菌種的傳代與保藏

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菌種是從事微生物學及生命科學研究的基本材料，在醫(yī)學領域中，診斷制品的制備，菌苗的生產、微生物致病性研究，藥物的抑菌試驗及藥品微生物檢驗等都有一套完整的菌種.微生物具有生命活力，在傳代過程中易發(fā)生變異甚至死亡，因此菌種保藏是一項重要的基礎工作，是微生物學基礎工作的一項重要內容，也是藥品微生物工作中的一項常用技術。一、菌種保藏的意義第3頁/共52頁

如藥品中的控制菌檢查使用的陽性對照菌須防止因多次傳代而使陽性對照菌的典型生物學特征發(fā)生變化及菌株的死亡，保證達到菌種長期正確的形態(tài)；

如藥品微生物學檢驗過程中，檢出的可疑致病菌須妥善保藏，以達到進一步鑒定的目的，保證用藥安全。許多國家都已建立了專門的菌種保藏機構，如美國標準菌種收藏所（ATCC）、英國的國立標準菌種收藏所（NCTC）、還有全球性的世界菌種保藏聯(lián)合會（WFCC）。

第4頁/共52頁二、菌種代號的意義

國內藥品微生物檢驗所用的菌種代號是CMCC（F）或CMCC（B）CMCC——

中國醫(yī)學菌種保藏中心B(Bacteria)代表細菌，F(xiàn)(Fungi)代表真菌。大腸埃希菌[CMCC(B)44102]乙型副傷寒沙門桿菌[CMCC(B)50094]銅綠假單胞菌[CMCC(B)10104]金黃色葡萄球菌[CMCC(B)26003]生孢梭菌[CMCC(B)64941]枯草芽孢桿菌[CMCC(B)63501]短小芽孢桿菌[CMCC(B)63202]白色念珠菌[CMCC(F)98001]黑曲霉[CMCC(F)98003]第5頁/共52頁

三、常用菌種保藏方法

(一)菌種保藏的原理根據(jù)微生物的菌種生理、生化特性，在人工創(chuàng)造的條件下盡量降低微生物細胞的代謝強度，使細胞基本處于休眠狀態(tài)，生長繁殖受到抑制但又不至于死亡，以減低菌種的變異率。低溫、干燥、缺氧、缺乏營養(yǎng)等環(huán)境條件都有抑制微生物的代謝作用。低溫、干燥、真空是用于菌種保藏的重要手段。

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選擇保藏方法時，首先應考慮方法能否長期地保持菌種原有的特性，同時也應兼顧到方法的經(jīng)濟和簡便。在實際工作中，往往多種條件同時使用,以提高保藏效果。（二）菌種保藏步驟①挑選特征典型的單個菌落；②確定保藏的合適菌體形態(tài)；③選擇最適宜的保藏方法；④定期對保藏菌種進行檢查，觀察是否發(fā)生變化，若有變化，須改變保藏方法。保藏期滿應及時進行移種。第7頁/共52頁1.瓊脂斜面低溫保存法

（1）方法：將經(jīng)常使用的菌種的典型菌落接種在斜面（某些特殊菌種可用液體培養(yǎng)基）上，按規(guī)定的溫度和時間培養(yǎng)，待充分生長后，把培養(yǎng)好的新鮮菌種用牛皮紙包好，可將菌種保藏管的棉花塞換成橡膠塞，以減緩培養(yǎng)基的水分蒸發(fā)，延長保藏時間。放在4℃左右的冰箱中保藏。每隔

2~3個月移種一次，繼續(xù)進行保藏。若用半固體高層培養(yǎng)基穿刺培養(yǎng)，一般可保藏半年至一年，有的甚至更長時間。

（2）適用范圍：細菌、霉菌、酵母菌保藏。第8頁/共52頁大腸桿菌斜面藤黃微球菌斜面第9頁/共52頁

生孢梭菌白色念珠菌

需氣菌、厭氣菌培養(yǎng)基改良馬丁瓊脂培養(yǎng)基第10頁/共52頁黑曲霉改良馬丁瓊脂斜面不同培養(yǎng)時間的生長形態(tài)第11頁/共52頁黑曲霉改良馬丁瓊脂斜面典型斜面正面為黑褐色厚絨狀，色澤均一，不應有雜色；斜面?zhèn)让鏌o色，接近菌層培養(yǎng)基略帶黃色。黑曲霉孢子相當穩(wěn)定，可以保存于4℃0.9%氯化鈉溶液中較長時間，作為孢子懸液儲備液使用。由此可以減少菌液制備工作量和反復操作黑曲霉的風險。

第12頁/共52頁各類菌種保藏條件及時間

菌種培養(yǎng)基保存溫度傳種時間細菌一般多用于營養(yǎng)瓊脂或根據(jù)菌種規(guī)定選用培養(yǎng)基4~6℃芽孢桿菌3~6個月，其它細菌每個月酵母菌一般用麥芽汁瓊脂或麥芽汁酵母膏瓊脂4~6℃一般4~6個月絲狀真菌一般用PDA瓊脂、蔡氏瓊脂或麥芽汁瓊脂等4~6℃每4個月移植一次（每2個月移植一次）第13頁/共52頁（3）特點：優(yōu)點是——簡便，易于推廣；一般不需要另選擇保藏用培養(yǎng)基；對大多數(shù)微生物都適用。缺點是——保藏期較短；傳代次數(shù)多易發(fā)生變異及污染。第14頁/共52頁（4）注意事項：實驗用的菌種應是生命活力旺盛的新鮮培養(yǎng)物，至少應是第三代的培養(yǎng)物。生孢梭菌可用庖肉培養(yǎng)基或硫乙醇酸鹽流體培養(yǎng)基（前者效果更佳）。必須定期檢查保藏菌種冰箱的溫度、濕度以及菌種管的棉塞是否松動或生霉，如有異常應及時處理。

第15頁/共52頁每次移植后，應與原菌種的編號、名稱逐一核對，確證培養(yǎng)基特征和純度無誤后再繼續(xù)保藏。保藏菌種的培養(yǎng)基應無糖，若含糖，一般小于2%為宜，以免產酸過多，影響菌種存活。保藏溫度和時間都不是絕對的，個別菌種不宜低溫保存。如銅綠假單胞菌在冰箱中易發(fā)生菌體自溶而死亡，不宜用本法保存。

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2、液體石蠟保存法：

本法是用液體石蠟將培養(yǎng)物與空氣隔絕，以降低菌種的生理生化水平，并可防止水分蒸發(fā)，從而延長菌種的保藏期。

（1）方法：

將菌種接種于斜面或穿刺于0.3~0.5%瓊脂半固體高層培養(yǎng)基中，培養(yǎng)好備用。取化學純的液體石蠟裝在試管中，每管10~15ml，加塞，瓶口包上紙，121℃高壓滅菌30min，取出置37℃溫箱或110~170℃烤箱中1~2h或干燥器內除去液體石蠟中的水分。第17頁/共52頁

將上述液體石蠟加入培養(yǎng)好的菌種試管內，液體石蠟液面以高出培養(yǎng)基最上端1㎝為宜，將試管直立，放入4℃冰箱中保藏。適用范圍：適用于保藏部分霉菌，酵母菌和放線菌，對細菌保藏效果較差。

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液體石蠟對各類菌種保藏效果

菌種菌株數(shù)保存時間（年）存活率（%）細菌霉菌酵母菌放線菌87586400380552420.983.688.991.3第19頁/共52頁各類菌種保藏條件及時間

菌種保存方法溫度傳種時間大腸桿菌營養(yǎng)瓊脂斜面營養(yǎng)肉湯菌懸液4～6℃0℃以下2～3個月1年乙型副傷寒沙門菌營養(yǎng)瓊脂斜面營養(yǎng)肉湯菌懸液4～6℃0℃以下2～3個月2年 金黃色葡萄球菌營養(yǎng)瓊脂斜面營養(yǎng)肉湯菌懸液4～6℃0℃以下2～3個月4年 滕黃微球菌營養(yǎng)瓊脂斜面營養(yǎng)肉湯菌懸液4～6℃0℃以下2～3個月4年 銅綠假單胞菌營養(yǎng)瓊脂斜面液體石蠟覆蓋保存法室溫室溫2～3個月2年 枯草芽孢桿菌營養(yǎng)瓊脂斜面半固體營養(yǎng)肉湯菌懸液4～6℃4～6℃0℃以下6～12個月1～2年4年以上短小芽孢桿菌營養(yǎng)瓊脂斜面半固體營養(yǎng)肉湯菌懸液4～6℃4～6℃0℃以下6～12個月1～2年4年以上生孢梭菌庖肉培養(yǎng)基液體石蠟覆蓋保存法4～6℃4～6℃6個月2年白色念珠菌改良馬丁斜面4～6℃6個月第20頁/共52頁（3）特點：本方法簡便易行，是實驗室常用的一種保藏方法，該法主要使菌種與空氣隔絕。（4）注意事項：

1.保藏時，用新鮮培養(yǎng)物接種，應檢查純度和特征后，方可進行保藏。

2.使用菌種時，先將菌種管傾斜使液體石蠟流至一邊，再用接種針挑取培養(yǎng)物接種到新鮮斜面上培養(yǎng)，待長出新培養(yǎng)物后，再移種一次到新斜面上即可使用。

第21頁/共52頁3.將沾有少量液體石蠟的接種針浸于95%酒精中片刻，再燒灼滅菌，以免直接在酒精燈下燒灼時，液體石蠟四濺，引起污染。4.液體石蠟在菌種管中高出培養(yǎng)基的高度要嚴格控制，如太多，會影響菌種交換氣體，使保藏效果不好；如太少，斜面容易干燥，將縮短保藏期。一般以高出斜面1㎝為宜。

5.制備無菌液體石蠟時，每管裝量不能太多，否則分裝到菌種培養(yǎng)基中易造成污染。第22頁/共52頁

半固體瓊脂培養(yǎng)基（0.5%）液體石蠟保存

第23頁/共52頁3、其他保存方法簡介干燥保藏法懸液保藏法液氮保藏法梭-氏真空干燥保藏法真空干燥保藏法冷凍干燥保藏法第24頁/共52頁標準菌種保藏管第25頁/共52頁四、試驗用菌種的培養(yǎng)傳代方法

程序：

凍干菌（0代）→營養(yǎng)肉湯復蘇（1代）→接種（斜面或肉湯2代）→菌種傳代（3、4、5代）→5代后銷毀檢定用標準菌種，由中國藥品生物檢定所提供，為冷凍干燥菌種。菌種的復蘇與保存在專用無菌室或超凈工作臺內進行。第26頁/共52頁

1菌種的復蘇

參考流程：?把凍干菌種管、滅菌滴管、雙碟、鑷子、營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基、滅菌生理鹽水、營養(yǎng)瓊脂斜面數(shù)支，移入接種室或凈化工作臺。?先用砂輪將凍干菌種安瓶頸部挫出刻痕,再將凍干菌種管外壁用碘酒擦洗消毒、稍干，用75%乙醇棉擦凈，放在滅菌雙碟內，待干。點燃酒精燈，將菌種管的封口一端在火焰上，燒灼紅熱，用滅菌滴管吸取滅菌生理鹽水，滴在灼熱的菌種管封口一端，使驟冷而炸裂。

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?取滅菌鑷子，在火焰旁，將炸裂的管口打開，放入滅菌雙碟內，另取1支滅菌滴管，在火焰旁吸取營養(yǎng)肉湯少許，加至菌種管底部，將凍干菌攪動促使溶解，隨即吸出管內菌液，接種至營養(yǎng)肉湯內，并將滴管及菌種管投入消毒液內，將已接種的營養(yǎng)肉湯置35~37℃培養(yǎng)22~24h。

?

取出培養(yǎng)物，接種至營養(yǎng)瓊脂斜面于35～37℃培養(yǎng)22～24h，取出后仔細觀察菌苔形態(tài)、有無雜菌、涂片、革蘭氏染色鏡檢，呈典型菌落后，轉種3代即可應用。如發(fā)現(xiàn)菌型不典型，可進行平板分離單菌落。

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2菌種的傳代與保存

方法（1）：菌斜面菌斜面（保存）

?

培養(yǎng)基應新鮮制備，如斜面已無冷凝水者，不宜再使用。標簽上著名菌名及接種日期。至冰箱取出的菌種斜面，應在室溫放置約30分鐘，待溫度平衡后再移入接種室或超凈工作臺。

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點燃酒精燈，用左手握住菌種斜面，將管口靠近火焰旁，右手拿接種棒后端，將接種環(huán)燒紅30秒，隨后將全部接種棒金屬部分在火焰上燒灼，往返通過3次。左手將管口在火焰上旋轉燒灼，右手用無名指、小指及掌部夾住管塞，撥開管塞，將接種環(huán)伸人管內先在近壁的瓊脂斜面上靠一下，稍冷卻再移至菌苔上，刮取少量菌苔，隨即取出接種棒，并將菌種管口移至火焰旁。第29頁/共52頁?

堵上管塞，左手將菌種管放下，取營養(yǎng)瓊脂斜面1支，照上述操作打開棉塞，將接種環(huán)伸入管內至瓊脂斜面的低部，由底向上，將接種環(huán)輕貼斜面的表面曲折移動，使細菌劃在斜面的表面上。?

取出接種棒，在火焰旁將培養(yǎng)基管管塞堵上，然后將接種過細菌的接種棒在火焰上燒灼滅菌。?

將已接種畢的細菌管置35~37℃培養(yǎng)22~24小時，霉菌管一般置20~25℃霉菌培養(yǎng)箱內培養(yǎng)7日。取出后放人冰箱保存，一般3個月轉種一次。第30頁/共52頁

斜面接種時的無菌操作

(1)接種滅菌(2)開啟試管塞(3)管口滅菌(4)挑起菌苔(5)接種(6)塞好試管塞第31頁/共52頁

方法2：菌斜面營養(yǎng)肉湯分離平板菌斜面如果菌落形態(tài)不典型可純化，按下列方法傳代（分離菌落）：用接種環(huán)取上述菌管（斜面）菌苔少許接種置營養(yǎng)肉湯中(已滅菌),置35~37℃培養(yǎng)18~24小時后，再用接種環(huán)取培養(yǎng)好的營養(yǎng)肉湯菌懸液（濃菌液），接種于分離平板，置35~37℃培養(yǎng)18~24小時，用接種針選典型菌落劃線于營養(yǎng)瓊脂斜面，置35~37℃培養(yǎng)18~24小時。一般同時接種幾支管，其中一支用于以后菌種傳代或接種到半固體瓊脂培養(yǎng)基中，其它用做工作菌種。第32頁/共52頁

平板劃線分離法

1.斜線法2.曲線法3.方格法4.放射法5.四格法第33頁/共52頁常用分離平板：大腸埃希菌——EMB瓊脂平板紫黑色有金屬光澤，表面光滑，圓形，凸起第34頁/共52頁銅綠假單胞菌——溴化十六烷三甲銨瓊脂培養(yǎng)基

扁平，無定形，周邊擴散，表面濕潤，灰白色，周圍有藍綠色素擴散第35頁/共52頁金黃色葡萄球菌——甘露醇氯化鈉瓊脂培養(yǎng)基金黃色，圓形凸起，邊緣整齊，外圍有黃色環(huán)第36頁/共52頁沙門菌——SS瓊脂平板無色，透明或半透明，光滑濕潤的圓形菌落

第37頁/共52頁顯微鏡檢查將菌種作革蘭氏色，在顯微鏡下觀察制片步驟：涂片－干燥－固定－染色－鏡檢革蘭氏染色步驟：初染－媒染－脫色－復染制好片后先用低倍鏡再用油鏡觀察革蘭氏色陽性菌為紫色革蘭氏色陰性菌為紅色第38頁/共52頁細菌涂片制作1.涂片：取清潔玻片一張，取1～2環(huán)生理鹽水在玻片上，滅菌接種環(huán)后，取少許菌苔于鹽水中研磨成乳濁狀，并涂成1平方厘米左右的菌膜，若用液體培養(yǎng)物涂片，可直接涂，不用加生理鹽水。2.干燥：最好自然干燥，必要時可將標本面朝上，小心在酒精燈火焰高空處烘干，但勿靠近火焰外層，以免烤焦。第39頁/共52頁3.固定：手持玻片一端，標本面向上，在外層火焰上以鐘擺速度來回通過３次。目的使菌體粘附更牢，并使染料更容易進入菌體。第40頁/共52頁革蘭氏染色1.初染：滴加結晶紫染液1～2滴于標本菌膜上。1min后，用水沖洗，并傾去玻片上的余水。2.媒染：加革蘭氏碘液1～2滴于菌膜上，1min后，用水沖洗，傾去玻片上余水。第41頁/共52頁3.脫色：加95％酒精1～2滴于菌膜上，輕輕晃動玻片，直到不再有紫色脫出為止，約0.5min，用水沖洗，傾去玻片上余水。4.復染：加稀釋石炭酸復紅1～2滴于菌膜上，1min后，用水沖洗，傾去玻片上余水。用吸水紙輕輕吸干，待標本干燥后，用油鏡觀察。第42頁/共52頁注意事項：1.涂片時，菌膜應薄而均勻。2.用水沖洗時，水流不宜直接沖在菌膜上。3.革蘭氏染色結果受多種因素影響，如細菌培養(yǎng)時間，染色技術等。染色中應特別注意掌握好脫色時間，不宜過長或過短，否則結果不準確。一般選用16～24h培養(yǎng)物為宜。4.油鏡清潔時，先用拭鏡紙蘸取少量乙醚：酒精（3：1）擦拭，再用干凈拭鏡紙擦拭。第43頁/共52頁大腸埃希菌：革蘭氏陰性，短小桿菌沙門菌：革蘭氏陰性，桿菌銅綠假單胞菌：革蘭氏陰性，桿菌金黃色葡萄球菌：革蘭氏陽性，葡萄串狀球菌第44頁/共52頁金黃色葡萄球菌大腸埃希菌第45頁/共52頁

3菌懸液的制備

取上述培養(yǎng)好的菌種斜面移入接種室或凈化工作臺，放置室溫后,用接種環(huán)取菌苔少許接種置營養(yǎng)肉湯中（已滅菌），將已接種畢的細菌管置35~37℃培養(yǎng)18~24小時，取出備用。一般于冰箱中保存可用7天。第46頁/共52頁

4對照用菌液制備

取上述培養(yǎng)好的營養(yǎng)肉湯菌懸液（濃菌液）1ml，加到9ml0.9%無菌氯化鈉溶液混勻，為10-1，再取另一只吸管吸取10-1菌液1ml加到9ml0.9%無菌氯化鈉溶液混勻，為10-2

……以此類推，稀釋至含活菌數(shù)