設(shè)計(jì)性試驗(yàn)半數(shù)致死量的測(cè)定

設(shè)計(jì)性試驗(yàn)半數(shù)致死量的測(cè)定第1頁(yè)，共18頁(yè)，2023年，2月20日，星期日實(shí)驗(yàn)八半數(shù)致死量的測(cè)定第2頁(yè)，共18頁(yè)，2023年，2月20日，星期日目的學(xué)習(xí)科研試驗(yàn)的設(shè)計(jì)和實(shí)施學(xué)會(huì)半數(shù)致死量的測(cè)定第3頁(yè)，共18頁(yè)，2023年，2月20日，星期日原理半數(shù)致死量(LD50)是指一個(gè)毒物在實(shí)驗(yàn)生物的群體中可引起半數(shù)死亡的劑量。在毒理學(xué)中常用以測(cè)試某一化學(xué)物的急性毒性。最為原始的急性毒性指標(biāo)是最小致死量(MLD)和絕對(duì)致死量(LD100)。前者指在一個(gè)群體中僅僅足夠引起個(gè)別生物死亡的劑量，后者指生物群體中全部出現(xiàn)死亡的劑量。但如果所用的動(dòng)物數(shù)增多，則在一定范圍內(nèi)，還可能發(fā)現(xiàn)更為敏感的或耐受的動(dòng)物，則最小致死量將隨之不斷下降，而絕對(duì)致死量也可能不斷增高。因此，這種方法所取得的參數(shù)是不夠正確的，目前已少采用。如用動(dòng)物實(shí)驗(yàn)制得劑量-反應(yīng)曲線，再用統(tǒng)計(jì)學(xué)方法予以處理，所得半數(shù)致死量，則較有代表性，因此，它已成為常用的指標(biāo)。毒物的毒性是LD50的倒數(shù)，即LD50的數(shù)值越小，毒性越高。反之亦然。在毒物的毒性分級(jí)中，常根據(jù)LD50的大小將毒性分成劇毒、高毒、中毒、低毒，或?qū)嶋H無(wú)毒等數(shù)級(jí)。

第4頁(yè)，共18頁(yè)，2023年，2月20日，星期日步驟LD50的理論依據(jù)是：將一群動(dòng)物(如50只)等分為五組，每組給予不同劑量，各組有不同的死亡率，以毒物劑量作橫軸，死亡百分率為縱軸制成曲線，則得到一個(gè)長(zhǎng)尾的S形曲線(如左圖)。圖中可以看出，在低劑量或高劑量處，劑量改變對(duì)動(dòng)物的死亡率影響較小，而在曲線中段，即在50%死亡率附近，坡度較陡，劑量稍有增減，即能引起死亡率的急劇改變。所以，使用半數(shù)致死量作為毒物急性作用的指標(biāo)是最敏感、最有代表性的。。

第5頁(yè)，共18頁(yè)，2023年，2月20日，星期日如動(dòng)物吸入毒物，以毒物在空氣中的濃度表示劑量，則稱為半數(shù)致死濃度(LC50)。動(dòng)物種類和染毒途徑不同，LD50也各異。因此在表示LD50或LC50時(shí)，必須注明動(dòng)物種類及染毒途徑等實(shí)驗(yàn)條件。使用LC50時(shí)，還需規(guī)定吸入的時(shí)間或注明具體時(shí)間。但在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中，不可能用一次實(shí)驗(yàn)的結(jié)果代表該種屬總體的50%死亡率的劑量，故必須將實(shí)驗(yàn)結(jié)果用統(tǒng)計(jì)學(xué)方法處理。由于動(dòng)物群體的劑量-死亡數(shù)是一個(gè)偏態(tài)曲線(如右圖)，直接用統(tǒng)計(jì)學(xué)方法處理將產(chǎn)生困難，必須將實(shí)驗(yàn)結(jié)果予以轉(zhuǎn)換。

第6頁(yè)，共18頁(yè)，2023年，2月20日，星期日其方法是將橫軸中的劑量改成對(duì)數(shù)，使它轉(zhuǎn)換成正態(tài)分布的曲線(如右上圖)，則劑量對(duì)數(shù)與死亡百分率便成一個(gè)對(duì)稱的S形曲線(如右中圖)。為使計(jì)算更為方便，還須再將對(duì)稱S形曲線的死亡率轉(zhuǎn)換為概率單位，使之轉(zhuǎn)換成直線(如右下圖)。

第7頁(yè)，共18頁(yè)，2023年，2月20日，星期日這樣可按直線方程式y(tǒng)=bx+a計(jì)算，獲得各種指標(biāo)。該方程式表示直線內(nèi)x和y值的關(guān)系，x代表劑量對(duì)數(shù)，y代表死亡百分率，用直線上的死亡率50%處的劑量對(duì)數(shù)，查其反對(duì)數(shù)，即得實(shí)際的劑量。a是常數(shù)，亦稱截距，即x=0時(shí)的y值，亦即代表在不給毒物時(shí)，動(dòng)物自然死亡的估計(jì)。從這曲線上可查得最小致死量和絕對(duì)致死量，分別用LD1、LD99或LD5、LD95表示，也可用直線方程式計(jì)算出來(lái)。從公式也可算得LD0，即最大耐受量，它是使動(dòng)物中毒而尚未致死的最大劑量或濃度。它與LD100一樣，受到個(gè)別動(dòng)物的敏感度的影響太大，往往不夠準(zhǔn)確。而且在統(tǒng)計(jì)理論上，正態(tài)曲線向左右伸展，綿延無(wú)窮，找不出與LD0或LD100相應(yīng)的概率單位。由于實(shí)驗(yàn)資料具有抽樣性質(zhì)，所算出的LD50存在一定的抽樣誤差，故必須計(jì)算其95%可信限。它由LD50值加減1.96倍標(biāo)準(zhǔn)誤后所形成的高限和低限兩個(gè)值組成。

第8頁(yè)，共18頁(yè)，2023年，2月20日，星期日直線方程式中b是直線的斜率，表示該直線的斜度。斜率愈大，表示該毒物的劑量有微小改變時(shí)，即能引起死亡率的較大改變，所以可通過(guò)斜率比較兩種以上LD50相近的毒物的毒性性質(zhì)，或比較一種毒物在幾種不同染毒途徑時(shí)，表示一種實(shí)驗(yàn)動(dòng)物對(duì)該毒物敏感性的分布，斜率越大的直線，表示該毒物(或染毒方式)的毒性越大。如果直線的斜率相等，則表示毒物的毒性也基本相似。經(jīng)過(guò)統(tǒng)計(jì)學(xué)處理的LD50的斜率，比LD50本身有更多的意義。如下圖所示，A和B是兩種不同毒物，它們的斜率不同，但有相同的LD50。此外，斜率平緩，說(shuō)明毒物的吸收差，解毒和排泄快，或毒作用的特異性差(如煤油)。斜率陡峭常說(shuō)明毒物吸收快，出現(xiàn)毒作用快，并具有重要的特異性毒作用(如氰化物)。第9頁(yè)，共18頁(yè)，2023年，2月20日，星期日結(jié)果判定在實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)時(shí)應(yīng)有一定的要求。應(yīng)把動(dòng)物分成若干組，每組動(dòng)物數(shù)量最好相等，分別給予不同劑量的試驗(yàn)毒物。兩組間的組距應(yīng)按幾何級(jí)數(shù)依次增加，通常在1.3～1.5范圍。例如第一組(最低組)劑量為0.2mg/kg，則第二組應(yīng)為0.2×1.3=0.26mg/kg，第三組應(yīng)為0.26×1.3=0.34mg/kg，余依次類推。

第10頁(yè)，共18頁(yè)，2023年，2月20日，星期日預(yù)實(shí)驗(yàn)方法為了節(jié)省動(dòng)物，應(yīng)進(jìn)行預(yù)試以了解該毒物的大致LD50范圍。預(yù)試的方法很多。一般可先用9只動(dòng)物，以三種不同劑量的毒物處理。劑量間距離可大些(例如10倍)。如低劑量組為1mg/kg，則第二組為10mg/kg，第三組為100mg/kg。如三組動(dòng)物均無(wú)死亡，劑量可再向上增大，再用9只動(dòng)物試驗(yàn)。如三組動(dòng)物均死去，則應(yīng)向下減少劑量再作試驗(yàn)。如第一組動(dòng)物未死，第二、三組動(dòng)物死去，即可假定大致劑量在1～10mg/kg之間。此后可用下面介紹的方法進(jìn)一步試驗(yàn)，以獲得精確的LD50。

第11頁(yè)，共18頁(yè)，2023年，2月20日，星期日半數(shù)致死量的實(shí)驗(yàn)方法(1)目測(cè)概率法：簡(jiǎn)稱目測(cè)法或概率單位法。本法是基于前述基本理論而建立起來(lái)的。它要求實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)盡可能不出現(xiàn)死亡率0%及100%，因而其原始數(shù)據(jù)比較可靠。計(jì)算時(shí)首先列出在所試驗(yàn)劑量(濃度)下動(dòng)物的死亡情況，分別計(jì)算其死亡率。再以濃度對(duì)數(shù)作橫軸，死亡率的概率單位作縱軸，將各對(duì)數(shù)值點(diǎn)在方格紙上。然后順著各點(diǎn)分布趨勢(shì)，作一直線。最后從概率單位5.0處找出相應(yīng)的劑量(濃度)，即為所求的LD50(LC50)。

此法比較方便適用，目測(cè)的直線可通過(guò)卡方測(cè)驗(yàn)以檢驗(yàn)其是否合適。如果結(jié)果中理論頻數(shù)與實(shí)際頻數(shù)間有顯著差異，說(shuō)明所繪直線不當(dāng)，應(yīng)另作更適宜的直線，直至檢驗(yàn)合適為止。這樣求得的LD50是比較精確的。第12頁(yè)，共18頁(yè)，2023年，2月20日，星期日(2)加權(quán)直線回歸法(Bliss法，又名機(jī)率單位法或加權(quán)回歸法))：本法是在上述目測(cè)法的基礎(chǔ)上用正態(tài)曲線原理進(jìn)行加權(quán)后，計(jì)算直線回歸方程以求得LD50。這是計(jì)算LD50的最精確的方法。但由于計(jì)算過(guò)程比較復(fù)雜，實(shí)際應(yīng)用中常以此來(lái)鑒定和比較其他計(jì)算方法的正確性。第13頁(yè)，共18頁(yè)，2023年，2月20日，星期日(3)圖解法：此法是在概率圖紙上，直接用實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)作圖，求出LD50，不需繁瑣的計(jì)算過(guò)程。所用各種圖表的數(shù)學(xué)原理比較嚴(yán)密，故所得結(jié)果也比較精確。本法與加權(quán)直線回歸法同屬于求LD50的兩個(gè)經(jīng)典方法。第14頁(yè)，共18頁(yè)，2023年，2月20日，星期日(4)簡(jiǎn)化寇氏法：本法比較簡(jiǎn)便，為一般實(shí)驗(yàn)室中的常規(guī)方法。實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)時(shí)除要符合前述總的要求外，藥物反應(yīng)0%和100%組也可用。但由于0%和100%的變動(dòng)范圍大，會(huì)引進(jìn)誤差，這是寇氏法的不正確的所在。本法首先計(jì)算出各組死亡率，再用公式logLD50=xm-i(Σp-0.5)計(jì)算出LD50的對(duì)數(shù)值，經(jīng)查反對(duì)數(shù)值后即得。為了避免不必要的誤差，要求最大劑量組在100%～80%間，最小組在20%～0%之間，此時(shí)改用logLD50=xm-1/2i∑(pi+pi+1)公式。式中xm為最大劑量的對(duì)數(shù)，i為相鄰劑量的比值的對(duì)數(shù)，Σp為各組死亡率總和，(pi+pi+1)為相鄰兩組死亡率之和。另有改進(jìn)寇氏法。第15頁(yè)，共18頁(yè)，2023年，2月20日，星期日(5)序貫法：亦稱上下法。是選擇一系列按等比級(jí)數(shù)排列的數(shù)值，將動(dòng)物一只一只序貫地進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。此法適用于快速反應(yīng)試驗(yàn)，方法簡(jiǎn)便，節(jié)約動(dòng)物。操作時(shí)先選擇一個(gè)接近50%反應(yīng)率的劑量，當(dāng)動(dòng)物出現(xiàn)陰性反應(yīng)(不死)時(shí)，就用高一級(jí)劑量給予下一只動(dòng)物;反之，當(dāng)出現(xiàn)陽(yáng)性反應(yīng)(死亡)時(shí)，就改用低一級(jí)劑量給予下一只動(dòng)物。試驗(yàn)所需動(dòng)物應(yīng)在試驗(yàn)開始前就確定好。由于把劑量集中使用在50%反應(yīng)率上下，故可節(jié)省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物。但此法不易求得誤差，因此對(duì)兩種不同處理方法所求的LD50值，無(wú)法進(jìn)行顯著性測(cè)驗(yàn)，無(wú)從比較。

第16頁(yè)，共18頁(yè)，2023年，2月20日，星期日計(jì)算LD50的方法很多。上面所介紹的五種方法中，以加權(quán)直線回歸法最為精確，但其計(jì)算過(guò)程復(fù)雜，且必須先進(jìn)行目測(cè)法，故不作常規(guī)使用。圖解法中所用各種圖表的數(shù)學(xué)原理較嚴(yán)密，因而結(jié)果相當(dāng)精確。但畢竟手續(xù)較