食品酶學(xué)多酚氧化酶

食品酶學(xué)多酚氧化酶第1頁，共35頁，2023年，2月20日，星期日一、多酚氧化酶的

名稱和自然界的分布多酚氧化酶(1,2-苯二酚:氧氧化還原酶,EC1.10.3.1)

一類含銅的氧化還原酶，催化鄰-苯二酚氧化成鄰-苯二醌，也能作用于單酚單加氧酶的底物。多酚氧化酶的共同特征是能夠通過分子氧氧化酚或多酚形成對應(yīng)的醌。在廣義上，多酚氧化酶可分為三大類：單酚氧化酶(酪氨酸酶tyrosinase,EC.1.14.18.1)、雙酚氧化酶(兒茶酚氧化酶catecholoxidse,EC.1.10.3.2)和漆酶(對苯二酚氧化酶laccase,EC.1.10.3.1)。在這三大類多酚氧化酶中，兒茶酚酶主要分布在植物中，微生物中的多酚氧化酶主要包括漆酶和酪氨酸酶。1、多酚氧化酶的名稱第2頁，共35頁，2023年，2月20日，星期日2、植物中多酚氧化酶分布多酚氧化酶是植物中最受注意的一種酶,在葡萄,洋李,無花果,棗,茶葉和咖啡豆中含量很高,它在這些果實(shí)中起著人們期望的作用.多酚氧化酶在桃,蘋果,香蕉,荔枝,馬鈴薯,蓮藕和萵苣中的含量也是相當(dāng)高,然而它對這些果實(shí)起著不需宜的作用,易引起褐變,造成變質(zhì)和腐爛,對于新鮮果實(shí)的保藏帶來極大困難胡椒中不存在多酚氧化酶.存在:植物、果蔬的葉綠體、線粒體,馬鈴薯塊莖分布廣泛第3頁，共35頁，2023年，2月20日，星期日多酚氧化酶在植物中的含量隨品種不同而有很大變化，在眾多的水果和蔬菜中，橄欖中的多酚氧化酶活力最高。多酚氧化酶的活力分布還取決于果蔬的成熟度。在綠葉中，很大一部分酶活力集中在葉綠體中，在馬鈴薯塊莖中，幾乎集中在亞細(xì)胞中；在新采收的蘋果中，多酚氧化酶幾乎全部存在于葉綠體和線粒體中。果蔬中不同的部位的多酚氧化酶含量差別很大，例如葡萄皮中的酶活力比果肉中高。第4頁，共35頁，2023年，2月20日，星期日二、多酚氧化酶催化反應(yīng)

及其作用底物1.催化反應(yīng)多酚氧化酶是一種加氧酶，它催化酚的選擇性羥基化，羥基化產(chǎn)物繼續(xù)氧化生成鄰-苯醌。多酚氧化酶的作用下氧化形成不穩(wěn)定的鄰-苯醌類化合物,然后再進(jìn)一步通過非酶氧化反應(yīng),聚合成黑色素(melanin)。第5頁，共35頁，2023年，2月20日，星期日羥基化氧化反應(yīng)第6頁，共35頁，2023年，2月20日，星期日第7頁，共35頁，2023年，2月20日，星期日多酚氧化酶的作用導(dǎo)致香蕉,蘋果,桃,馬鈴薯,蘑菇,蝦發(fā)生非需宜的褐變和人的黑斑形成然而對茶葉,咖啡,葡萄干和梅干,以及人的皮膚色素形成產(chǎn)生需宜的褐變當(dāng)鄰苯醌與蛋白質(zhì)中賴氨酸殘基的ε-氨基反應(yīng),可引起蛋白質(zhì)的營養(yǎng)價(jià)值和溶解度下降,同樣由于褐變反應(yīng)也將會(huì)造成食品的質(zhì)地和風(fēng)味的變化。第8頁，共35頁，2023年，2月20日，星期日熱帶水果50%以上的損失都是由于酶促褐變引起的.同時(shí)酶促褐變也是造成新鮮蔬菜例如萵苣和果汁的顏色變化,營養(yǎng)和口感變劣的主要原因控制果蔬加工和貯藏過程中酶促褐變,例如驅(qū)除O2和底物酚類化合物以防止褐變,或者添加抗壞血酸,亞硫酸氫鈉和硫醇類化合物等,將初始產(chǎn)物,鄰苯醌還原為原來的底物,從而阻止黑色素的生成.還原劑都能直接引起酶失活,從而抑制酶促褐變.這是因?yàn)榭箟难崮軌蚱茐拿富钚晕稽c(diǎn)上的組氨酸殘基,而亞硫酸氫鈉和硫醇可以除去酶活性位點(diǎn)中的Cu2+4-己基間苯二酚,苯甲酸和其他一些非底物酚類化合物,也可作為多酚氧化酶的有效競爭性抑制劑第9頁，共35頁，2023年，2月20日，星期日2.作用底物水果、蔬菜中底物為：一元酚類鄰二酚類（對位二酚也可）（間位二酚不作底物）如：

水果中的兒茶酚

OH

OH

土豆中的酪氨酸

HOCH2CHCOOHNH2

第10頁，共35頁，2023年，2月20日，星期日重要的天然底物第11頁，共35頁，2023年，2月20日，星期日三、pH和溫度對多酚

氧化酶活力影響1.pH對酶活力的影響(1)適宜pH：4～7(2)不同種類，甚至同一種果蔬中的不同品種得到的多酚氧化酶，也有不同的最適pH(3)果蔬的不同部位得到的多酚氧化酶,最適pH也有差異(4)酶的提取或分離的方法對它的最適pH也有影響(5)測定酶活力時(shí)所采用的底物和緩沖液對酶的最適pH也有影響(6)大多數(shù)多酚氧化酶只有一個(gè)最適pH,在一些情況下,有第二個(gè)最適pH第12頁，共35頁，2023年，2月20日，星期日2.溫度對多酚氧化酶活力影響不同種類、品種、部位的多酚氧化酶有不同的熱穩(wěn)定性，通常最適溫度在常溫加熱易使酶失活同一來源的多酚氧化酶的不同分子形式具有不同的熱穩(wěn)定性低溫下多酚氧化酶的活力也有明顯的下降，但活性下降比較緩慢第13頁，共35頁，2023年，2月20日，星期日四、多酚氧化酶的激活劑、抑制劑

和果蔬酶促褐變的防止1.激活劑多酚氧化酶的活性形式是含銅的酶單體的寡聚體，激活劑的作用是使酶蛋白以一定的聚合度存在，才有生物活性。SDS、Cu2+

、酸、尿素等第14頁，共35頁，2023年，2月20日，星期日2.抑制劑和果蔬酶促褐變的防止酶促褐變:較淺色的水果、蔬菜在受到機(jī)械性損傷（削皮、切片、壓傷、蟲咬、磨漿、搗碎）及處于異常環(huán)境變化（受凍、受熱等），在酶促（催化）下氧化而呈褐色，稱為酶促褐變西瓜、香瓜、桔子、檸檬

無酚酶，不褐變。亞硫酸類是酚酶抑制劑。第15頁，共35頁，2023年，2月20日，星期日實(shí)例1：土豆的褐變第16頁，共35頁，2023年，2月20日，星期日實(shí)例2：含有兒茶酚水果的褐變第17頁，共35頁，2023年，2月20日，星期日褐變防止方法酶促褐變的三個(gè)條件，缺一不可。即：多酚類物質(zhì)、酚酶、氧氣除去多酚類物質(zhì)困難，不現(xiàn)實(shí)?！嘁话銥榻档头用富钚浴Ⅱ?qū)氧

第18頁，共35頁，2023年，2月20日，星期日(1)加熱鈍化酶活性75～95℃、5～7S的加熱處理，可使大部分酶活性喪失。常用的方法有：漂燙、巴氏殺菌加工中，必須嚴(yán)格控制時(shí)間和溫度。加熱溫度過高，加熱時(shí)間過長，可抑制酶褐變，但會(huì)影響食品品質(zhì)；加熱不足，不能抑制酶褐變。微波加熱，熱穿透力強(qiáng)，迅速均勻，不影響風(fēng)味。第19頁，共35頁，2023年，2月20日，星期日(2)螯合酶促作用的金屬離子金屬（鐵、銅、錫、鋁等）離子是多酚氧化酶的激活劑。Fe3+、Fe2+、Cu2+能促進(jìn)褐變主要是因?yàn)殍F和銅不僅能和酚類化合物反應(yīng)形成褐色物質(zhì)，而且能催化還原酮類的氧化。檸檬酸對Cu2+有螯合作用。EDTA是一種金屬離子螯合劑，可阻止金屬離子對褐變反應(yīng)的促進(jìn)作用，但其與作用對象有關(guān)，有的效果則不明顯。第20頁，共35頁，2023年，2月20日，星期日(3)酸處理法多數(shù)酚酶最適pH＝6～7，pH<3失活(高酸性環(huán)境會(huì)使酶蛋白上的銅離子解離下來，導(dǎo)致PPO逐漸失活，酶活性趨于最低。)常用的酸有：檸檬酸、蘋果酸、磷酸、抗壞血酸、混合酸。檸檬酸可降低pH，還可絡(luò)合酚酶輔基Cu2+，但單獨(dú)用效果不大。常與抗壞血酸、亞硫酸合用。實(shí)踐證明：0.5%檸檬酸+0.3%抗壞血酸效果好。抗壞血酸不但能降低體系pH，而且具有還原劑的作用，可將體系中的醌類及其衍生物還原成酚，并通過自身氧化來減少體系的含氧量。第21頁，共35頁，2023年，2月20日，星期日抗壞血酸抑制酶褐變的機(jī)理（圖）第22頁，共35頁，2023年，2月20日，星期日（4）酶活抑制劑亞硫酸類是酚酶抑制劑。常用的有：二氧化硫、亞硫酸鈉、亞硫酸氫鈉、焦亞硫酸鈉、低亞硫酸鈉(Na2S2O4)

如：在蘑菇、馬鈴薯、桃、蘋果等加工中，常用二氧化硫及亞硫酸鹽類作護(hù)色劑。實(shí)驗(yàn)表明：10ppm可抑制酚酶活性，但有揮發(fā)損失，還與醛類加成等。實(shí)際應(yīng)用300ppm，殘留<20ppm。在微酸性（pH＝6）時(shí)，抑制酚酶的效果最好。

防止原因有三：a.抑制酶活性b.將醌還原為酚c.與醌加成，防止聚合第23頁，共35頁，2023年，2月20日，星期日(5)驅(qū)氧通過沸水燙漂、抽真空（93kPa，5～15min）、高濃度抗壞血酸溶液浸泡、氣調(diào)包裝設(shè)計(jì)等均可達(dá)到驅(qū)除食品內(nèi)氧氣的目的，從而抑制酶褐變的發(fā)生?？刂蒲鯕夂坑贸榭仗幚砑夹g(shù)或添加去氧劑等方法：用2%食鹽+0.2%檸檬酸+0.06%偏重亞硫酸鈉溶液作抽空液，在500mmHg的真空度抽空5～10min,可取得良好的護(hù)色效果。第24頁，共35頁，2023年，2月20日，星期日褐變的利用

期望的褐變蘋果酒、紅茶發(fā)酵（生成茶紅素）、可可粉、葡萄干、梅干、椰棗、無花果。紅茶是全發(fā)酵茶，茶中的多酚物質(zhì)主要是兒茶素經(jīng)多酚氧化酶與過氧化物酶的作用，氧化并聚合生成茶色素。紅茶中含有三種酚性色素——茶紅素、茶黃素和黃酮醇甙。第25頁，共35頁，2023年，2月20日，星期日五、多酚氧化酶的分子形式多酚氧化酶有多種分子形式原因：①類似的亞基不同程度的聚合；②不同亞基不同方式的結(jié)合;③酶蛋白質(zhì)構(gòu)象的改變;④前三種情況的結(jié)合。多酚氧化酶多種分子形式之間的差別表現(xiàn)在底物特異性、最適pH、溫度穩(wěn)定性、對抑制劑敏感性、氧化和羥基化活力的差別。第26頁，共35頁，2023年，2月20日，星期日六、多酚氧化酶活力測定多酚氧化酶活力的測定方法可以分為兩類①測定底物消失的速度②測定產(chǎn)物生成的速度

——限于測定反應(yīng)的初速度。第27頁，共35頁，2023年，2月20日，星期日PPO活性測定終點(diǎn)法多酚氧化酶催化分子態(tài)氧將酚類化合物氧化為醌類反應(yīng)，以兒茶酚為多酚氧化酶的底物，其氧化產(chǎn)物在416nm處有最大光吸收。測定系統(tǒng)：1.5ml20mmol/L鄰苯二酚（溶于0.05mol/L,pH6.8KH2PO4-NaOH緩沖液中，然后再加入0.1ml酶提取液，保溫37oC，三氯乙酸終止反應(yīng)，并4000r/min離心5min，取上清液，適當(dāng)稀釋。以空白為對照，用分光光度計(jì)測定其在416nm波長下的O.D值。酶活性單位為在測定條件下，每分鐘引起吸光度改變0.01所需的酶量第28頁，共35頁，2023年，2月20日，星期日動(dòng)態(tài)法

PPO活性的測定取0.05mol/L,pH6.8KH2PO4-NaOH緩沖液1.5ml于1cm比色皿中，加入1ml20mmol/L鄰苯二酚溶液，PPO酶液0.5ml，混勻后在416nm處比色，酶液加入后開始記時(shí)，每30s記錄一次OD隨時(shí)間的變化值，以最初直線段的斜率(ΔOD/t)計(jì)算酶活力。一個(gè)酶活力單位定義為：在測定條件下，每分鐘引起吸光度改變0.01所需的酶量。第29頁，共35頁，2023年，2月20日，星期日七、水果和蔬菜中的

多酚氧化酶及其底物正常條件下，在未受損水果中，酚類物質(zhì)是與PPO酶存在于不同部位。這種分布是通過一系列膜系統(tǒng)實(shí)現(xiàn)的，受膜屏障的作用，這種區(qū)域性的分布阻止了底物和酶的相互接觸，所以正常組織是不發(fā)生褐變的，一旦膜系統(tǒng)受損，使物質(zhì)的區(qū)域化分布破壞，PPO與酚類物質(zhì)接近并與其發(fā)生化學(xué)作用，這將導(dǎo)致褐變。水果有更大的有著較弱薄片成分的細(xì)胞，冷藏時(shí)易發(fā)生細(xì)胞壁破裂，使PPO與酚類物質(zhì)接觸，產(chǎn)生褐變。第30頁，共35頁，2023年，2月20日，星期日1.蘋果中多酚氧化酶引起蘋果褐變的重要原因之一未成熟的蘋果比成熟的更易褐變在大多數(shù)情況下，酶促褐變傾向在保藏期間是增加的第31頁，共35頁，2023年，2月20日，星期日2.梨中的多酚氧化酶梨多酚氧化酶僅作用于鄰苯酚,與對苯酚、間苯酚和一元酚無作用以兒茶酚為底物,該酶的最適pH為6.5,在30℃活性最強(qiáng).亞硫酸氫鈉、維生素C、檸檬酸對梨中