蛋白質(zhì)化學1課件

第三

章

蛋白質(zhì)化學

ChemistryofProtein第一節(jié)

通論

一、蛋白質(zhì)的化學概念

蛋白質(zhì)（protein）是由許多氨基酸（aminoacids）通過肽鍵（peptidebond）相連形成的有特定空間結構和生物學活性的高分子含氮化合物。2.蛋白質(zhì)具有重要的生物學功能作為生物催化劑（酶）代謝調(diào)節(jié)作用（胰島素）免疫保護作用（抗體）物質(zhì)的轉(zhuǎn)運和存儲（血紅蛋白、乳-酪蛋白）運動與支持作用（肌動蛋白、微管蛋白接頭蛋白）參與細胞間信息傳遞（膜受體蛋白）3.氧化供能*根據(jù)蛋白質(zhì)組成成分

單純蛋白質(zhì)（SimpleProtein）結合蛋白質(zhì)（ConjugateProtein）

=蛋白質(zhì)部分+非蛋白質(zhì)部分

*根據(jù)蛋白質(zhì)形狀

纖維狀蛋白質(zhì)（FibrouseProtein）：難溶于水，結構蛋白

球狀蛋白質(zhì)（GlobularProtein）：多溶于水，功能蛋白

三、蛋白質(zhì)的分類

*根據(jù)蛋白質(zhì)功能

/溶解度

纖維狀蛋白質(zhì)和球狀蛋白質(zhì)

各種蛋白質(zhì)的含氮量很接近，平均為16％。可通過測定含氮量來計算蛋白質(zhì)：蛋白質(zhì)含量=蛋白氮×6.251/16%蛋白質(zhì)元素組成的特點第二節(jié)

蛋白質(zhì)的組成單位

——氨基酸一、氨基酸一般結構特征蛋白質(zhì)在酸、堿或酶的作用下，水解為氨基酸（AminoAcid）——蛋白質(zhì)的基本結構單位。存在自然界中的氨基酸有數(shù)百種，但組成生物體蛋白質(zhì)的氨基酸（編碼氨基酸）主要有20種。

2個特殊氨基酸

脯氨酸（亞氨基酸）氨基酸的構型

組成蛋白質(zhì)的氨基酸除Gly（R=H）以外都有手性碳原子，在三維空間上就有兩種不同的排列方式，它們互為鏡影，這兩種不同的構型分別稱為D-型和L-型。二、氨基酸的分類和結構酸堿性：中性、酸性、堿性R基結構：脂肪、芳香、雜環(huán)R基物理性質(zhì)：疏水、親水R基結構：含非極性R基團的氨基酸（甲硫氨酸）含極性不帶電荷R基團的氨基酸

三、蛋白質(zhì)中修飾性氨基酸

四、非蛋白質(zhì)氨基酸五、氨基酸的一般性質(zhì)

無色晶體或粉末狀熔點高：>200°C

紫外吸收性質(zhì)：芳香、雜環(huán)氨基酸旋光性：Gly除外溶解性：一般溶于水、稀酸堿；不溶于有機溶劑旋光性

組成蛋白質(zhì)的氨基酸除Gly以外，都有手性碳原子，所以都有旋光性，能使偏振光的偏振面的向左或向右旋轉(zhuǎn)，向左旋轉(zhuǎn)的稱左旋，用“一”號表示，向右旋轉(zhuǎn)的稱右旋，用“＋”號表示。旋光物質(zhì)L-（-）-蘇氨酸D-（+）-蘇氨酸氨基酸為兩性離子（兼性離子、偶極離子）兩性離子(dipolarion)氨基酸在晶體或在水中主要以兼性離子形式存在氨基酸是兩性電解質(zhì)酸（供氫體）堿（受氫體）氨基酸的等電點（isoelectricpoint，pI）

在一定的pH條件下，氨基酸分子中所帶的正電荷和負電荷數(shù)相等，即凈電荷為零，此時溶液的pH稱為該氨基酸的等電點(isoelectricpoint,pI)

。氨基酸在等電點時溶解度最小。正離子pH<pI兩性離子pH=pI負離子pH>pI+OH-+H++OH-+H+

實驗證明在等電點時，氨基酸主要以兩性離子形式存在，但也有少量的而且數(shù)量相等的正、負離子形式，還有極少量的中性分子。

氨基酸等電點決定于可解離基團氨基酸等電點的計算解離常數(shù)：pK值pK1

pK2

K1=[A±][H+][A+]K2=[A-][H+][A±]完全質(zhì)子化多元酸Henderson-Hasselbalch方程：pH=pKa+lg[質(zhì)子受體][質(zhì)子供體]pK值：指某種解離基團有一半被解離時的pH值。A±A-A+甘氨酸酸

堿滴定曲線pK1pK22.349.60Gly等電點的計算K1=[Gly±][H+][Gly+]K2=[Gly-][H+][Gly±]pI時，[Gly+]=[Gly-]則：=[Gly±][H+]K1[Gly±]K2[H+]

[H+]2=K1K2pH=（pK1+pK2）/2pI=（pK1+pK2）/2pI=（2.34+9.60）/2=5.97Gly谷氨酸酸堿滴定曲線pK2pK1pK3Glu等電點的計算pK1pK2pK32.199.674.24pI=（pK1+pK2）/2=(2.19+4.25)=3.22賴氨酸酸堿滴定曲線pK2pK1pK3Lys等電點的計算pK2pK1pK32.1810.538.95pI=（pK2+pK3）/2=(8.95+10.53)=9.742.氨基酸的化學反應茚三酮反應亞硝酸反應甲醛的反應2.4—二硝基氟苯反應（FDNB）與苯異硫氰酸（酯）的反應二甲基氨基萘磺酰氯反應（DNS-Cl）氨基酸與酰化劑（芐氧羰酰氯）的反應成鹽和成酯反應

茚三酮反應

氨基酸與茚三酮水合物弱酸條件下共熱，可生成藍紫色化合物，其最大吸收峰在570nm處。由于此吸收峰值與氨基酸的含量存在正比關系，因此可作為氨基酸定量分析方法。Pro——黃色（440nm）氨、胺不放CO2亞硝酸反應氨基酸羥酸用途：氨基酸定量；蛋白質(zhì)水解程度測定甲醛滴定甲醛反應

一羥甲基衍生物二羥甲基衍生物pH=pK+log[H2NCH2COO-][H3+NCH2COO-]+OH-弱酸2.4-二硝基氟苯（FDNB/DNFB）反應（Sanger）

室溫

pH8-9FDNBDNP-氨基酸（黃色）苯異硫氰酸（PITC，Edman反應）PITCPTC-氨基酸PTH-氨基酸PTC：苯氨基硫甲酰；PTH：苯乙內(nèi)酰硫脲5-二甲氨基萘-1-磺酰氯(DNS-Cl)反應用途：N端氨基酸標記；微量氨基酸定量熒光?；磻S氧羰酰氯芐氧羰酰-氨基酸用途：蛋白質(zhì)人工合成中氨基保護劑成鹽和成酯反應七、氨基酸的分離和分析鑒定蛋白質(zhì)的水解→氨基酸混合物酸水解：6mol/LHCl,110–120?C,24h

堿水解：5mol/LNaOH110?C,24h

酶水解：（部分水解）氨基酸的分離鑒定

紙層析

薄層層析離子交換柱層析

紙層析(paperchromatography)

紙層析是以濾紙為惰性支持物的分配層析。濾紙纖維上的羥基具有親水性，吸附一層水作為固定相，有機溶劑為流動相。有機相流經(jīng)固定相支持物時，與固定相之間連續(xù)抽提，使物質(zhì)在兩相間不斷分配而得到分離。溶質(zhì)在濾紙上的移動速度用Rf值表示：（物質(zhì)結構、溶劑系統(tǒng)的物質(zhì)組成等因素都會影響Rf值）Rf

＝

原點到層析斑點中心的距離原點到溶劑前沿的距離原點前沿雙向紙層析薄層層析（thin-layerchromatography

）

以硅膠、氧化鋁、纖維素粉等為支持劑支持劑涂布于玻璃板上→均勻薄層樣品滴加在薄層一端離子交換柱層析（ion-exchangecolumnchromatography）

以離子交換樹脂作為支持物，離子交換樹脂上的活性基團可與溶液中的離子（氨基酸）進行交換反應，由于各種離子交換能力不同，與樹脂結合的牢固程度就不同，在洗脫過程中，各種離子以不同的速度移動，從而達到分離的目的。離子交換樹脂：

人工合成的聚苯乙烯一苯二乙烯組成的具有網(wǎng)狀結構的高分子聚合物陽離子交換樹脂陰離子交換樹脂AA2.975.689.74第三節(jié)

蛋白質(zhì)的結構

自然界存在的蛋白質(zhì)1010-1012組成蛋白質(zhì)的氨基酸——20種20世紀50年代初，Linderstron-Long：蛋白質(zhì)具有不同結構層次

一級結構(primarystructure)二級結構(secondarystructure)三級結構(tertiarystructure)四級結構(quaternarystructure)高級結構蛋白質(zhì)的分子結構包括:一、蛋白質(zhì)的一級結構(primarystructure)

定義蛋白質(zhì)的一級結構指多肽鏈中氨基酸的排列順序和連接方式。主要的化學鍵肽鍵，有些蛋白質(zhì)還包括二硫鍵。(Peptidebond,Disulfidebond)

1.肽鍵和肽鏈肽鍵(peptidebond):

一個氨基酸的-羧基與另一個氨基酸的-氨基脫水縮合而形成的共價鍵，又稱酰胺鍵

。+-HOH甘氨酰甘氨酸肽鍵肽鍵的形成+胱氨酸二硫鍵-HH

二硫鍵的形成半胱氨酸肽和多肽鏈*

肽：氨基酸通過肽鍵縮合而形成的化合物。*兩分子氨基酸縮合形成二肽，三分子氨基酸縮合則形成三肽……*由少于10個氨基酸相連而成的肽稱為寡肽(oligopeptide)，由更多的氨基酸相連形成的肽稱多肽(polypeptide)。*多肽鏈(polypeptidechain)是指許多氨基酸之間以肽鍵連接而成的一種結構。

多肽鏈的特點*氨基酸殘基(residue)：肽鏈中的氨基酸分子因為脫水縮合而基團不全。*多肽鏈有兩端:(Amino,Carboxylterminal)N末端：多肽鏈中有自由氨基的一端

C末端：多肽鏈中有自由羧基的一端*結構骨干(Backbone)

由-N-Cα-C-重復排列N：酰胺氮，

Cα：手性碳原子，C：羰基碳

一級結構的含義、特點和意義

含義：氨基酸種類：≤20氨基酸數(shù)目：總數(shù)，每種氨基酸數(shù)目氨基酸連接次序特點：方向性多樣性意義：生物學功能的基礎空間結構的基礎

2.幾種生物活性肽

谷胱甘肽(glutathione,GSH)多肽類激素及神經(jīng)肽體內(nèi)許多激素屬寡肽或多肽多肽抗菌素

↓革蘭氏陽性菌

神經(jīng)肽(neuropeptide)

腦啡肽（高等動物腦組織）：內(nèi)源性嗎啡樣活性物質(zhì)，鎮(zhèn)痛蛋氨酸腦啡肽：H—Tyr-Gly-Gly-Phe-Met—OH亮氨酸腦啡肽：H—Tyr-Gly-Gly-Phe-Leu—OH含腦啡肽的神經(jīng)元與疼痛

SP：P物質(zhì)-神經(jīng)末梢釋放興奮遞質(zhì)E:腦啡肽-與阿片受體結合，減少感覺神經(jīng)末梢釋放P物質(zhì)3.肽鏈的表示方式N端C端胰島素（Insulin）4.一級結構的測定意義：闡明蛋白質(zhì)活性中心了解結構與功能的關系說明分子進化、遺傳與變異等現(xiàn)象了解分子病發(fā)病機制人工合成蛋白質(zhì)測定步驟

純化蛋白質(zhì)樣品測定蛋白質(zhì)的分子量和氨基酸組成氨基酸末端分析（N-端、C-端）肽鏈的拆分

肽鏈的部分水解分離純化各肽段并采用Edman(PITC)降解法測序用重疊法推斷肽鏈全部氨基酸序列二硫鍵的定位氨基酸末端分析N端分析方法

2．4-二硝基氟苯法（FDNB）苯異硫氰酸法（PITC）二甲基氨基萘磺酰氯（DNS-Cl）C端分析方法肼解法羧肽酶法2．4-二硝基氟苯法（FDNB）SangerpH8-96mol/LHClDNP肽乙酸乙酯抽提后只有DNP-氨基酸留在有機相DNP-氨基酸（黃色）苯異硫氰酸法（PITC）/Edman降解法

加熱Δ二甲基氨基萘磺酰氯（DNS-Cl）肼解法羧肽酶法

羧肽酶（carboxypeptidase

）：作用于肽鏈的游離羧基末端釋放單個氨基酸。羧肽酶A:除Lys,Ar