病毒感染診斷與防治

病毒感染診斷與防治病毒感染診斷與防治第1頁常見病毒學診療方法包含：病毒分離判定病毒血清學檢驗病毒蛋白和核酸檢測第一節(jié)病毒感染診療病毒感染診斷與防治第2頁一、標本采取與送檢應注意以下標準：1.對本身帶有雜菌(如咽拭子、糞便)或易受污染標本，要進行病毒分離培養(yǎng)時，應使用抗生素。2.因病毒在室溫中易失去活性，標本應低溫保留并盡快送檢。3.血清學診療標本采取應在發(fā)病早期和病后2～3w內各取1份血清，方便對比雙份血清抗體效價動態(tài)改變。病毒感染診斷與防治第3頁二、病毒分離與判定(一)病毒分離1.動物接種是最原始病毒培養(yǎng)方法，依據病毒種類不一樣，選擇敏感動物及適宜接種部位，如嗜神經性病毒（狂犬病毒）可接種于小鼠腦內，痘病毒可接種于家兔角膜或皮內。

病毒感染診斷與防治第4頁2.雞胚培養(yǎng)雞胚對各種病毒敏感。普通采取孵化9～14天雞胚，依據病毒種類不一樣，將病毒標本接種于雞胚不一樣部位，最常見雞胚接種部位有：羊膜腔、尿囊腔、絨毛尿囊膜和卵黃囊等。病毒感染診斷與防治第5頁病毒感染診斷與防治第6頁病毒感染診斷與防治第7頁3.組織培養(yǎng)法(tissueculture)或細胞培養(yǎng)(cellculture)法是將離體活組織塊或分散組織細胞加以培養(yǎng)技術總稱，為病毒分離判定中最常見基礎方法。病毒感染診斷與防治第8頁病毒感染診斷與防治第9頁

細胞改變有些病毒在細胞內增殖時可引發(fā)特有細胞病變，稱為細胞病變效應(CPE)。常見改變有細胞變圓、聚集、壞死、溶解或脫落等。有些病毒如麻疹病毒、CMV、RSV等作用于細胞膜，可使鄰近細胞相互融合，形成多核巨細胞或稱融合細胞。有些病毒(如狂犬病病毒、麻疹病毒等)可在培養(yǎng)細胞中形成胞漿或核內包涵體。病毒在培養(yǎng)細胞中增殖指標病毒感染診斷與防治第10頁病毒感染診斷與防治第11頁病毒培養(yǎng)時出現(xiàn)CPE病毒感染診斷與防治第12頁2.紅細胞吸附(hemadsorption,HAd)流感或副流感病毒等感染細胞后，因為細胞膜上出現(xiàn)了血凝素(haemagglutinin,HA)，含有吸附脊椎動物(豚鼠、雞、猴等)紅細胞能力，這一現(xiàn)象稱紅細胞吸附，常見來測定含有HA粘病毒與副粘病毒增殖。若有對應抗血清，則能中和細胞膜上HA，HAd不再發(fā)生，稱紅細胞吸附抑制試驗。病毒感染診斷與防治第13頁3.干擾現(xiàn)象(interference)一些病毒感染細胞時不出現(xiàn)CPE或其它易于測出改變(如HAd)，但能干擾在其后感染另一病毒增殖。如風疹病毒感染Vero細胞時CPE不顯著，但它能干擾后感染?？刹《?ECHOV)增殖，從而阻抑后者所特有CPE。病毒感染診斷與防治第14頁4.細胞代謝改變病毒感染細胞結果可使培養(yǎng)液pH值改變，說明細胞代謝在病毒感染后發(fā)生了改變。這種培養(yǎng)環(huán)境生化改變也可作為判斷病毒增殖指標。病毒感染診斷與防治第15頁(二)病毒數(shù)量與感染性測定

1.蝕斑測定是一個檢驗和準確滴定病毒感染性方法。將稀釋病毒懸液加入單層細胞培養(yǎng)瓶中。病毒吸附后，再覆蓋一層融化半固體營養(yǎng)瓊脂，使病毒在單層細胞培養(yǎng)中有限擴散。結果是每一個有感染性病毒在單層細胞中可產生一個不足感染灶。用活性染料(如中性紅)染色，則活細胞著色，受病毒感染而破壞細胞不著色，形成肉眼可見蝕斑(plaque)。每個蝕斑是由一個感染性病毒顆粒形成，稱作蝕斑形成單位(plaqueformingunit,PFU)。病毒懸液中感染性病毒量滴度可用PFU／ml表示。病毒感染診斷與防治第16頁2.50%組織細胞感染量(TCID50)測定法該方法是測定病毒能使50%組織培養(yǎng)細胞發(fā)生感染最小量。普通是將病毒懸液作10倍系列稀釋，分別接種細胞，經一定時間后觀察CPE、血細胞吸附等指標，以最高稀釋度能感染50%細胞量為終點。最終用統(tǒng)計方法計算出50%組織細胞感染量（50%tissuecultureinfectiousdose,TCID50)。病毒感染診斷與防治第17頁三、病毒感染血清學診療原理是用已知病毒抗原來檢測病人血清中有沒有對應抗體，故須待病人感染后體內產生抗體時才能檢出。另外，在采取臨床標本及病人血清應注意病程，必須采取患者急性期血清與恢復期血清(雙份血清)進行血清學試驗。若第2次血清抗體滴度比第1次高出4倍以上時，才有診療意義。病毒感染診斷與防治第18頁1.中和試驗(neutralizingtest,NTtest)

是病毒在活體內或細胞培養(yǎng)中被特異性抗體中和而失去感染性一個試驗。中和抗體(netralizingantibodies,NTAb)是作用于病毒表面抗原(衣殼或包膜)抗體，同種不一樣型病毒間普通無交叉，特異性高，而且抗體在體內維持時間長。中和抗體陽性不一定表示正在感染中，也可能因以前有過隱性感染所致。所以，中和試驗適合用于人群免疫情況調查，在臨床診療上較少使用。病毒感染診斷與防治第19頁2.補體結合試驗

(complementfixationtest,CFtest)用已知病毒可溶性(CF)抗原來檢測病人血清中對應(CF)抗體。CF抗原是病毒內部抗原，同種異型間常有交叉，故特異性較中和試驗低。但CF抗體出現(xiàn)較早，消失較快，故CF陽性可作為近期感染指標。病毒感染診斷與防治第20頁3.血凝抑制試驗(hemagglutinatiainhibitiontest,HItest)

含有HA病毒能凝集雞、豚鼠、人等紅細胞，稱血凝現(xiàn)象。這種現(xiàn)象能被對應抗體抑制，稱HI試驗。其原理是對應抗體與病毒結合后，阻抑了病毒表面HA與紅細胞結合。本試驗簡易、經濟，特異性高，常見于粘病毒及乙型腦炎病毒感染輔助診療及流行病學調查，也可判定病毒型與亞型。病毒感染診斷與防治第21頁病毒+雞RBC=凝集（血凝試驗）病毒+特異性抗體+雞RBC=不凝集（血凝抑制試驗）病毒感染診斷與防治第22頁四、病毒感染快速診療

快速診療主要是指從含有病毒標本及感染機體血清中檢測病毒顆粒、蛋白抗原、IgM抗體和核酸等，往往在數(shù)小時內即可得出結果。病毒感染診斷與防治第23頁(一)形態(tài)學檢驗1.電鏡和免疫電鏡檢驗2.普通光學顯微鏡檢驗有些病毒在宿主細胞內增殖后，在細胞一定部位(胞核、胞漿或二者兼有)出現(xiàn)一個或數(shù)個、圓形或橢圓形、嗜酸性或嗜堿性結構，即包涵體。包涵體對病毒感染診療有一定價值。病毒感染診斷與防治第24頁(二)病毒蛋白抗原檢驗

用熒光素、放射性同位素、過氧化物酶等標識抗體，采取免疫學和分子生物學技術，檢測標本中病毒蛋白抗原，含有敏感、特異、快速等優(yōu)點。1.免疫熒光技術(immunofluorescence,IF)2.固相放射免疫測定(solid-phaseradioimmunoassay,SPRIA)3.酶免疫技術(enzymeimmunoassay,EIA)此法可檢測各種病毒及其抗體，主要是酶免疫組化法和酶聯(lián)免疫吸附試驗法(ELISA)。病毒感染診斷與防治第25頁(三)特異性IgM抗體檢測

檢測病毒特異性IgM抗體可診療急性感染，尤其是對證實孕婦感染風疹病毒尤為主要，但應注意類風濕因子(IgM)干擾。另外，檢測早期抗原抗體是快速診療另一路徑。如檢測針對EBV早期抗原(EA)、關鍵抗原(EANA)和衣殼抗原(VCA)等抗體，能夠區(qū)分急性或慢性EBV感染。另外，分子生物學檢測技術、氣相色譜技術等，均可用來分析和判定病毒感染。病毒感染診斷與防治第26頁(四)檢測病毒核酸

1.核酸雜交技術用于病毒檢測有斑點雜交、細胞內原位雜交、DNA印跡雜交、RNA印跡雜交等。2.核酸擴增法當前多數(shù)病毒基因已經過分子克隆技術被明確了核苷酸序列，使得DNA擴增技術逐步發(fā)展為常規(guī)診療技術之一。3.基因芯片技術病毒感染診斷與防治第27頁基因芯片又稱DNA芯片、生物芯片（biochip）。其原理是：將已知生物分子探針或基因探針，大規(guī)模或有序排布于小塊硅片等載體上，與待測樣品中生物分子或基因序列相互作用和并行反應，在激光激發(fā)下，產生熒光譜信號被接收器搜集，計算機自動分析處理數(shù)據并匯報結果。其優(yōu)點是：能夠一次性完成大量樣品DNA序列檢測和分析，處理了傳統(tǒng)核酸雜交技術許多不足。芯片技術在病毒等微生物學診療和流行病學調查方面有著遼闊應用前景。病毒感染診斷與防治第28頁第二節(jié)病毒感染預防一、人工自動免疫(一)活疫苗(attenuatedvaccine,orlivingvaccine)1.常規(guī)活疫苗即減毒活疫苗(attenuatedvaccine)，通常是用自然或人工選擇法(如溫度敏感株)篩選對人低毒或無毒變異株制成疫苗，如脊髓灰質炎、流感、麻疹減毒活疫苗等。病毒感染診斷與防治第29頁2.新型活疫苗應用基因工程技術，控制病毒變異，或利用DNA重組技術，插入和定向缺失病毒基因，將保護性病毒蛋白編碼基因插入活載體中或選擇性地去除病毒某一個或幾個致病基因而到達減毒作用制備可在機體內增殖，誘發(fā)抗病毒免疫應答疫苗。病毒感染診斷與防治第30頁(二)死疫苗(killedvaccine)1.滅活全病毒疫苗應用物理或化學方法使病毒完全滅活而制成疫苗。常見有乙型腦炎、狂犬病、流感等滅活疫苗。2.亞單位疫苗(subunitvaccine)制備不含有病毒核酸、僅含有能誘發(fā)中和抗體病毒衣殼蛋白或包膜表面抗原，是最理想疫苗。3.合成肽病毒疫苗(synthesizedpeptideviralvaccine)人工合成與病毒保護性抗原決定簇氨基酸序列相同肽段，制備成免疫原后免疫動物或人體，使機體產生保護性抗體病毒感染診斷與防治第31頁4.基因工程疫苗(geneengineringvaccine)利用基因工程技術，分離、重組、轉化和表示基因，制備出能引發(fā)人體保護性免疫應答疫苗。5.DNA疫苗又稱基因疫苗或核酸疫苗，這種核酸分子是一個細菌質粒，在克隆了特異性基因以后，能在真核細胞中表示蛋白質抗原，刺激機體產生特異性體液和細胞免疫。6.新型多價聯(lián)合疫苗、口服疫苗研究病毒感染診斷與防治第32頁減毒活疫苗與死疫苗優(yōu)缺點比較特點減毒活疫苗死疫苗制備方法經過非正常培養(yǎng)減毒株經過化學物理方法使感染失活免疫接種普通為一次性屢次免疫疫苗穩(wěn)定性相對不穩(wěn)定相對穩(wěn)定免疫類型體液免疫和細胞免疫體液免疫毒力回升有可能不可能安全性對免疫缺點者有危險安全性好生產和成本生產較復雜、成本高生產簡單、成本低病毒感染診斷與防治第33頁二、人工被動免疫人工被動免疫制劑有免疫血清和丙種球蛋白，或與細胞免疫相關因子等。大多數(shù)人均受過不一樣種類病毒感染，從正常血清中提取免疫球蛋白可用于緊急預防。常注射人免疫球蛋白預防甲型肝炎、麻疹、脊髓灰質炎等。可使接觸病原者不出現(xiàn)癥狀或僅出現(xiàn)輕微癥狀。多年來有些人應用含有高滴度抗HBs乙肝免疫球蛋白Ig)預防乙型肝炎有一定效果。在使用免疫球蛋白時因其半衰期短，故應注意使用期。病毒感染診斷與防治第34頁第三節(jié)病毒感染治療一、抗病化學制劑（一）核苷類藥品核苷類藥品作用機制有主要是抑制病毒基因復制①模擬核苷成份摻入病毒基因組：合成異常嘧啶取代病毒DNA前體胸腺嘧啶，病毒在復制過程中，這種異常嘧啶分子摻入子代DNA中使子代病毒結構基因合成和表示無法進行，從而抑制病毒復制，或復制出病毒為缺點病毒。②競爭病毒復制酶病毒感染診斷與防治第35頁1.無環(huán)鳥苷(acyclovir,ACV，阿昔洛韋)和丙氧鳥苷（ganciclovirGCV，庚昔洛韋）為鳥嘌呤或脫氧鳥嘌呤核苷類似物。該藥細胞毒性很小，是當前最有效抗皰疹病毒藥品之一。廣泛用于皰疹病毒感染引發(fā)單純皰疹、生殖器皰疹及帶狀皰疹。病毒感染診斷與防治第36頁2.疊氮胸苷(azidothymidine,AZT)胸腺嘧啶核苷類似物，經過阻斷前病毒DNA合成而抑制HIV復制，AZT對病毒逆轉錄酶抑制比對細胞DNA多聚酶敏感100倍以上。能夠有效地降低AIDS發(fā)病率與病死率。耐藥株出現(xiàn)系由基因突變造成逆轉錄酶含有耐藥性。因有抑制骨髓作用和形成病毒耐藥而面臨被淘汰。病毒感染診斷與防治第37頁3.病毒唑對各種RNA和DNA病毒復制都有抑制作用，但主要用于RNA病毒感染治療，對細胞核酸也有抑制作用。當前臨床主要用于流感病毒和呼吸道合胞病毒治療。病毒感染診斷與防治第38頁（二）病毒基因轉錄抑制劑這類核苷衍生物模擬天然二脫氧核苷底物，經一系列磷酸化成為5’-三磷酸后，作為相同底物競爭性抑制病毒逆轉錄酶活性。被磷酸化藥品分子與核苷酸分子相同，在RNA模板合成DNA過程中被嵌入DNA中。此DNA再轉錄時，因為其中藥品分子不是正常核苷酸，因而轉錄酶不能識別，從而使轉錄受阻。病毒感染診斷與防治第39頁（三）非核苷類逆轉錄酶抑制劑①nevirapine第1個新合成非核苷類逆轉錄酶抑制劑。1996年獲準用于治療HIV，耐藥株已出現(xiàn)，故提議與其它藥聯(lián)合使用；②pyridone作用類似nevirapine.病毒感染診斷與防治第40頁（四）蛋白酶抑制劑1．賽科納瓦(saquinavir)1995年同意第1個蛋白酶抑制劑。2．英迪納瓦（indinavir）、瑞托納瓦（ritonavir）是1996年同意新一代蛋白酶抑制劑，用于HIV。病毒感染診斷與防治第41頁（五）其它抗病毒藥品1.金剛烷胺和甲基金剛烷胺金剛烷胺為合成胺類，甲基金剛烷胺是其衍生物，二者有相同抗病毒譜和副作用，能阻止脫殼，主要用于治療甲型流感。2.甲酸磷霉素無機焦磷酸鹽有機類似物，抑制各種皰疹病毒，包含CMV、HSV、VZV、EBV、HHV6，可能還對HBV和逆轉錄病毒有作用。選擇性抑制病毒DNA多聚酶和逆轉錄酶，而對宿主細胞無影響。病毒感染診斷與防治第42頁二、干擾素和干擾素誘生劑應用1.干擾素(IFN)含有廣譜抗病毒作用，毒性小，使用同種IFN無抗原性，主要用于甲、乙、丙型肝炎，HSV，乳頭瘤病毒和鼻病毒等感染