基因分析技術簡介專家講座

陶慧卿基因分析技術介紹基因分析技術簡介專家講座第1頁在生物、醫(yī)學、農(nóng)牧業(yè)領域應用基因分析技術簡介專家講座第2頁測序應用基因組DNA測序cDNA測序未知序列測序已知序列再測序基因分析技術簡介專家講座第3頁雙脫氧鏈終止法原理Sanger雙脫氧鏈終止法最大特點是引入了雙脫氧核苷三磷酸（2ˊ,3ˊ-ddNTP）作為鏈終止劑。ddNTP能夠在DNA聚合酶作用下和多核苷酸鏈3ˊ羥基形成磷酸二酯鍵，但卻不能再與下一個核苷酸縮合，結果使得多核苷酸鏈延伸終止。基因分析技術簡介專家講座第4頁雙脫氧鏈終止法測序主要步驟擴增待測DNA片段，使其變性，取得單鏈DNA模板。選擇一條與DNA單鏈互補短鏈引物，將引物用放射性同位素標識。引物先同單鏈模板復性。在四個反應管中分別加入待測DNA單鏈模板、互補引物分子、四種dNTP、DNA聚合酶(Klenow酶)以及不一樣ddNTP進行聚合反應。基因分析技術簡介專家講座第5頁基因分析技術簡介專家講座第6頁雙脫氧鏈終止法測序與PCR區(qū)分?測序只用一條引物，PCR需要兩條引物?測序產(chǎn)物線性增加，PCR產(chǎn)物指數(shù)增加?測序需要dNTP和ddNTP，PCR只用dNTP?測序產(chǎn)物是一系列長度相差一個堿基片段，PCR產(chǎn)物只有一條帶基因分析技術簡介專家講座第7頁

1、商品化測序試劑盒-熒光染料標識

ABIPRISMBigDyev3.1和v1.1試劑盒2、自動化測序儀

ABIPRISM

310、3100和3730全自動遺傳分析儀

雙脫氧鏈終止法發(fā)展基因分析技術簡介專家講座第8頁BigDyev3.1試劑盒反應體系及條件反應體系：

單鏈DNA模板引物DNA聚合酶Mg2+4種dNTP(dATP,dGTP,dCTP和dTTP)

4種不一樣熒光標識ddNTP(ddATP,ddGTP,ddCTP和ddTTP)循環(huán)條件：

96℃1min→(96℃10s→50℃5s→60℃4min)×25個循環(huán)→4℃保溫基因分析技術簡介專家講座第9頁基因分析技術簡介專家講座第10頁ABIPrism310GeneticAnalyzercapillarySyringewithpolymersolutionAutosamplertrayOutletbuffer+Injectionelectrode-Inletbuffer基因分析技術簡介專家講座第11頁AutosamplerTraySampleVialsElectrodeCapillarySeeTechnologysectionformoreinformationonCE電進樣及電泳基因分析技術簡介專家講座第12頁熒光激發(fā)和檢測基因分析技術簡介專家講座第13頁影響測序質量原因測序成功前提：PCR本身是成功PCR產(chǎn)物一定要經(jīng)過純化后再測序測序引物比PCR引物靠后一些(Nestedprimers)在測序反應過程中反應體積不要有波動（蒸發(fā)）選擇適當測序產(chǎn)物純化方法基因分析技術簡介專家講座第14頁SNP篩查單核苷酸多態(tài)(SNP)是基因組中最為豐富遺傳多態(tài)，是決定個體差異最主要遺傳基礎。多態(tài)形式主要包含單堿基替換、插入或缺失，普通也包含微小片斷插入/缺失。因為很多SNP位點本身就是功效多態(tài)位點，使得SNP在疾病易感基因相關性研究中有著廣泛應用。基因分析技術簡介專家講座第15頁SNaPshot?MultiplexSystem基因分析技術簡介專家講座第16頁基因分析技術簡介專家講座第17頁SNaPshot試劑盒反應體系及條件反應體系：

單鏈DNA模板引物DNA聚合酶Mg2+

4種不一樣熒光標識ddNTP

循環(huán)條件：

(96℃10sec→50℃5sec→60℃30sec)×25循環(huán)→4℃保溫基因分析技術簡介專家講座第18頁方法特點

分型準確：該技術也稱小測序技術，其準確度僅亞于直接測序。多位點同時檢測：能夠同時檢測達12個位點，而Taqman一次僅能檢測一個。不受樣本量限制:而Taqman對少許樣本不適合。

基因分析技術簡介專家講座第19頁注意事項

1．同一反應管中，不一樣位點引物長度必須不一樣，最好能相差4-6個堿基。2．引物與模板互補部分（有效引物）Tm值最少要50℃。3．為了改變引物長度，區(qū)分不一樣位點，能夠在引物5’端加poly(dT)、poly(dA)、poly(dC)或者poly(dGACT)尾巴。這四種尾巴理論上不輕易形成二級結構，而且都經(jīng)過試驗驗證。小心：poly(dT)有可能與真核基因3’端poly(dA)尾巴互補。4．在引物設計時候，假如+鏈DNA序列不理想，難以設計出最正確引物，請使用-鏈DNA設計引物?；蚍治黾夹g簡介專家講座第20頁微衛(wèi)星多態(tài)(STR)分析微衛(wèi)衛(wèi)星多態(tài)位點是一個短核苷酸串連重復多態(tài)（shorttandomrepeat,STR）,重復單元通常為2-5bp,因為這種重復序列在DNA復制過程中不穩(wěn)定，所以突變很高，從而造成這種標識位點多態(tài)性很強，雜合度很高，正因為這種特點，微衛(wèi)星多態(tài)在遺傳分析中有著廣泛應用.

基因分析技術簡介專家講座第21頁熒光——引物熒光——PCR產(chǎn)物熒光激發(fā)與檢測識別統(tǒng)計結果