蛋白質(zhì)基本機構(gòu)和功能

蛋白質(zhì)基本機構(gòu)和功能第1頁/共79頁主要內(nèi)容蛋白質(zhì)的分子組成蛋白質(zhì)的分子結(jié)構(gòu)蛋白質(zhì)的理化性質(zhì)蛋白質(zhì)的分離純化第2頁/共79頁蛋白質(zhì)(Protein)的種類繁多大腸桿菌約含蛋白質(zhì)3000種，人體內(nèi)含蛋白質(zhì)10萬余種。蛋白質(zhì)是細胞中含量最豐富的生物大分子約占人體固體成分的45%，可達細胞干重的70%。第3頁/共79頁

蛋白質(zhì)是生命的物質(zhì)基礎(chǔ)1.催化功能2.調(diào)節(jié)功能3.支持功能4.運輸功能5.營養(yǎng)功能6.運動功能7.防御功能8.識別功能9.信息傳遞功能10.凝血與抗凝血功能

蛋白質(zhì)的生物學功能第4頁/共79頁第一節(jié)蛋白質(zhì)的分子組成第5頁/共79頁C50~55%H6~7%O19~24%N13~19%S0~4%有些蛋白質(zhì)還含有P、Fe、Cu、Mn、Zn、Se等。各種蛋白質(zhì)含氮量接近，平均為16%；樣品測定中1克氮相當于含6.25克蛋白質(zhì)（凱氏定氮法）

。

一、蛋白質(zhì)的元素組成第6頁/共79頁二、蛋白質(zhì)的基本組成單位——氨基酸

蛋白質(zhì)受酸、堿或蛋白酶水解產(chǎn)生游離氨基酸。因此，組成蛋白質(zhì)的基本單位是——氨基酸(aminoacid)

。第7頁/共79頁

（一）氨基酸的分類

根據(jù)R側(cè)鏈基團的結(jié)構(gòu)和性質(zhì)的不同，可將20種氨基酸分為4類：

1.非極性疏水性氨基酸

2.極性中性氨基酸

3.酸性氨基酸

4.堿性氨基酸第8頁/共79頁

1.非極性疏水氨基酸側(cè)鏈為烴基、吲哚環(huán)、甲硫基等疏水性基團。這類氨基酸在水中的溶解度小于極性中性氨基酸。

2.極性中性氨基酸側(cè)鏈為羥基、巰基、或酰氨基等極性基團，有親水性，但在中性水溶液中不電離的氨基酸。第9頁/共79頁

3.酸性氨基酸側(cè)鏈上有羧基，在水溶液中能釋放出H+而帶負電荷的氨基酸。有谷氨酸、天冬氨酸。

4.堿性氨基酸側(cè)鏈上有氨基、胍基或咪唑基，在水溶液中能結(jié)合H+而帶正電荷的氨基酸。有賴氨酸、精氨酸和組氨酸等。第10頁/共79頁POLARNON-POLARTyrHisGlyAcidicNeutralBasicAspGluGlnCysAsnSerThrLysArgAlaValIleLeuMetPheTrpPro氨基酸按照極性分類極性或非極性，是氨基酸性質(zhì)的基礎(chǔ)第11頁/共79頁LeuL-C-C-CONH2-C-CONH2-C-COOH-C-C-COOH-H-CH3-C-OH-C-SH-C-C-S-CPPro-C-CCNN+

-C-C-C-C-NH3+-C--C--OH-C-NSouthlineCircularlineCentrallineNorthwestlineAliphaticAmideAcidicImino,CircularBasicSulfurHydroxyAromatic-C-C-C-N-C-N

N+=

C-C-C-C

C-C-C-C

CC-C

CCCHNC-COOH

a-C-C

OHGlnQAspDGluEPheFArgRLysKHisHGlyGAAAlaVValI

IleSerSThrTCysC氨基酸代謝圖TrpWNon-polarPolarArgRTyrYAsnNMetM第12頁/共79頁(二)氨基酸的理化性質(zhì)1.物理性質(zhì)

都是白色晶體，熔點較高。能溶于強酸和強堿溶液；在水中的溶解度各不相同。2.兩性解離與等電點氨基酸是兩性電解質(zhì)，其解離方式取決于所處溶液的酸堿度。

第13頁/共79頁氨基酸的等電點（isoelectricpoint,pI)

在某一pH溶液中，氨基酸解離成陽離子和陰離子的趨勢及程度相等，成為兼性離子，呈電中性，此時溶液的pH稱為該蛋白質(zhì)的等電點。第14頁/共79頁

3.紫外吸收性質(zhì)

色氨酸、酪氨酸和苯丙氨酸對紫外光有吸收作用。其最大吸收峰在280nm附近，以色氨酸吸收最強。利用此性質(zhì)可采用紫外分分光度法測定溶液中蛋白質(zhì)的含量。第15頁/共79頁4.氨基酸的化學反應（1）茚三酮反應

氨基酸與水合茚三酮在溶液中共熱，發(fā)生一系列反應，生成藍紫色化合物，其最大吸收峰在570nm。此反應可用于氨基酸的定性和定量分析。

注：脯氨酸、羥脯氨酸與茚三酮反應產(chǎn)生

黃色化合物。

氨基酸分析儀圖解AspThrThrLysGlyGluSerProAlaCysValMetIleLeuTyrPheHisNH3Arg0.20.41.00.60.8光吸收流出液(mL)15cm柱，pH3.25，0.067mol/L檸檬酸鈉15cm柱，pH4.25，0.067mol/L檸檬酸鈉15cm柱，pH5.25，0.12mol/L檸檬酸鈉緩沖液泵顯色反應管茚三酮泵已分開的氨基酸離子交換柱樣品注入口記錄儀光電倍增管光源第17頁/共79頁（2）與亞硝酸反應:VanSlyke法測定氨基酸氨基酸的氨基在室溫下與亞硝酸作用，生成氮氣。通過在標準條件下測定生成的氮氣體積，即可計算出氨基酸的量。生成的氮氣只有一半來自氨基酸?？捎糜诎被岫亢偷鞍踪|(zhì)水解程度的測定。第18頁/共79頁（3）桑格（Sanger)反應

氨基酸的－NH2與2，4一二硝基氟苯（DNFB）反應，生成DNP-氨基酸；黃色，提取、層析法鑒定來測定氨基酸。第19頁/共79頁（4）丹磺酰氯（DNS-Cl）反應氨基酸的－NH2與DNS反應；由于丹磺酰氯基具有強烈的熒光，靈敏度比DNFB法高100倍，并且水解后的DNS－氨基酸不需要提取，可直接用紙電泳或薄層層析加以鑒定。第20頁/共79頁(5)埃德曼反應(Edmanreaction）苯異硫氰酸酯，PITC苯乙內(nèi)酰硫脲衍生物（PTH-氨基酸），無色，可以用層析法分離鑒定。被Edman用來鑒定多肽的NH2末端氨基酸第21頁/共79頁三、氨基酸在蛋白質(zhì)分子中的連接方式（一）肽鍵和肽

肽鍵（peptidebond)是由一個氨基酸分子的α-羧基與另一個氨基酸的α-氨基脫水縮合形成的化學鍵。第22頁/共79頁第23頁/共79頁命名、編號第24頁/共79頁第二節(jié)蛋白質(zhì)的分子結(jié)構(gòu)第25頁/共79頁蛋白質(zhì)是由許多氨基酸單位通過肽鍵連接形成的具有特定分子結(jié)構(gòu)的高分子化合物。蛋白質(zhì)的分子結(jié)構(gòu)可分為一級、二級、三級和四級。一級結(jié)構(gòu)是蛋白質(zhì)的基本結(jié)構(gòu)，二級、三級、四級結(jié)構(gòu)稱為高級或空間構(gòu)象。第26頁/共79頁一、蛋白質(zhì)的一級結(jié)構(gòu)概念

是指蛋白質(zhì)分子中氨基酸的排列順序。主要的化學鍵

肽鍵、有些蛋白質(zhì)還含有二硫鍵。

一級結(jié)構(gòu)是決定蛋白質(zhì)空間構(gòu)象和特異生物學功能的基礎(chǔ)，但不是決定蛋白質(zhì)空間構(gòu)象唯一因素。第27頁/共79頁二、蛋白質(zhì)的空間結(jié)構(gòu)空間結(jié)構(gòu)指蛋白質(zhì)分子內(nèi)各原子圍繞某些共價鍵的旋轉(zhuǎn)而形成的各種空間排布及相互關(guān)系，稱為蛋白質(zhì)的構(gòu)象。蛋白質(zhì)的構(gòu)象分為主鏈構(gòu)象和側(cè)鏈構(gòu)象。第28頁/共79頁（一）蛋白質(zhì)的二級結(jié)構(gòu)

概念

是指蛋白質(zhì)多肽鏈主鏈原子局部的空間排列，不涉及氨基酸殘基側(cè)鏈的構(gòu)象。維系蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)的主要化學鍵是氫鍵。第29頁/共79頁

2.蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)的主要形式α-螺旋β-折疊β-轉(zhuǎn)角無規(guī)卷曲第30頁/共79頁

（1）α-螺旋第31頁/共79頁α-螺旋的結(jié)構(gòu)特點

①多肽鏈以肽鍵平面為單位，α-碳原子為轉(zhuǎn)折點，有規(guī)律的盤繞成右手螺旋結(jié)構(gòu)。②每3.6個氨基酸殘基盤繞一圈，螺距為0.54nm。③相鄰螺旋的肽鍵之間形成氫鍵，方向與長軸基本平行，維持螺旋的穩(wěn)定。④R基團伸向螺旋外側(cè)，其大小、形狀及電荷性質(zhì)均影響α-螺旋的形成。第32頁/共79頁（2）β-折疊

第33頁/共79頁

β-折疊的結(jié)構(gòu)特點①多肽鏈呈伸展狀態(tài)，肽鍵平面沿長軸折疊呈鋸齒狀，兩平面間夾角為110°，R基交替地伸向鋸齒狀結(jié)構(gòu)的上下方。②若干肽段互相靠攏，平行排列，通過氫鍵連接。氫鍵的方向與長軸垂直。③若兩條肽段走向一致（N端、C端方向相同），稱為順向平行；反之，稱之為逆向平行，逆向更穩(wěn)定。

第34頁/共79頁β-折疊包括平行式和反平行式兩種類型

第35頁/共79頁（3）β-轉(zhuǎn)角

第36頁/共79頁β-轉(zhuǎn)角的特點

①主鏈骨架本身以大約180°回折②回折部分通常由4個氨基酸殘基構(gòu)成③構(gòu)象依靠第一殘基的-CO基與第四殘基的-NH基之間形成氫鍵來維系。

第37頁/共79頁

（4）無規(guī)卷曲

是指多肽鏈中除了以上幾種比較規(guī)則的構(gòu)象外，其余沒有確定規(guī)律性的那部分肽鏈構(gòu)象。

第39頁/共79頁（二）蛋白質(zhì)的三級結(jié)構(gòu)概念

是指整條肽鏈中所有原子的空間排布，它包括主鏈構(gòu)象和側(cè)鏈構(gòu)象。主要化學鍵

疏水鍵、氫鍵、鹽鍵等非共價鍵和二硫鍵。疏水鍵是維持三級結(jié)構(gòu)穩(wěn)定的最主要作用力。第40頁/共79頁結(jié)構(gòu)域（domain）

分子量大的蛋白質(zhì)在形成三級結(jié)構(gòu)時，肽鏈中某些局部的二級結(jié)構(gòu)匯集在一起，形成發(fā)揮生物學功能的特定區(qū)域，稱為結(jié)構(gòu)域。纖連蛋白(fibronectin)第41頁/共79頁由一條多肽鏈形成的蛋白質(zhì)，其最高級結(jié)構(gòu)為三級結(jié)構(gòu)。只有具有三級結(jié)構(gòu)的蛋白質(zhì)才具有生物學活性。第42頁/共79頁

（三）蛋白質(zhì)的四級結(jié)構(gòu)許多蛋白質(zhì)分子是由兩條或兩條以上具有獨立三級結(jié)構(gòu)的多肽鏈通過非共價鍵聚合而成，其中每條具有獨立三級結(jié)構(gòu)的多肽鏈稱為亞基。

概念

蛋白質(zhì)分子中各亞基之間的空間排布和相互接觸關(guān)系。

化學鍵氫鍵、鹽鍵、范氏引力、疏水鍵等非共價鍵。第43頁/共79頁蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)中應注意的幾個問題由一條多肽鏈形成的蛋白質(zhì)其最高級結(jié)構(gòu)為三級，具有三級結(jié)構(gòu)的蛋白質(zhì)才具有生物學活性。形成蛋白質(zhì)的四級結(jié)構(gòu)至少要有兩條多肽鏈。兩條或兩條以上的多肽鏈靠共價鍵連接的蛋白質(zhì)沒有四級結(jié)構(gòu)。由一條多肽鏈形成的蛋白質(zhì)與亞基不同。第44頁/共79頁三、蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)與功能

蛋白質(zhì)一級結(jié)構(gòu)與功能的關(guān)系

一級結(jié)構(gòu)決定蛋白質(zhì)的空間結(jié)構(gòu)；一級結(jié)構(gòu)決定蛋白質(zhì)的生物學功能。蛋白質(zhì)空間結(jié)構(gòu)與功能的關(guān)系

蛋白質(zhì)構(gòu)象是其生物學功能的基礎(chǔ)，構(gòu)象改變功能改變。第45頁/共79頁第三節(jié)蛋白質(zhì)的理化性質(zhì)第46頁/共79頁一、蛋白質(zhì)的兩性解離與等電點

1.蛋白質(zhì)是兩性電解質(zhì)

蛋白質(zhì)分子中可解離的基團

多肽兩端游離的α-氨基和α-羧基多肽側(cè)鏈R上解離的基團

決定蛋白質(zhì)解離成正負離子的因素蛋白質(zhì)所含酸性和堿性基團的數(shù)目蛋白質(zhì)所在溶液的pH值第47頁/共79頁2.蛋白質(zhì)的等電點（pI）

當?shù)鞍踪|(zhì)溶液處于某一pH時，蛋白質(zhì)解離成正、負離子的趨勢相等，即成為兼性離子，凈電荷為零，此時溶液的pH稱為蛋白質(zhì)的等電點。蛋白質(zhì)等電點性質(zhì)為電泳分離的依據(jù)。

第48頁/共79頁Pr(pH＜pI)(pH＝pI)(pH＞pI)蛋白質(zhì)的陽離子蛋白質(zhì)的兼性離子蛋白質(zhì)的陰離子NH2COO-PrNH3+COOHPrNH3+COO-OH-H+OH-H+第49頁/共79頁

體內(nèi)大多數(shù)蛋白質(zhì)的等電點在pH5.0左右，因而在生理條件下以陰離子形式存在。第50頁/共79頁3.電泳

帶電粒子在電場中向電性相反的電極移動的現(xiàn)象。蛋白質(zhì)在帶電場中泳動的速度和方向與其所帶電荷的性質(zhì)、數(shù)量及分子的大小、形狀有關(guān)。帶電荷多，分子小的泳動速度較快；反之則泳動較慢，從而達到分離蛋白質(zhì)的目的。

第51頁/共79頁二、蛋白質(zhì)的膠體性質(zhì)

1.蛋白質(zhì)有膠體性質(zhì)蛋白質(zhì)是生物大分子，分子量在1萬～10萬Da之間，分子直徑在膠體顆粒的范圍（1~100nm），因此，蛋白質(zhì)具有膠體的性質(zhì)。第52頁/共79頁

2.蛋白質(zhì)親水膠體穩(wěn)定的因素蛋白質(zhì)分子表面的水化膜和同種電荷。去掉兩個穩(wěn)定因素，則蛋白質(zhì)從溶液中析出而產(chǎn)生沉淀。

3.蛋白質(zhì)膠體性質(zhì)的應用

透析用于分離純化蛋白質(zhì)

超速離心用于蛋白質(zhì)的分離純化及分子量的測定。第53頁/共79頁第54頁/共79頁變性的概念

在某些物理或化學因素的作用下，蛋白質(zhì)特定的空間構(gòu)象被破壞，從而導致其理化性質(zhì)改變和生物活性喪失，稱為蛋白質(zhì)的變性。變性的實質(zhì)次級鍵斷裂，空間結(jié)構(gòu)破壞

三、蛋白質(zhì)的變性、沉淀和凝固第55頁/共79頁

引起變性的因素

物理因素高溫、高壓、紫外線、電離輻射、超聲波等。

化學因素

強酸、強堿、有機溶劑、尿素、重金屬鹽等。第56頁/共79頁變性蛋白質(zhì)的特點

A.生物學活性喪失B.溶解度降低，易于沉淀

C.粘度增加

D.結(jié)晶能力消失

E.易被蛋白酶水解第57頁/共79頁蛋白質(zhì)變性的應用應用變性的因素進行消毒、滅菌。保存生物制劑則要防止蛋白質(zhì)變性。蛋白質(zhì)的復性大多數(shù)蛋白質(zhì)變性后，空間構(gòu)象嚴重破壞，不能恢復其天然狀態(tài)，稱為不可逆性變性；若蛋白質(zhì)變性程度較輕，去除變性因素，有些可恢復其天然構(gòu)象和生物活性,稱為蛋白質(zhì)的復性。

第58頁/共79頁牛核糖核酸酶的變性與復性第59頁/共79頁蛋白質(zhì)沉淀概念蛋白質(zhì)從溶液中析出的現(xiàn)象稱為沉淀。方法鹽析法、有機溶劑的沉淀、重金屬鹽沉淀、生物堿試劑及某些酸類沉淀。變性的蛋白質(zhì)易于沉淀，但不一定都發(fā)生沉淀。沉淀的蛋白質(zhì)易發(fā)生變性，但并不都變性，如鹽析。第60頁/共79頁四、蛋白質(zhì)的紫外吸收性質(zhì)

蛋白質(zhì)分子中含有共軛雙鍵的苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸殘基，具有紫外吸收能力，在280nm處有最大吸收峰。此特性常用于蛋白質(zhì)含量的測定。第61頁/共79頁五、蛋白質(zhì)的免疫學性質(zhì)蛋白質(zhì)作為大分子，往往具有免疫原性，同時，抗體也是蛋白質(zhì)。抗原（免疫原）：凡能刺激機體免疫系統(tǒng)產(chǎn)生免疫應答，并能與相應抗體或致敏淋巴細胞受體發(fā)生特異性結(jié)合的物質(zhì)?？贵w：機體中因抗原刺激而產(chǎn)生的能與相應抗原特異結(jié)合并具免疫功能的免疫球蛋白。單克隆抗體：由針對某一個特定抗原決定簇而分化、增殖而來的B淋巴細胞群合成并分泌的抗體。第62頁/共79頁六、蛋白質(zhì)的呈色反應1.雙縮脲反應：肽鍵與雙縮脲試劑反應呈紫色；氨基酸無此反應，可用于檢查蛋白質(zhì)的水解程度。堿性溶液中與Cu2+反應，mg級測定2.茚三酮反應:酸性條件下，與茚三酮共熱產(chǎn)生藍紫色3.Folin—酚試劑反應堿性+Cu2++磷鉬酸-磷鎢酸→藍色范圍:25-250μg(Tyr,Trp的反應)第63頁/共79頁1.紫外分光光度法:280nm,0.1-0.5mg/ml(樣品含核酸時)蛋白質(zhì)(mg/ml)=1.55A280-0.75A2602.福林-酚試劑法:堿性+Cu2++磷鉬酸-磷鎢酸→藍色范圍:25-250μg(Tyr,Trp的反應)七、蛋白質(zhì)的含量測定第64頁/共79頁3.Biuret法：蛋白質(zhì)+堿性+Cu2++BCA試劑(4,4‘-二羧酸-2,2’-二喹啉鈉)→紫色(562nm)范圍:10-1200μg/ml4.

Bradford蛋白分析法:考馬斯亮藍G-250+乙醇+酸性→淡紅色+蛋白質(zhì)→藍色(595nm)范圍:10-100μg/ml第65頁/共79頁5.雙縮脲法肽鍵+堿性+Cu2+→紫紅色范圍:0.5-10mg/ml6.凱氏定氮法1g氮相當于樣品含有6.25g蛋白質(zhì)第66頁/共79頁第四節(jié)蛋白質(zhì)的分離純化第67頁/共79頁一、蛋白質(zhì)的提取1.選材：新鮮、富含目的蛋白且來源方便2.組織細胞的粉碎：胞內(nèi)及膜中蛋白物理法：如超聲、勻漿、加砂研磨、高壓擠壓等化學法：如EDTA、SDS等酶法：如自溶法、外加酶法（纖維素酶、果膠酶、溶菌酶等）3.提?。哼m當溶媒、適當條件、適當提取時間和次數(shù)第68頁/共79頁二、蛋白質(zhì)的分離純化（一）根據(jù)溶解度