蛋白質(zhì)和氨基酸的測定

蛋白質(zhì)和氨基酸的測定第1頁/共85頁42

蛋白質(zhì)的定性測定1概述氨基酸的定性測定45氨基酸定量測定3蛋白質(zhì)的定量測定—?jiǎng)P氏定氮法主要內(nèi)容氨基酸的分離測定6第2頁/共85頁1、蛋白質(zhì)的測定原理、測定方法、注意事項(xiàng)。2、氨基酸的測定原理、測定方法、注意事項(xiàng)。3、乳與乳制品中非蛋白氮含量的測定原理1、蛋白質(zhì)的性質(zhì)和測定意義；2、凱氏定氮法測定蛋白質(zhì)的原理和方法摘要；3、熟悉凱氏定氮儀的工作原理和使用方法。2.重點(diǎn)1、凱氏定氮法中蛋白質(zhì)原理和關(guān)鍵環(huán)節(jié)。2、乳與乳制品中非蛋白氮含量的測定原理。3.難點(diǎn)3.1.基本知識(shí)點(diǎn)學(xué)習(xí)目標(biāo)第3頁/共85頁第一節(jié)

概述一、蛋白質(zhì)的組成蛋白質(zhì)是復(fù)雜的含氮有機(jī)化合物，它由20多種氨基酸通過酰胺鍵以一定的方式結(jié)合起來，并具有復(fù)雜的空間結(jié)構(gòu)。它主要含的元素是C、H、O、N、S、P另外還有一些微量元素Fe、Zn、I、Cu、Mn。而含N是蛋白質(zhì)區(qū)別于其他有機(jī)化合物的重要標(biāo)志。二、氨基酸pro是由氨基酸組成的高分子化合物，目前各種氨基酸已達(dá)175種以上，但是構(gòu)成pro的氨基酸主要有20種。賴氨酸

丙氨酸

谷氨酸

甘氨酸

天冬氨酸

纈氨酸

天冬酰胺絲氨酸

第4頁/共85頁P(yáng)ro的基本組成單位是氨基酸那什么是氨基酸呢？幾種常見的氨基酸第5頁/共85頁幾種常見的氨基酸這些氨基酸結(jié)構(gòu)上有什么共同點(diǎn)？羧基和氨基連接在同一個(gè)碳原子上蛋白質(zhì)的基石物質(zhì)：α-氨基酸第6頁/共85頁氨基酸的縮合第7頁/共85頁肽鍵二肽、多肽等第8頁/共85頁誤食重金屬鹽，可以喝大量牛奶進(jìn)行緊急處理，WHY?雞蛋水煮會(huì)發(fā)生什么樣變化？醫(yī)用酒精可以消毒，福爾馬林可以保存動(dòng)物標(biāo)本，WHY？問：蛋白質(zhì)具有什么樣的性質(zhì)呢？三、蛋白質(zhì)的性質(zhì)鹽析

變性第9頁/共85頁小結(jié)

蛋白質(zhì)的主要組成元素？

天然蛋白質(zhì)的分子量：天然高分子有機(jī)化合物，分子量幾萬到幾十萬；

哪些物質(zhì)中富含蛋白質(zhì)呢？第10頁/共85頁P(yáng)ro是食品的重要組成成分，也是生命的基礎(chǔ)。人體11%-13%的總熱量來自蛋白質(zhì)。無論動(dòng)物、植物都含有蛋白質(zhì)，只是含量及類型不同。測定食品中的蛋白質(zhì)含量，對(duì)合理調(diào)配膳食，保證不同人群的營養(yǎng)需求，掌握食品的營養(yǎng)價(jià)值，合理開發(fā)利用食品資源，控制食品加工中食品的品質(zhì)、質(zhì)量都具有重要的意義。Pro是食品的最重要質(zhì)量指標(biāo)。食品營養(yǎng)價(jià)值的高低，主要看蛋白質(zhì)的高低。四、蛋白質(zhì)測定的意義第11頁/共85頁除了保證食品的營養(yǎng)價(jià)值外，在決定食品的色、香、味及結(jié)構(gòu)等特征上也起著重要的作用。蛋白質(zhì)是微生物發(fā)酵中所必需的重要氮源之一。Eg.發(fā)酵原料中蛋白質(zhì)含量的高低對(duì)發(fā)酵產(chǎn)品的質(zhì)量影響很大。啤酒生產(chǎn)要選用蛋白質(zhì)含量較低的大麥等原料，因啤酒釀造中，原料（大麥芽）中蛋白質(zhì)含量過高，可造成啤酒渾濁、高級(jí)醇含量偏高。但對(duì)醬和醬油等發(fā)酵調(diào)味品來講，則需要選用蛋白質(zhì)含量較高的原料；至于活性干酵母，含氮量則是評(píng)價(jià)其成品質(zhì)量的一個(gè)重要指標(biāo)，主要是判定活性酵母菌的數(shù)量。四、蛋白質(zhì)測定的意義第12頁/共85頁五、蛋白質(zhì)的測定方法

蛋白質(zhì)的測定方法分兩大類：

一類是利用蛋白質(zhì)的共性即含氮量、肽鍵和折射率等測定蛋白質(zhì)含量；

另一類是利用蛋白質(zhì)中的氨基酸殘基、酸性和堿性基因以及芳香基團(tuán)等測定蛋白質(zhì)含量。具體測定方法：凱氏定氮法：最常用的，國內(nèi)外應(yīng)用普遍。雙縮脲反應(yīng)、染料結(jié)合反應(yīng)、酚試劑法國外：紅外分析儀氨基酸總量—酸堿滴定法測定；各種氨基酸的分離與定量—色譜技術(shù)。有多種氨基酸分析儀。第13頁/共85頁第二節(jié)蛋白質(zhì)的定性測定（p116)一、蛋白質(zhì)的一般顯色反應(yīng)電泳或紙層析之后用一些染料與蛋白質(zhì)結(jié)合并變色。（5種染料）二、復(fù)合蛋白質(zhì)的顯色反應(yīng)（一）糖蛋白的顯色（3種方法）（二）脂蛋白的顯色（2種方法）第14頁/共85頁第三節(jié)蛋白質(zhì)的定量測定食品中的蛋白質(zhì)含量及測定意義蛋白質(zhì)系數(shù)蛋白質(zhì)測定方法第15頁/共85頁（1）生物活性測定一些蛋白質(zhì)包括酶或酶抑制因子和食品科學(xué)與營養(yǎng)有關(guān)例如肉類嫩化中的蛋白酶、水果成熟中的果膠酶以及豆類中的胰蛋白酶抑制因子都是蛋白質(zhì)。（2）功能性質(zhì)調(diào)查不同種類食品中的蛋白質(zhì)都有其獨(dú)特的食品功能性質(zhì)，例如小麥面粉中的麥醇溶蛋白和麥谷蛋白具有成面團(tuán)性，牛乳中的酪蛋白在干酪制作中具有凝結(jié)作用，而雞蛋卵清蛋白具有起泡能力。（3）營養(yǎng)標(biāo)簽①總蛋白質(zhì)含量；②氨基酸組成；③混合物中的特定蛋白質(zhì)的含量；④蛋白質(zhì)分離純化過程中的蛋白質(zhì)含量；⑤非蛋白氮；

⑥蛋白質(zhì)的營養(yǎng)價(jià)值(消化率、蛋白質(zhì)功效比或氮平衡)蛋白質(zhì)分析的重要性一、含量及測定意義第16頁/共85頁食品種類

蛋白質(zhì)的百分含量食品種類

蛋白質(zhì)的百分含量大米(糙米)大米(白米)小麥粉(整粒)玉米粉(整粒)意大利面條玉米淀粉7.97.113.76.912.80.3大豆(成熟、生）豆(腰子狀、生)豆腐(生、堅(jiān)硬)豆腐(生、普通)36.523.615.88.1食品中蛋白質(zhì)的含量

第17頁/共85頁乳制品牛乳(全脂，液體)牛乳(脫脂、干)切達(dá)干酪酸奶(普通的、低脂)水果和蔬菜蘋果(生、帶皮)蘆筍(生)草莓(生)萵苣(冰、生)土豆(整粒、肉和皮)

3.336.224.95.30.22.30.61.02.1肉、家禽、魚牛肉(頸肉、烤前腿)牛肉(腌制、干牛肉)雞(可供煎炸的雞胸肉)火腿(切片、普通的)雞蛋(生、全蛋)魚(太平洋鱈魚)魚(金槍魚、白色、罐裝、油浸、滴干的固體)

18.529.123.117.612.517.926.5食品中蛋白質(zhì)的含量

測定食品中的蛋白質(zhì)的含量，對(duì)于評(píng)價(jià)食品的營養(yǎng)價(jià)值，合理開發(fā)利用食品資源、提高產(chǎn)品質(zhì)量、優(yōu)化食品配方、指導(dǎo)經(jīng)濟(jì)核算及生產(chǎn)過程控制均具有極其重要的意義。第18頁/共85頁二、蛋白質(zhì)系數(shù)不同的蛋白質(zhì)其氨基酸構(gòu)成比例及方式不同，故各種不同的蛋白質(zhì)其含氮量也不同，一般蛋白質(zhì)含氮量為16%，即一份氮素相當(dāng)于6.25份蛋白質(zhì)，此數(shù)值（6.25）稱為蛋白質(zhì)系數(shù)。不同種類食品的蛋白質(zhì)系數(shù)有所不同，如玉米、蕎麥、青豆、雞蛋等為6.25，花生為5.46，大米為5.95，大豆及其制品為5.71，小麥粉為5.70，牛乳及其制品為6.38。一般手冊上列出了一部分換稱等數(shù)，用時(shí)可查。第19頁/共85頁三、蛋白質(zhì)含量測定常用的方法凱氏定氮法

由Kieldhl于1833年提出，現(xiàn)發(fā)展為常量、微量、自動(dòng)定氮儀法，半微量法及改良凱氏法。凱氏定氮法是目前普遍采用的測定有機(jī)N總量較為準(zhǔn)確、方便的方法之一，適用于所有食品，所以國內(nèi)外應(yīng)用較為廣泛。是經(jīng)典的分析方法之一，也是GB/T5009.5-2003《食品中蛋白質(zhì)的測定》第一法。第20頁/共85頁三、蛋白質(zhì)含量測定常用的方法凱氏定氮法是將蛋白質(zhì)消化，測定其總N量，再換算成為蛋白質(zhì)含量。食品中的含N物質(zhì)，除蛋白質(zhì)中的氮以外，還包括氨基酸、酰胺、核酸等中的氮等少量的非蛋白質(zhì)含N物質(zhì)，所以該法測定的蛋白質(zhì)含量應(yīng)稱為粗蛋白質(zhì)。對(duì)于不同的蛋白質(zhì)，它的組成和結(jié)構(gòu)不同，但從分析數(shù)據(jù)可以得到近似的pro的元素組成百分比。元素CHONSP百分比50723160～30～3第21頁/共85頁（一）、凱氏定氮法凱氏定氮法有常量法、微量法及改良法，其原理基本相同，只是所使用的樣品數(shù)量和儀器不同。而改良的常量法主要是催化劑的種類、硫酸和鹽類添加量不同，一般采用硫酸銅、二氧化鈦或硒、汞等物質(zhì)代替硫酸銅。有些樣品中含有難以分解的含N化合物，如：蛋白質(zhì)中含有色氨酸、賴氨酸、組氨酸、酪氨酸、脯氨酸等，單純以硫酸銅作催化劑，18小時(shí)或更長時(shí)間也難以分解，單獨(dú)用汞化合物，在短時(shí)間內(nèi)即可，但它有毒性。第22頁/共85頁凱氏定氮法常量分析（macroanalysis）：對(duì)0.1g以上的試樣進(jìn)行的分析。半微量分析（semimicroanalysis）：對(duì)10mg～100mg的試樣進(jìn)行的分析。GB/T5413.1-1997嬰幼兒配方食品和乳粉蛋白質(zhì)的測定就是半微量凱氏定氮法微量分析（microanalysis）：對(duì)1mg1～10mg的試樣進(jìn)行的分析。超微量分析（ultramicroanalysis）：對(duì)1mg以下的試樣進(jìn)行的分析。痕量分析（traceanalysis）：對(duì)待測組分的質(zhì)量分?jǐn)?shù)小于0.01%的分析。超痕量分析（ultratraceanalysis）：對(duì)待測組分的質(zhì)量分?jǐn)?shù)小于0.0001%的分析。GB/T14666-2003分析化學(xué)術(shù)語第23頁/共85頁（1）常量凱氏定氮法原理樣品與濃硫酸和催化劑一同加熱消化，使蛋白質(zhì)分解，其中碳和氫被氧化為二氧化碳和水逸出，而樣品中的有機(jī)氮轉(zhuǎn)化為氨與硫酸結(jié)合成硫酸銨。然后加堿蒸餾，使氨蒸出，用硼酸吸收后再用標(biāo)準(zhǔn)酸滴定，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)酸消耗量可計(jì)算出樣品中蛋白質(zhì)含量。第24頁/共85頁凱氏燒瓶500mL或250mL

龍科A—?jiǎng)P氏定氮儀扭力天平分析天平5mL移液管溫度可以控制的電爐小漏斗滴定管250mL錐形瓶玻璃珠儀器（GB/T5009.5-2003《食品中蛋白質(zhì)的測定》第一法）第25頁/共85頁儀器第26頁/共85頁硫酸銅(CuSO4?5H2O)硫酸鉀硫酸(密度為1.8419g/L)硼酸溶液(20g/L)氫氧化鈉溶液(400g/L)鹽酸標(biāo)準(zhǔn)滴定溶液[c(HCl)=0.0500mol/L]或硫酸標(biāo)準(zhǔn)滴定溶液[c(1/2H2SO4)=0.0500mol/L]混合指示液：1份甲基紅乙醇溶液(1g/L)與5份溴甲酚綠乙醇溶液(1g/L)，臨用時(shí)混合。(也可用2份甲基紅乙醇溶液(1g/L)與1份次甲基藍(lán)乙醇溶液(1g/L)臨用時(shí)混合)。試劑（GB/T5009.5-2003《食品中蛋白質(zhì)的測定》第一法）第27頁/共85頁（GB/T601-2002化學(xué)試劑標(biāo)準(zhǔn)滴定溶液的制備1、配制按下表的規(guī)定量取鹽酸，注入1000mL水中，搖勻。常用酸堿濃度表(市售商品)（GB/T5009.1-2003食品衛(wèi)生檢驗(yàn)方法理化部分總則）鹽酸標(biāo)準(zhǔn)滴定溶液的濃度[c(HCl)]mol/L鹽酸的體積V/mL1900.5450.19試劑名稱分子量含量/(%)(質(zhì)量分?jǐn)?shù))相對(duì)密度濃度/(mol/L)鹽酸36.536～381.18(約)12(HCl)硝酸63.0265～681.416(HNO3)高氯酸100.5701.6712(HClO4)磷酸98.0851.7015(H3PO4)硫酸98.196～981.84(約)18(H2SO4)鹽酸標(biāo)準(zhǔn)滴定溶液配制與標(biāo)定[c(HCl)=0.0500mol/L]第28頁/共85頁2、標(biāo)定按下表的規(guī)定稱取于270～300℃高溫爐中灼燒至恒重的工作基準(zhǔn)試劑無水碳酸鈉，溶于50mL水中，加10滴溴甲酚綠-甲基紅指示液，用配制好的鹽酸溶液滴定至溶液由綠色變?yōu)榘导t色，煮沸2min，冷卻后繼續(xù)滴定至溶液再呈暗紅色。同時(shí)做空白試驗(yàn)。說明：稱量工作基準(zhǔn)試劑的質(zhì)量的數(shù)值小于等于0.5g時(shí)，按精確至0.01mg稱量;數(shù)值大于0.5g時(shí)，按精確至0.1mg稱量。在標(biāo)定和使用標(biāo)準(zhǔn)滴定溶液時(shí)，滴定速度一般應(yīng)保持在6～8mL/min。鹽酸標(biāo)準(zhǔn)滴定溶液的濃度[c(HCl)]mol/L工作基準(zhǔn)試劑無水碳酸鈉的質(zhì)量m/g

11.90.50.950.10.2第29頁/共85頁制備標(biāo)準(zhǔn)滴定溶液的濃度值應(yīng)在規(guī)定濃度值的±5%范圍以內(nèi)。標(biāo)準(zhǔn)滴定溶液的濃度小于等于0.02mol/L時(shí)，應(yīng)于臨用前將濃度高的標(biāo)準(zhǔn)滴定溶液用煮沸并冷卻的水稀釋，必要時(shí)重新標(biāo)定。除另有規(guī)定外，標(biāo)準(zhǔn)滴定溶液在常溫15～25℃下保存時(shí)間一般不超過兩個(gè)月。當(dāng)溶液出現(xiàn)渾濁、沉淀、顏色變化等現(xiàn)象時(shí)，應(yīng)重新制備。貯存標(biāo)準(zhǔn)滴定溶液的容器，其材料不應(yīng)與溶液起理化作用，壁厚最薄處不小于0.5mm。第30頁/共85頁（GB/T601-2002化學(xué)試劑標(biāo)準(zhǔn)滴定溶液的制備）1、配制按下表的規(guī)定量取硫酸，緩緩?fù)?000mL水中，冷卻，搖勻。2、標(biāo)定按下表的規(guī)定稱取于270～300℃高溫爐中灼燒至恒重的工作基準(zhǔn)試劑無水碳酸鈉，溶于50mL水中，加10滴溴甲酚綠-甲基紅指示液，用配制好的硫酸溶液滴定至溶液由綠色變?yōu)榘导t色，煮沸2min，冷卻后繼續(xù)滴定至溶液再呈暗紅色。同時(shí)做空白試驗(yàn)。硫酸標(biāo)準(zhǔn)滴定溶液的濃度[c(1/2H2SO4)]

mol/L硫酸的體積V/mL1300.5150.13硫酸標(biāo)準(zhǔn)滴定溶液的濃度[c(1/2H2SO4)]/mol/L工作基準(zhǔn)試劑無水碳酸鈉的質(zhì)量m/g

11.90.50.950.10.2硫酸標(biāo)準(zhǔn)滴定溶液

[c(1/2H2SO4)=0.0500mol/L]第31頁/共85頁溴甲酚綠－甲基紅指示液（GB/T5009.5-2003《食品中蛋白質(zhì)的測定》第一法）（GB/T603-2002化學(xué)試劑試驗(yàn)方法中所用制劑及制品的制備）溶液I：稱取0.1g溴甲酚綠，溶于乙醇(95%)，用乙醇(95%)稀釋至100mL。溶液Ⅱ：稱取0.2g甲基紅，溶于乙醇(95%)，用乙醇(95%)稀釋至100mL。取30mL溶液I、10mL溶液Ⅱ，混勻。

第32頁/共85頁消化蒸餾吸收滴定凱氏定氮法步驟第33頁/共85頁總反應(yīng)式：2NH2（CH2）2COOH+13H2SO4

（NH4）2SO4+6CO2+12SO2+16H2O（一定要用濃硫酸-98%）樣品消化<1>加硫酸鉀作為增溫劑，提高溶液沸點(diǎn)，純硫酸沸點(diǎn)

340℃，加入硫酸鉀之后可以提高至400℃以上。也可加入硫酸鈉，氯化鉀等提高沸點(diǎn)，但效果不如硫酸鉀。第34頁/共85頁為縮短消化時(shí)間硫酸銅

作為催化劑同時(shí)作為消化終點(diǎn)指示劑。也可加氧化汞、汞（均有毒，價(jià)格貴）、硒粉、二氧化鈦。所以有機(jī)物全部消化后，出現(xiàn)硫酸銅的蘭綠色，它具有催化功能，還可以作為堿性反應(yīng)指示劑。氧化劑

如雙氧水、次氯酸鉀等加速有機(jī)物氧化速度。第35頁/共85頁樣品消化要注意防止爆沸第36頁/共85頁消化液+40%氫氧化鈉加熱蒸餾，放出氨氣。2NaOH+（NH4）2SO42NH3+Na2SO4+H2O蒸餾第37頁/共85頁蒸餾:

一：加入氫氧化鈉溶液要過量;

二：要防止樣液中氨氣逸出。

第38頁/共85頁<1>用4%硼酸吸收，用鹽酸標(biāo)準(zhǔn)溶液滴定，指示劑用混合指示劑（甲基紅—溴甲基酚綠混合指示劑）國標(biāo)用亞甲基蘭+甲基紅。指示劑紅色綠色紅色

（酸）

（堿）

（酸）吸收滴定吸收與滴定2NH3+4H3BO3(NH4)2B4O7(NH4)2B4O7+5H2O+2HCl2NH4Cl+4H3BO3

<2>用過量的H2SO4

或HCl標(biāo)準(zhǔn)溶液吸收，再用NaOH標(biāo)準(zhǔn)溶液滴定過剩的酸液，用甲基紅指示劑。第39頁/共85頁凱氏定氮法分析步驟再次說明（一）試樣處理1、稱樣(約相當(dāng)?shù)?0～40mg)（1）固體試樣：0.20～2.00g（2）半固體試樣：2.00～5.00g（3）液體試樣：10.00～25.00mL

2、消化準(zhǔn)備將試樣移入洗凈、烘干、編號(hào)的100mL或500mL的凱氏燒瓶內(nèi)，加入0.2g硫酸銅，6g硫酸鉀及20mL硫酸，加入2粒～3粒玻璃珠，稍搖勻后于瓶口放一小漏斗，將瓶以45°角斜支于有小孔的石棉網(wǎng)上。GB/T5009.5-2003《食品中蛋白質(zhì)的測定》第一法）第40頁/共85頁3、消化將準(zhǔn)備好的凱氏燒瓶以45°斜放于溫控電爐上（先墊上石棉網(wǎng)），開始用微火小心加熱，（小心瓶內(nèi)泡沫沖出而影響結(jié)果?。?，待內(nèi)容物全部炭化,泡沫完全停止，瓶內(nèi)有白煙冒出后，升至中溫，白煙散盡后升至高溫，加強(qiáng)火力,并保持瓶內(nèi)液體微沸,（為加快消化速度,可分?jǐn)?shù)次加入10mL30%過氧化氫溶液，但必須將燒瓶冷卻數(shù)分鐘以后加入?。?經(jīng)常轉(zhuǎn)動(dòng)燒瓶，觀察瓶內(nèi)溶液顏色的變化情況，當(dāng)燒瓶內(nèi)容物的顏色逐漸轉(zhuǎn)化成藍(lán)綠色澄清透明后，再繼續(xù)加熱0.5～1h。然后取下并使之冷卻。

消化（若凱氏燒瓶壁粘有碳化粒時(shí)，進(jìn)行搖動(dòng)或待瓶中內(nèi)容物冷卻數(shù)分鐘后，用過氧化氫溶液沖下，繼續(xù)消化至透明為止）。第41頁/共85頁4、定容將消化好并冷卻至室溫的樣品消化液加入20mL蒸餾水搖勻放冷，小心轉(zhuǎn)移到100mL容量瓶中，再用蒸餾水少量多次洗滌凱氏燒瓶，并將洗液一并轉(zhuǎn)入容量瓶中，直至燒瓶洗至中性，表明銨鹽無損地移入容量瓶中，充分搖勻后，靜置至室溫，加水至刻度線定容，混勻備用。同樣條件下做一試劑空白試驗(yàn)。消化第42頁/共85頁蒸餾（二）蒸餾1、水蒸汽發(fā)生器的準(zhǔn)備：按要求安裝好定氮裝置，保證管路密閉不漏氣。于水蒸氣發(fā)生瓶內(nèi)裝水至2/3處，加甲基紅指示劑3滴及3～5mL硫酸，以保持水呈酸性（防止水中含有N，加硫酸使成為(NH4)2SO4形式固定下來，蒸餾中不會(huì)被蒸發(fā)），開通電源加熱煮沸水蒸氣發(fā)生瓶內(nèi)的水。第43頁/共85頁蒸餾2、清洗凱氏定氮儀：打開進(jìn)氣口，關(guān)閉廢液出口，接通冷凝水，空蒸5～10min，沖冼定N儀、樣杯、堿杯和內(nèi)室。分別關(guān)閉進(jìn)氣口（注意不要同時(shí)關(guān)閉所有進(jìn)氣口?。?，使廢液自動(dòng)倒吸于定氮儀外室，再由樣杯加入少量水，沖冼再次，當(dāng)廢液全部吸入外室后，再放排液口，并使其敞開。3、吸收液準(zhǔn)備：在250mL錐形瓶中加入10mL(20g/L)硼酸溶液和1～3滴混合指示劑，放置冷凝器的下端，并使冷凝管下端插入液面下。第44頁/共85頁4、蒸餾準(zhǔn)備：準(zhǔn)確吸取10mL試樣處理液，由樣杯（小漏斗）流入定氮儀內(nèi)室（反應(yīng)室），并用10mL水沖洗樣杯（小漏斗）使流入定氮儀內(nèi)室（反應(yīng)室內(nèi)）[但內(nèi)室中溶液總體積不超過內(nèi)室的2/3(約50mL)]，塞緊棒狀玻塞，加水至杯口1～2cm，以防漏氣，關(guān)閉排液口，迅速由堿杯緩緩加入10mL氫氧化鈉溶液(400g/L)，夾緊螺旋夾，通入蒸汽開始蒸餾。蒸餾第45頁/共85頁5、蒸餾：關(guān)閉排液口，蒸汽進(jìn)入反應(yīng)室（內(nèi)室），NH3通過冷凝管進(jìn)入接收瓶被硼酸吸收，蒸餾5min，移開接收瓶，使冷凝管下端離開液面，再蒸餾1min，然后，用少量水沖冼冷凝管下端外部，洗液一并聚集于硼酸溶液中。

6、收尾：關(guān)閉進(jìn)氣口，停止送氣，廢液將自動(dòng)倒吸入外室，待倒吸完全時(shí)，將樣杯中的蒸餾水分?jǐn)?shù)次放入，沖冼內(nèi)室，待洗液全部吸入外室后，再打開排液口，放凈廢液。按上述步驟，換下一試樣蒸餾。同時(shí)準(zhǔn)確吸取10mL試劑空白消化液作空白試驗(yàn)。蒸餾第46頁/共85頁滴定取下接收瓶，以硫酸或鹽酸標(biāo)準(zhǔn)滴定溶液(0.05mol/L)滴定至灰色或藍(lán)紫色為終點(diǎn)。第47頁/共85頁結(jié)果計(jì)算W—蛋白質(zhì)含量；c—鹽酸標(biāo)準(zhǔn)液的濃度，mol/L；V1—滴定樣品蒸餾液消耗鹽酸標(biāo)準(zhǔn)液體積，mL；V2—滴定空白蒸餾液消耗鹽酸標(biāo)準(zhǔn)液體積，mL；m—樣品質(zhì)量，g；M-1/2N2的摩爾質(zhì)量，14.01g/mol;F—蛋白質(zhì)系數(shù).第48頁/共85頁.適用范圍此法用于各類食品中蛋白質(zhì)含量的測定，是國家標(biāo)準(zhǔn)分析方法。第49頁/共85頁.說明所用試劑溶液應(yīng)用無氨蒸餾水配制;消化時(shí)不要用強(qiáng)火，應(yīng)保持緩和沸騰，以免粘貼在凱氏瓶內(nèi)壁上的含氮化合物在無硫酸存在的情況下消化不完全而造成氮損失;消化時(shí)應(yīng)注意不時(shí)轉(zhuǎn)動(dòng)凱氏燒瓶，以便利用冷凝酸液將附在瓶壁上的固體殘?jiān)聪拢⒋龠M(jìn)其消化完全;第50頁/共85頁樣品中若含脂肪較多時(shí)，消化過程中易產(chǎn)生大量泡沫，為防止泡沫溢出瓶外，在開始消化時(shí)應(yīng)用小火加熱，并時(shí)時(shí)搖動(dòng)；或者加入少量辛醇或液體石蠟或硅油消泡劑，并同時(shí)注意控制熱源強(qiáng)度;當(dāng)樣品消化液不易澄清透明時(shí)，可將凱氏燒瓶冷卻，加入30％過氧化氫2—3mL后再繼續(xù)加熱消化;第51頁/共85頁若取樣量較大，如干試樣超過5g可按每克試樣5mL的比例增加硫酸用量;—般消化至呈透明后，繼續(xù)消化30分鐘即可，但對(duì)于含有特別難以消化的樣品，如含賴氨酸、組氨酸、色氨酸、酪氨酸或脯氨酸等時(shí)，需適當(dāng)延長消化時(shí)間。有機(jī)物如分解完全，消化液呈藍(lán)色或淺綠色，但含鐵量多時(shí)，呈較深綠色;蒸餾裝置不能漏氣;第52頁/共85頁蒸餾前若加堿量不足，消化液呈藍(lán)色不生成氫氧化銅沉淀，此時(shí)需再增加氫氧化鈉用量;

蒸餾完畢后，應(yīng)先將冷凝管下端提離液面清洗管口，再蒸1分鐘后關(guān)掉熱源，否則可能造成吸收液倒吸。第53頁/共85頁（二）、 微量凱氏定氮法1、原理及適用范圍同前2、與常量法不同點(diǎn)：加入硼酸量由50mL10mL,滴定用鹽酸濃度由0.1mol/L

0.01mol/L,可用微量滴定管。第54頁/共85頁10-210-2第55頁/共85頁

（三）、 全自動(dòng)凱氏定氮法

1、原理及適用范圍同前2、特點(diǎn)：（1）消化裝置用優(yōu)質(zhì)玻璃制成的凱氏消化瓶，紅外線加熱的消化爐。（2）快速：一次可同時(shí)消化8個(gè)樣品，30分鐘可消化完畢。（3）自動(dòng)：自動(dòng)加堿蒸餾，自動(dòng)吸收和滴定，自動(dòng)數(shù)字顯示裝置?？捎?jì)算總氮百分含量并記錄，12分鐘完成1個(gè)樣。第56頁/共85頁產(chǎn)品名稱：凱氏定氮儀

第57頁/共85頁操作視頻微量凱氏定氮法：/v_show/id_XODIwODI3NDQ0.html?from=y1.2-1-87.3.2-1.1-1-1-1凱氏定氮法/v_show/id_XNzExNDIwMzI=.html?from=y1.2-1-103.3.16-1.1-1-1-15（7m54s)第58頁/共85頁傳統(tǒng)的凱氏定氮法應(yīng)用范圍廣，靈敏度高、準(zhǔn)確，不要大儀器，但費(fèi)時(shí)，有環(huán)境污染。新開發(fā)的：（四）、雙縮脲法雙縮脲法紫外分光光度法染料結(jié)合法、水楊酸比色法等第59頁/共85頁脲（尿素）NH2-CO-NH2加熱至150～160℃時(shí)，兩分子縮合成雙縮脲。雙縮脲能和硫酸銅的堿性溶液生成紫色絡(luò)和物，這種反應(yīng)叫雙縮脲反應(yīng)。（縮二脲反應(yīng)）蛋白質(zhì)分子中含有肽鍵“–CO-NH-”與雙縮脲結(jié)構(gòu)相似。在同樣條件下也有呈色反應(yīng)，在一定條件下，其顏色深淺與蛋白質(zhì)含量成正比，可用分光光度計(jì)來測其吸光度，確定含量。（560nm）NH2-CO-NH-CO-NH2+NH3NH2-CO-NH2+NH2-CO-NH2原理第60頁/共85頁2. 方法特點(diǎn)及應(yīng)用范圍靈敏度較低，但操作簡單快速，故在生物化學(xué)領(lǐng)域中測定蛋白質(zhì)含量時(shí)常用此法。本法亦適用于豆類、油料、米谷等作物種子及肉類等樣品測定。

3.主要儀器：分光光度計(jì)，離心機(jī)（4000r/min）

4.試劑：

(1)堿性硫酸銅溶液

(2)四氯化碳（四）、雙縮脲法第61頁/共85頁5．操作方法：采用凱氏法測出的蛋白質(zhì)樣品為標(biāo)準(zhǔn)樣繪標(biāo)準(zhǔn)曲線。6.說明：測蛋白質(zhì)時(shí)叫雙縮脲法，并不另加雙縮脲。樣品不用消化。（四）、雙縮脲法第62頁/共85頁1．原理：利用蛋白質(zhì)的特有基團(tuán)│R（—NH—CH—CO）對(duì)紫外光有吸收作用，在280nm下，吸光度與蛋白質(zhì)濃度成直線關(guān)系，求含量。（五）、紫外吸收法第63頁/共85頁2．適用范圍：常用于生物化學(xué)工作，因?yàn)楦蓴_因素多，故在食品分析領(lǐng)域應(yīng)用不廣泛。3．主要儀器：

①紫外分光光度計(jì)；②離心機(jī)：3000-5000r/min4．操作：用凱氏法測定標(biāo)樣做標(biāo)準(zhǔn)曲線。第64頁/共85頁第五節(jié)氨基酸的定性測定利用各種顯色反應(yīng)：P134-138茚三酮法吲哚醌法鄰苯二甲醛法第65頁/共85頁第六節(jié)氨基酸定量測定1.原理：氨基酸本身有堿性（-NH2-），又有酸性（-COOH），成中性內(nèi)鹽，加入甲醛溶液后，與-NH2-結(jié)合，堿性消失，再用強(qiáng)堿來滴定-COOH基。2．特點(diǎn)：適用于發(fā)酵工業(yè)，如發(fā)酵液中含氮量，其發(fā)酵過程中氮量減少情況等。適于食品中游離氨基酸的測定。一．氨基酸的一般定量測定

（一）甲醛滴定法第66頁/共85頁3．雙指示劑：①40%中性甲醛溶液：以百里酚酞作指示劑，用氫氧化鈉將40%甲醛中和至藍(lán)色。②0.1%百里酚酞乙醇溶液；③0.1%中性紅50%乙醇溶液；④0.1mol/L氫氧化鈉標(biāo)液。（一）甲醛滴定法第67頁/共85頁（一）甲醛滴定法其它酸性物質(zhì)：+中性紅指示劑+NaOH甲醛滴定法氨基酸含量：二者之差氨基酸的羧基與其它酸性物質(zhì)：+百里酚酞+中性甲醛+NaOH4.操作第68頁/共85頁（二）茚三酮的比色法原理：氨基酸在一定條件下與茚三酮起反應(yīng)，生成藍(lán)紫色化合物，可比色定量。二．個(gè)別氨基酸的定量測定8種氨基酸的定量測定方法：P147第69頁/共85頁一種微量而快速的層析方法，它把吸附劑或支持劑均勻的鋪在玻璃板上成一薄層，把樣品點(diǎn)在薄層上，然后用合適的溶劑展開，從而達(dá)到分離、鑒定和定量的目的。因?yàn)閷游鲈诒由线M(jìn)行，所以稱為薄層層析。它的應(yīng)用范圍比紙上層析更廣泛，常用來分析氨基酸、農(nóng)藥殘留量、黃曲霉毒素等。第七節(jié)氨基酸的分離與測定一．薄層色譜法：薄層層析法（TLC法）第70頁/共85頁取一定量經(jīng)水解的樣品溶液，滴在制好的薄層板上，在溶劑系統(tǒng)中進(jìn)行雙向上行法展開，樣品各組分在薄層板上經(jīng)過多次的被吸附、解吸、交換等作用，同一物質(zhì)具有相同的Rf值，不同成分則有不同的Rf值，因而各種混合物可達(dá)到彼此被分離的目的。然后用茚三酮顯色，與標(biāo)準(zhǔn)氨基酸進(jìn)行對(duì)比，鑒別各種氨基酸種類，從顯色斑點(diǎn)顏色的深淺可以大致確定其含量。（一）原理第71頁/共85頁Rf=a/b樣點(diǎn)ab溶劑前沿點(diǎn)樣原點(diǎn)第72頁/共85頁（二）優(yōu)、缺點(diǎn)優(yōu)點(diǎn)展開時(shí)間短，一般在20-30min，展開距離通常只需10cm，且分離效果好。層析后得到的斑點(diǎn)小而清晰；能夠使用多種顯色劑；點(diǎn)樣量少，靈敏度高，比紙層析高10