù)第34頁(yè)設(shè)備衛(wèi)生行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)－乙型肝炎表面抗原酶免疫檢驗(yàn)方法(WS/T223－)酶標(biāo)儀在450nm和492nm波長(zhǎng)不精密度應(yīng)在≤1%，分別在449nm-451nm和491nm-493nm之間，吸光度（A值）要求能夠測(cè)到小數(shù)點(diǎn)后兩位；臨床免疫學(xué)檢驗(yàn)技術(shù)第35頁(yè)設(shè)備移液系統(tǒng)在100μl和50μl移液不精密度應(yīng)≤1%，分別在99-101μl和49.5μl-50.5μl之間；恒溫系統(tǒng)在37℃、43℃溫度變異應(yīng)成士I℃。臨床免疫學(xué)檢驗(yàn)技術(shù)第36頁(yè)RF多為IgM型，也有IgG和IgA型。RF含有與變性IgG產(chǎn)生非特異性結(jié)合特點(diǎn)，所以在ELISA檢測(cè)過(guò)程中可能與固相上包被抗體及酶標(biāo)抗體結(jié)合，并將這藕連起來(lái)產(chǎn)生假陽(yáng)性結(jié)果。這種情況在利用捕捉法測(cè)定IgM型抗體過(guò)程中尤其嚴(yán)重。因?yàn)椴蹲椒y(cè)定IgM型抗體試劑盒中固相上包被抗體為抗人μ鏈。內(nèi)源性干擾臨床免疫學(xué)檢驗(yàn)技術(shù)第37頁(yè)內(nèi)源性干擾補(bǔ)體:補(bǔ)體經(jīng)典活化路徑從C1q開(kāi)始,在固相抗體和酶標(biāo)抗體吸附及結(jié)合過(guò)程中,抗體分子可能發(fā)生變構(gòu),從而使Fc段補(bǔ)體C1q分子結(jié)合點(diǎn)暴露出來(lái),則C1q可將二者連結(jié)起來(lái),造成假陽(yáng)性。臨床免疫學(xué)檢驗(yàn)技術(shù)第38頁(yè)內(nèi)源性干擾可采取RF吸附劑去除RF，63℃10min或56℃30min滅活補(bǔ)體采取抗體Fab段替換完整IgG可有效防止RF干擾。臨床免疫學(xué)檢驗(yàn)技術(shù)第39頁(yè)溶血：Hb含有血紅素基團(tuán)含有類似過(guò)氧化物活性，若標(biāo)本中Hb濃度過(guò)高則可能吸附于固相并于隨即加入HRP底物反應(yīng)顯色。外源性干擾：臨床免疫學(xué)檢驗(yàn)技術(shù)第40頁(yè)外源性干擾：細(xì)菌污染：細(xì)菌一些內(nèi)源性酶本身會(huì)對(duì)用對(duì)應(yīng)酶作標(biāo)識(shí)測(cè)定方法產(chǎn)生干擾。標(biāo)本貯存時(shí)間過(guò)長(zhǎng)：標(biāo)本在2-8℃保留時(shí)間過(guò)長(zhǎng)，IgG可聚合成多聚體，在間接法ELISA測(cè)定中會(huì)造成本底過(guò)深甚至假陽(yáng)性。臨床免疫學(xué)檢驗(yàn)技術(shù)第41頁(yè)外源性干擾：標(biāo)本凝固不全：血液采集后如搜集管中促凝劑和抗凝劑，血液普通在半小時(shí)后開(kāi)始凝固。在臨床工作中可能因?yàn)橼s時(shí)間而在血液還未凝固之前就強(qiáng)行離心分離血清，此時(shí)分離“血清”可能殘留有部分纖維蛋白原，在ELISA測(cè)定過(guò)程中形成纖維蛋白而沉積、吸附在酶標(biāo)板內(nèi)，而常規(guī)洗板難以完全去除。臨床免疫學(xué)檢驗(yàn)技術(shù)第42頁(yè)溶血和非溶血、脂濁與非脂濁兩組樣品A值無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。AFP、RF、補(bǔ)體、本身抗體陽(yáng)性樣品吸光度值顯著高于對(duì)照組吸光度值,含有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,這可能是AFP、RF、補(bǔ)體和一些本身抗體能夠與固相一抗,標(biāo)識(shí)二抗Fc結(jié)合或影響它們結(jié)合而造成假陽(yáng)性三種不一樣溫育方式均會(huì)造成邊緣效應(yīng),中央孔和周圍孔吸光度有顯著性差異但水浴法溫育比較穩(wěn)定,邊緣效應(yīng)相對(duì)較小,孵箱法較大,微波法最為顯著。臨床免疫學(xué)檢驗(yàn)技術(shù)第43頁(yè)臨床免疫學(xué)檢驗(yàn)技術(shù)第44頁(yè)提議:①使用抗凝血標(biāo)本,便于標(biāo)本離心分離。②不抗凝血液標(biāo)本過(guò)夜之后才檢測(cè),讓血凝塊愈加好地收縮,讓標(biāo)本中非特異性物質(zhì)被充分地包裹,降低非特異性反應(yīng)所致假陽(yáng)性率[2]。③標(biāo)本離心時(shí),加大離心轉(zhuǎn)速,延長(zhǎng)離心時(shí)間,使紅細(xì)胞和纖維蛋白充分沉降,使標(biāo)本離心分離愈加徹底[3]④標(biāo)本加樣時(shí)防止加入紅細(xì)胞和/或纖維蛋白,防止這兩種干擾物質(zhì)對(duì)試驗(yàn)結(jié)果影響臨床免疫學(xué)檢驗(yàn)技術(shù)第45頁(yè)臨床免疫學(xué)檢驗(yàn)技術(shù)第46頁(yè)12份HBsAg陽(yáng)性血清標(biāo)本按常規(guī)檢測(cè),加顯色劑后,不加終止劑,在酶標(biāo)儀上每5min測(cè)一次410nmOD值42份HBsAg陽(yáng)性血清標(biāo)本做三排孔檢測(cè),每排分別加酶標(biāo)識(shí)抗體40μl、50μl、60μl,其余按說(shuō)明書操作并測(cè)定OD值。臨床免疫學(xué)檢驗(yàn)技術(shù)第47頁(yè)加酶結(jié)合物前放置不一樣時(shí)間得到抗HBc結(jié)果：隨機(jī)檢測(cè)44份抗HBc陰性血清樣品,加樣后室溫25℃分別放置0、5、10、15、20、30min后加入酶結(jié)合物,其后嚴(yán)格按說(shuō)明書操作。結(jié)果0、5、10、15、20、30min陽(yáng)性率分別為0、2.3%(1/44)、11.4%(5/44)、15.9%(7/44)、20.5%(9/44)、22.7%(10/44),與加入酶結(jié)合物0min組陽(yáng)性率相比較:5min組P>0.05,10min組P<0.05,其余各組P均<0.01。不一樣人員稀釋樣品所得到抗HBc結(jié)果將5份抗HBc臨界陰性血清混合,選擇4名檢驗(yàn)人員按照各自工作習(xí)慣對(duì)混合血清分別稀釋16孔(稀釋百分比為1∶30),同時(shí)用振蕩器平行稀釋16孔作為標(biāo)準(zhǔn)對(duì)照,將全部稀釋樣品隨機(jī)加入同一酶標(biāo)板中。試驗(yàn)結(jié)果顯示:4名檢驗(yàn)人員檢測(cè)結(jié)果(S/CO.x±s,A值)和標(biāo)準(zhǔn)對(duì)照結(jié)果分別為0.85±0.09、0.96±0.11、1.17±0.11、0.97±0.17、1.31±0.11,兩兩比較差異都有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義臨床免疫學(xué)檢驗(yàn)技術(shù)第48頁(yè)方法1：檢測(cè)樣本39℃水浴,反應(yīng)孔底部不接觸水面;方法2：37℃水浴,反應(yīng)孔底部2/3浸入水中;方法3：反應(yīng)板置37℃干式孵育箱孵育方法2、3之間無(wú)顯著性差異;方法2、3與方法1間差異有顯著性方法1液面上方溫度是經(jīng)過(guò)水溫進(jìn)行調(diào)整,所以反應(yīng)板孵育時(shí)升溫比較遲緩,到達(dá)平衡溫度所需時(shí)間也較長(zhǎng)。所以采取該方法對(duì)檢測(cè)結(jié)果影響較大。方法3孵育時(shí)反應(yīng)孔四面受熱均勻,所以反應(yīng)板到達(dá)平衡溫度時(shí)間要短于方法1,且反應(yīng)體系中各種物質(zhì)作用較為均勻,結(jié)果也比較穩(wěn)定。3種孵育方式均會(huì)產(chǎn)生不一樣程度邊緣效應(yīng)。其中方法1對(duì)結(jié)果影響最大臨床免疫學(xué)檢驗(yàn)技術(shù)第49頁(yè)三種不一樣溫育方式均會(huì)造成邊緣效應(yīng),中央孔和周圍孔吸光度有顯著性差異但水浴法溫育比較穩(wěn)定,邊緣效應(yīng)相對(duì)較小,孵箱法較大,微波法最為顯著。臨床免疫學(xué)檢驗(yàn)技術(shù)第50頁(yè)臨床免疫學(xué)檢驗(yàn)技術(shù)第51頁(yè)12份HBsAg陽(yáng)性血清標(biāo)本按常規(guī)檢測(cè),加顯色劑后,不加終止劑,在酶標(biāo)儀上每5min測(cè)一次410nmOD值42份HBsAg陽(yáng)性血清標(biāo)本做三排孔檢測(cè),每排分別加酶標(biāo)識(shí)抗體40μl、50μl、60μl,其余按說(shuō)明書操作并測(cè)定OD值。臨床免疫學(xué)檢驗(yàn)技術(shù)第52頁(yè)加終止液后伴隨時(shí)間增加,A值逐步下降。而且濃度越高其A值隨時(shí)間下降越快。但弱陽(yáng)性HBsAg質(zhì)控物,其A值并不隨時(shí)間增加而改變,在終止反應(yīng)后28min內(nèi)一直處于同一水平；HBsAg、抗HBs、HBeAg三項(xiàng)結(jié)果陰陽(yáng)性判斷似乎不受時(shí)間影響,其原因有待深入研究。但對(duì)于競(jìng)爭(zhēng)法而言,可能會(huì)產(chǎn)生假陽(yáng)性或假陰性結(jié)果,所以提議在終止反應(yīng)后馬上比色。臨床免疫學(xué)檢驗(yàn)技術(shù)第53頁(yè)同時(shí)稀釋測(cè)定法PEG法:酶標(biāo)二抗試劑中加入4%PEG600振動(dòng)態(tài)ELISA法:，該方法可將HOOK效應(yīng)發(fā)生臨界濃度降低兩個(gè)稀釋度盡可能選擇測(cè)定范圍寬試劑盒；每一批號(hào)試劑盒隨樣本做高濃度質(zhì)控(10000ng/ml)：臨床免疫學(xué)檢驗(yàn)技術(shù)第54頁(yè)注：計(jì)算公式：依據(jù)正態(tài)分布u檢驗(yàn)單側(cè)99.5%可信限，u值=2.58臨床免疫學(xué)檢驗(yàn)技術(shù)第55頁(yè)上海市臨床試驗(yàn)室質(zhì)量管理基本內(nèi)容和要求（年）:

復(fù)檢范圍確實(shí)定按以下公式計(jì)算：cutoff值×0.8≤樣品測(cè)定值≤cutoff值×3，不得小于此范圍。臨床免疫學(xué)檢驗(yàn)技術(shù)第56頁(yè)以(CO-2s)作為陽(yáng)性低限判斷值,其中s值是以衛(wèi)生部臨檢中心臨界質(zhì)控血清(HBsAg1ng/ml,抗HCV2NCU/mlRCVK所測(cè)得s值。CO至(CO—2s)范圍稱為灰區(qū)。理由為:國(guó)產(chǎn)試劑盒CO普通是以陰性對(duì)照A值加或乘一個(gè)常數(shù)得出,陰性對(duì)照是小牛血清而非人血清,A值不超出0105即按0105計(jì)算,亦即CO為一不變常數(shù),這么就忽略了試劑批間差、板間差和操作誤差;國(guó)產(chǎn)試劑靈敏度普遍不高,如HBsAg進(jìn)口試劑靈敏度為0.1～0.21ng/ml而國(guó)產(chǎn)試劑為0.5～11ng/ml,普通認(rèn)為0.11ng/ml即有傳染性。臨床免疫學(xué)檢驗(yàn)技術(shù)第57頁(yè)六、酶標(biāo)儀使用及維護(hù)1．酶標(biāo)儀基本原理酶標(biāo)儀實(shí)際上就是一臺(tái)變相專用光電比色計(jì)或分光光度計(jì)。光源燈發(fā)出光波經(jīng)過(guò)濾光片或單色器變成一束單色光，進(jìn)入塑料微孔板中待測(cè)標(biāo)本，該單色光一部分被標(biāo)本吸收，另部分則透過(guò)標(biāo)