蛋白質(zhì)化學(xué)1課件

第三

章

蛋白質(zhì)化學(xué)

ChemistryofProtein第一節(jié)

通論

一、蛋白質(zhì)的化學(xué)概念

蛋白質(zhì)（protein）是由許多氨基酸（aminoacids）通過(guò)肽鍵（peptidebond）相連形成的有特定空間結(jié)構(gòu)和生物學(xué)活性的高分子含氮化合物。2.蛋白質(zhì)具有重要的生物學(xué)功能作為生物催化劑（酶）代謝調(diào)節(jié)作用（胰島素）免疫保護(hù)作用（抗體）物質(zhì)的轉(zhuǎn)運(yùn)和存儲(chǔ)（血紅蛋白、乳-酪蛋白）運(yùn)動(dòng)與支持作用（肌動(dòng)蛋白、微管蛋白接頭蛋白）參與細(xì)胞間信息傳遞（膜受體蛋白）3.氧化供能*根據(jù)蛋白質(zhì)組成成分

單純蛋白質(zhì)（SimpleProtein）結(jié)合蛋白質(zhì)（ConjugateProtein）

=蛋白質(zhì)部分+非蛋白質(zhì)部分

*根據(jù)蛋白質(zhì)形狀

纖維狀蛋白質(zhì)（FibrouseProtein）：難溶于水，結(jié)構(gòu)蛋白

球狀蛋白質(zhì)（GlobularProtein）：多溶于水，功能蛋白

三、蛋白質(zhì)的分類

*根據(jù)蛋白質(zhì)功能

/溶解度

纖維狀蛋白質(zhì)和球狀蛋白質(zhì)

各種蛋白質(zhì)的含氮量很接近，平均為16％?？赏ㄟ^(guò)測(cè)定含氮量來(lái)計(jì)算蛋白質(zhì)：蛋白質(zhì)含量=蛋白氮×6.251/16%蛋白質(zhì)元素組成的特點(diǎn)第二節(jié)

蛋白質(zhì)的組成單位

——氨基酸一、氨基酸一般結(jié)構(gòu)特征蛋白質(zhì)在酸、堿或酶的作用下，水解為氨基酸（AminoAcid）——蛋白質(zhì)的基本結(jié)構(gòu)單位。存在自然界中的氨基酸有數(shù)百種，但組成生物體蛋白質(zhì)的氨基酸（編碼氨基酸）主要有20種。

2個(gè)特殊氨基酸

脯氨酸（亞氨基酸）氨基酸的構(gòu)型

組成蛋白質(zhì)的氨基酸除Gly（R=H）以外都有手性碳原子，在三維空間上就有兩種不同的排列方式，它們互為鏡影，這兩種不同的構(gòu)型分別稱為D-型和L-型。二、氨基酸的分類和結(jié)構(gòu)酸堿性：中性、酸性、堿性R基結(jié)構(gòu)：脂肪、芳香、雜環(huán)R基物理性質(zhì)：疏水、親水R基結(jié)構(gòu)：含非極性R基團(tuán)的氨基酸（甲硫氨酸）含極性不帶電荷R基團(tuán)的氨基酸

三、蛋白質(zhì)中修飾性氨基酸

四、非蛋白質(zhì)氨基酸五、氨基酸的一般性質(zhì)

無(wú)色晶體或粉末狀熔點(diǎn)高：>200°C

紫外吸收性質(zhì)：芳香、雜環(huán)氨基酸旋光性：Gly除外溶解性：一般溶于水、稀酸堿；不溶于有機(jī)溶劑旋光性

組成蛋白質(zhì)的氨基酸除Gly以外，都有手性碳原子，所以都有旋光性，能使偏振光的偏振面的向左或向右旋轉(zhuǎn)，向左旋轉(zhuǎn)的稱左旋，用“一”號(hào)表示，向右旋轉(zhuǎn)的稱右旋，用“＋”號(hào)表示。旋光物質(zhì)L-（-）-蘇氨酸D-（+）-蘇氨酸氨基酸為兩性離子（兼性離子、偶極離子）兩性離子(dipolarion)氨基酸在晶體或在水中主要以兼性離子形式存在氨基酸是兩性電解質(zhì)酸（供氫體）堿（受氫體）氨基酸的等電點(diǎn)（isoelectricpoint，pI）

在一定的pH條件下，氨基酸分子中所帶的正電荷和負(fù)電荷數(shù)相等，即凈電荷為零，此時(shí)溶液的pH稱為該氨基酸的等電點(diǎn)(isoelectricpoint,pI)

。氨基酸在等電點(diǎn)時(shí)溶解度最小。正離子pH<pI兩性離子pH=pI負(fù)離子pH>pI+OH-+H++OH-+H+

實(shí)驗(yàn)證明在等電點(diǎn)時(shí)，氨基酸主要以兩性離子形式存在，但也有少量的而且數(shù)量相等的正、負(fù)離子形式，還有極少量的中性分子。

氨基酸等電點(diǎn)決定于可解離基團(tuán)氨基酸等電點(diǎn)的計(jì)算解離常數(shù)：pK值pK1

pK2

K1=[A±][H+][A+]K2=[A-][H+][A±]完全質(zhì)子化多元酸Henderson-Hasselbalch方程：pH=pKa+lg[質(zhì)子受體][質(zhì)子供體]pK值：指某種解離基團(tuán)有一半被解離時(shí)的pH值。A±A-A+甘氨酸酸

堿滴定曲線pK1pK22.349.60Gly等電點(diǎn)的計(jì)算K1=[Gly±][H+][Gly+]K2=[Gly-][H+][Gly±]pI時(shí)，[Gly+]=[Gly-]則：=[Gly±][H+]K1[Gly±]K2[H+]

[H+]2=K1K2pH=（pK1+pK2）/2pI=（pK1+pK2）/2pI=（2.34+9.60）/2=5.97Gly谷氨酸酸堿滴定曲線pK2pK1pK3Glu等電點(diǎn)的計(jì)算pK1pK2pK32.199.674.24pI=（pK1+pK2）/2=(2.19+4.25)=3.22賴氨酸酸堿滴定曲線pK2pK1pK3Lys等電點(diǎn)的計(jì)算pK2pK1pK32.1810.538.95pI=（pK2+pK3）/2=(8.95+10.53)=9.742.氨基酸的化學(xué)反應(yīng)茚三酮反應(yīng)亞硝酸反應(yīng)甲醛的反應(yīng)2.4—二硝基氟苯反應(yīng)（FDNB）與苯異硫氰酸（酯）的反應(yīng)二甲基氨基萘磺酰氯反應(yīng)（DNS-Cl）氨基酸與?；瘎ㄆS氧羰酰氯）的反應(yīng)成鹽和成酯反應(yīng)

茚三酮反應(yīng)

氨基酸與茚三酮水合物弱酸條件下共熱，可生成藍(lán)紫色化合物，其最大吸收峰在570nm處。由于此吸收峰值與氨基酸的含量存在正比關(guān)系，因此可作為氨基酸定量分析方法。Pro——黃色（440nm）氨、胺不放CO2亞硝酸反應(yīng)氨基酸羥酸用途：氨基酸定量；蛋白質(zhì)水解程度測(cè)定甲醛滴定甲醛反應(yīng)

一羥甲基衍生物二羥甲基衍生物pH=pK+log[H2NCH2COO-][H3+NCH2COO-]+OH-弱酸2.4-二硝基氟苯（FDNB/DNFB）反應(yīng)（Sanger）

室溫

pH8-9FDNBDNP-氨基酸（黃色）苯異硫氰酸（PITC，Edman反應(yīng)）PITCPTC-氨基酸PTH-氨基酸PTC：苯氨基硫甲酰；PTH：苯乙內(nèi)酰硫脲5-二甲氨基萘-1-磺酰氯(DNS-Cl)反應(yīng)用途：N端氨基酸標(biāo)記；微量氨基酸定量熒光?；磻?yīng)芐氧羰酰氯芐氧羰酰-氨基酸用途：蛋白質(zhì)人工合成中氨基保護(hù)劑成鹽和成酯反應(yīng)七、氨基酸的分離和分析鑒定蛋白質(zhì)的水解→氨基酸混合物酸水解：6mol/LHCl,110–120?C,24h

堿水解：5mol/LNaOH110?C,24h

酶水解：（部分水解）氨基酸的分離鑒定

紙層析

薄層層析離子交換柱層析

紙層析(paperchromatography)

紙層析是以濾紙為惰性支持物的分配層析。濾紙纖維上的羥基具有親水性，吸附一層水作為固定相，有機(jī)溶劑為流動(dòng)相。有機(jī)相流經(jīng)固定相支持物時(shí)，與固定相之間連續(xù)抽提，使物質(zhì)在兩相間不斷分配而得到分離。溶質(zhì)在濾紙上的移動(dòng)速度用Rf值表示：（物質(zhì)結(jié)構(gòu)、溶劑系統(tǒng)的物質(zhì)組成等因素都會(huì)影響Rf值）Rf

＝

原點(diǎn)到層析斑點(diǎn)中心的距離原點(diǎn)到溶劑前沿的距離原點(diǎn)前沿雙向紙層析薄層層析（thin-layerchromatography

）

以硅膠、氧化鋁、纖維素粉等為支持劑支持劑涂布于玻璃板上→均勻薄層樣品滴加在薄層一端離子交換柱層析（ion-exchangecolumnchromatography）

以離子交換樹脂作為支持物，離子交換樹脂上的活性基團(tuán)可與溶液中的離子（氨基酸）進(jìn)行交換反應(yīng)，由于各種離子交換能力不同，與樹脂結(jié)合的牢固程度就不同，在洗脫過(guò)程中，各種離子以不同的速度移動(dòng)，從而達(dá)到分離的目的。離子交換樹脂：

人工合成的聚苯乙烯一苯二乙烯組成的具有網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)的高分子聚合物陽(yáng)離子交換樹脂陰離子交換樹脂AA2.975.689.74第三節(jié)

蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)

自然界存在的蛋白質(zhì)1010-1012組成蛋白質(zhì)的氨基酸——20種20世紀(jì)50年代初，Linderstron-Long：蛋白質(zhì)具有不同結(jié)構(gòu)層次

一級(jí)結(jié)構(gòu)(primarystructure)二級(jí)結(jié)構(gòu)(secondarystructure)三級(jí)結(jié)構(gòu)(tertiarystructure)四級(jí)結(jié)構(gòu)(quaternarystructure)高級(jí)結(jié)構(gòu)蛋白質(zhì)的分子結(jié)構(gòu)包括:一、蛋白質(zhì)的一級(jí)結(jié)構(gòu)(primarystructure)

定義蛋白質(zhì)的一級(jí)結(jié)構(gòu)指多肽鏈中氨基酸的排列順序和連接方式。主要的化學(xué)鍵肽鍵，有些蛋白質(zhì)還包括二硫鍵。(Peptidebond,Disulfidebond)

1.肽鍵和肽鏈肽鍵(peptidebond):

一個(gè)氨基酸的-羧基與另一個(gè)氨基酸的-氨基脫水縮合而形成的共價(jià)鍵，又稱酰胺鍵

。+-HOH甘氨酰甘氨酸肽鍵肽鍵的形成+胱氨酸二硫鍵-HH

二硫鍵的形成半胱氨酸肽和多肽鏈*

肽：氨基酸通過(guò)肽鍵縮合而形成的化合物。*兩分子氨基酸縮合形成二肽，三分子氨基酸縮合則形成三肽……*由少于10個(gè)氨基酸相連而成的肽稱為寡肽(oligopeptide)，由更多的氨基酸相連形成的肽稱多肽(polypeptide)。*多肽鏈(polypeptidechain)是指許多氨基酸之間以肽鍵連接而成的一種結(jié)構(gòu)。

多肽鏈的特點(diǎn)*氨基酸殘基(residue)：肽鏈中的氨基酸分子因?yàn)槊撍s合而基團(tuán)不全。*多肽鏈有兩端:(Amino,Carboxylterminal)N末端：多肽鏈中有自由氨基的一端

C末端：多肽鏈中有自由羧基的一端*結(jié)構(gòu)骨干(Backbone)

由-N-Cα-C-重復(fù)排列N：酰胺氮，

Cα：手性碳原子，C：羰基碳

一級(jí)結(jié)構(gòu)的含義、特點(diǎn)和意義

含義：氨基酸種類：≤20氨基酸數(shù)目：總數(shù)，每種氨基酸數(shù)目氨基酸連接次序特點(diǎn)：方向性多樣性意義：生物學(xué)功能的基礎(chǔ)空間結(jié)構(gòu)的基礎(chǔ)

2.幾種生物活性肽

谷胱甘肽(glutathione,GSH)多肽類激素及神經(jīng)肽體內(nèi)許多激素屬寡肽或多肽多肽抗菌素

↓革蘭氏陽(yáng)性菌

神經(jīng)肽(neuropeptide)

腦啡肽（高等動(dòng)物腦組織）：內(nèi)源性嗎啡樣活性物質(zhì)，鎮(zhèn)痛蛋氨酸腦啡肽：H—Tyr-Gly-Gly-Phe-Met—OH亮氨酸腦啡肽：H—Tyr-Gly-Gly-Phe-Leu—OH含腦啡肽的神經(jīng)元與疼痛

SP：P物質(zhì)-神經(jīng)末梢釋放興奮遞質(zhì)E:腦啡肽-與阿片受體結(jié)合，減少感覺(jué)神經(jīng)末梢釋放P物質(zhì)3.肽鏈的表示方式N端C端胰島素（Insulin）4.一級(jí)結(jié)構(gòu)的測(cè)定意義：闡明蛋白質(zhì)活性中心了解結(jié)構(gòu)與功能的關(guān)系說(shuō)明分子進(jìn)化、遺傳與變異等現(xiàn)象了解分子病發(fā)病機(jī)制人工合成蛋白質(zhì)測(cè)定步驟

純化蛋白質(zhì)樣品測(cè)定蛋白質(zhì)的分子量和氨基酸組成氨基酸末端分析（N-端、C-端）肽鏈的拆分

肽鏈的部分水解分離純化各肽段并采用Edman(PITC)降解法測(cè)序用重疊法推斷肽鏈全部氨基酸序列二硫鍵的定位氨基酸末端分析N端分析方法

2．4-二硝基氟苯法（FDNB）苯異硫氰酸法（PITC）二甲基氨基萘磺酰氯（DNS-Cl）C端分析方法肼解法羧肽酶法2．4-二硝基氟苯法（FDNB）SangerpH8-96mol/LHClDNP肽乙酸乙酯抽提后只有DNP-氨基酸留在有機(jī)相DNP-氨基酸（黃色）苯異硫氰酸法（PITC）/Edman降解法

加熱Δ二甲基氨基萘磺酰氯（DNS-Cl）肼解法羧肽酶法

羧肽酶（carboxypeptidase

）：作用于肽鏈的游離羧基末端釋放單個(gè)氨基酸。羧肽酶A:除Lys,Ar