動物細(xì)胞的融合與單克隆抗體

2002年１２月３０日，

兩場籌備了10年的“太空婚禮”首次在神舟四號飛船上舉行，植物細(xì)胞“新人”—黃花煙草和革新一號煙草葉肉細(xì)胞原生質(zhì)體，動物細(xì)胞“新人”是小鼠B淋巴細(xì)胞和骨髓瘤細(xì)胞，兩批新人同時在“產(chǎn)房”—電融合儀內(nèi)孕育新生命。一段時間后，我國首批”太空娃娃”終于順利誕生。對照實驗結(jié)果表明，細(xì)胞融合率大大提高。STS“太空婚禮”目前一頁\總數(shù)七十三頁\編于四點神舟放飛強國夢目前二頁\總數(shù)七十三頁\編于四點“太空婚禮”科研項目一：“太空婚禮”科研項目二：

挑戰(zhàn)自我植物體細(xì)胞雜交技術(shù)動物細(xì)胞融合技術(shù)目前三頁\總數(shù)七十三頁\編于四點溫故而知新：哪種植物細(xì)胞工程技術(shù)可以突破不同生物之間的生殖隔離，克服遠(yuǎn)緣雜交不親和的障礙，培育出新的作物類型？

植物體細(xì)胞雜交技術(shù)你能回憶出植物體細(xì)胞雜交的過程嗎？目前四頁\總數(shù)七十三頁\編于四點植物細(xì)胞A植物細(xì)胞B去掉細(xì)胞壁去掉細(xì)胞壁原生質(zhì)體A原生質(zhì)體B原生質(zhì)體融合雜合的原生質(zhì)體再生出細(xì)胞壁雜種細(xì)胞脫分化再分化愈傷組織雜種植株溫故知新:植物體細(xì)胞雜交過程目前五頁\總數(shù)七十三頁\編于四點植物細(xì)胞A植物細(xì)胞B去掉細(xì)胞壁去掉細(xì)胞壁原生質(zhì)體A原生質(zhì)體B原生質(zhì)體融合雜合的原生質(zhì)體再生出細(xì)胞壁雜種細(xì)胞細(xì)胞分裂分化發(fā)育愈傷組織雜種植株思考：1、動物細(xì)胞融合的概念是什么？2、動植物細(xì)胞在結(jié)構(gòu)上有何區(qū)別？這對它們雜交或融合過程有什么影響？3、植物體細(xì)胞雜交誘導(dǎo)原生質(zhì)體融合常用的方法有哪些？那動物細(xì)胞融合呢？4、動物細(xì)胞融合與植物原生質(zhì)體融合的基本原理是否相同？是什么原理？5、動物細(xì)胞融合有什么意義？主要應(yīng)用在哪些方面？一、動物細(xì)胞融合目前六頁\總數(shù)七十三頁\編于四點動物細(xì)胞A動物細(xì)胞B誘導(dǎo)、融合雜合的細(xì)胞有絲分裂2個完整的雜交細(xì)胞AB討論：6、植物體細(xì)胞雜交可得到雜種植株，動物細(xì)胞融合后能象電影上一樣形成雜種動物個體嗎?為什么？植物細(xì)胞A植物細(xì)胞B去掉細(xì)胞壁去掉細(xì)胞壁原生質(zhì)體A原生質(zhì)體B原生質(zhì)體融合雜合的原生質(zhì)體再生出細(xì)胞壁雜種細(xì)胞細(xì)胞分裂分化發(fā)育愈傷組織雜種植株目前七頁\總數(shù)七十三頁\編于四點1970年，有兩位科學(xué)家做了一個著名的實驗：人—鼠細(xì)胞融合的實驗，以證明細(xì)胞膜上的蛋白質(zhì)分子是運動的。人—鼠細(xì)胞是怎樣實現(xiàn)融合的？動物細(xì)胞融合有什么實踐意義呢？目前八頁\總數(shù)七十三頁\編于四點一、動物細(xì)胞融合1.細(xì)胞融合：是指兩個或兩個以上的細(xì)胞融合為一個細(xì)胞的過程。⑴自然發(fā)生：

受精卵⑵人工誘導(dǎo)：

利用誘導(dǎo)劑誘導(dǎo)動物細(xì)胞融合

誘導(dǎo)因素：聚乙二醇、滅活的病毒或電激等。

目前九頁\總數(shù)七十三頁\編于四點鼠細(xì)胞人細(xì)胞人工誘導(dǎo)動物細(xì)胞融合雜交細(xì)胞目前十頁\總數(shù)七十三頁\編于四點仙臺病毒紫外線滅活喪失感染活性（不感染細(xì)胞）保留融合活性（誘導(dǎo)細(xì)胞融合）①什么是病毒的滅活？滅活是指用物理或化學(xué)手段使病毒失去感染能力，但是并不破壞病毒的抗原結(jié)構(gòu)。②滅活病毒誘導(dǎo)細(xì)胞融合的原理病毒表面含有的糖蛋白和一些酶能夠與細(xì)胞膜上的糖蛋白發(fā)生作用，使細(xì)胞互相凝聚，細(xì)胞膜上的蛋白質(zhì)分子和脂質(zhì)分子重新排布，細(xì)胞膜打開，細(xì)胞發(fā)生融合。目前十一頁\總數(shù)七十三頁\編于四點因為滅活的病毒能使細(xì)胞膜上的蛋白質(zhì)分子和脂質(zhì)分子重新排布，細(xì)胞膜打開，細(xì)胞發(fā)生融合目前十二頁\總數(shù)七十三頁\編于四點滅活的病毒顆粒黏附于細(xì)胞表面細(xì)胞膜被病毒顆粒穿通細(xì)胞膜連接細(xì)胞融合，形成雜交細(xì)胞（細(xì)胞膜具有一定的流動性）目前十三頁\總數(shù)七十三頁\編于四點正在融合的淋巴細(xì)胞與骨髓瘤細(xì)胞正在融合的雞血細(xì)胞⑶動物細(xì)胞融合的原理：細(xì)胞膜的流動性目前十四頁\總數(shù)七十三頁\編于四點

把兩個不同的動物細(xì)胞放在一起，用滅活的病毒處理細(xì)胞，它們先發(fā)生質(zhì)融合，再出現(xiàn)核融合，進(jìn)而形成雜交細(xì)胞。融合后的雜交細(xì)胞經(jīng)過有絲分裂后仍能形成兩個完整的雜交細(xì)胞目前十五頁\總數(shù)七十三頁\編于四點細(xì)胞膜的流動性滅活病毒、PEG、電激等融合后的細(xì)胞進(jìn)行有絲分裂，形成完整的雜交細(xì)胞誘導(dǎo)的手段？融合后細(xì)胞的類型？AB雜種細(xì)胞遺傳物質(zhì)有什么特點？三種AA、AB、BB（A、B）含兩種生物的遺傳物質(zhì)動物細(xì)胞融合過程原理？目前十六頁\總數(shù)七十三頁\編于四點物理法的融合效率較高,且對細(xì)胞（原生質(zhì)體）的傷害小,易操作、控制和觀察。太空中處于失重狀態(tài)，不同種細(xì)胞（原生質(zhì)體）更容易親近；為什么在太空中細(xì)胞（原生質(zhì)體）融合率會大大上升？為什么選用物理法誘導(dǎo)？目前十七頁\總數(shù)七十三頁\編于四點2、動物細(xì)胞融合的應(yīng)用1.突破有性雜交方法的局限,使遠(yuǎn)緣雜交成為可能。2.成為研究細(xì)胞遺傳、細(xì)胞免疫、腫瘤和生物新品種培育等的重要手段。鼠—雞、鼠—兔、鼠—猴、人—鼠、人—兔、人—雞、人—蛙、酵母菌—雞、人—胡蘿卜等3、重要用途：制備單克隆抗體。目前十八頁\總數(shù)七十三頁\編于四點獲得雜種植株物理、化學(xué)方法（同左）滅活的病毒

物理（離心、振蕩、電激）化學(xué)（聚乙二醇）直接誘導(dǎo)細(xì)胞融合去壁—原生質(zhì)體融合—誘導(dǎo)新壁—雜種植株細(xì)胞膜的流動性細(xì)胞膜的流動性結(jié)果誘導(dǎo)方法步驟融合的原理動物細(xì)胞融合植物體細(xì)胞雜交比較項目植物、動物細(xì)胞融合的比較獲得雜交細(xì)胞小結(jié)1目前十九頁\總數(shù)七十三頁\編于四點【例1】能使動物細(xì)胞融合的特有的誘導(dǎo)因子是（）A.離心B.滅活的病毒C.電刺激D.振動【例2】融合后的雜交細(xì)胞的遺傳物質(zhì)有何特點（）具有原來兩個或多個細(xì)胞的遺傳信息B.能無限增殖C.可形成新個體D.培養(yǎng)過程會貼壁【例3】動物細(xì)胞融合的作用中最重要的是（）A.克服遠(yuǎn)源雜交不親和B.制備單克隆抗體C.培育新物種D.生產(chǎn)雜種細(xì)胞

BB初試牛刀A目前二十頁\總數(shù)七十三頁\編于四點使用相應(yīng)的抗體檢測乙肝病毒——抗原二、單克隆抗體的制備

醫(yī)院一般怎樣檢測人體內(nèi)是否存在乙肝病毒？乙肝病毒模式圖

凡能夠引起機體產(chǎn)生特異性免疫應(yīng)答的物質(zhì)叫做抗原。1、什么是抗原？例如花粉、病菌、病毒等。有時自身的組織或細(xì)胞也會成為抗原，如癌細(xì)胞等。目前二十一頁\總數(shù)七十三頁\編于四點抗原決定簇：抗原表面具有的某些特定的化學(xué)基團(tuán)，能決定抗原特異性，是免疫細(xì)胞識別抗原的重要依據(jù)。各種抗原的決定簇數(shù)目不同，同一抗原的決定簇可能有多種。目前二十二頁\總數(shù)七十三頁\編于四點

2、什么是抗體？由何種細(xì)胞產(chǎn)生？主要分布在哪里?起何作用？

當(dāng)機體受到抗原刺激劑后由效應(yīng)B細(xì)胞（漿細(xì)胞）產(chǎn)生的，并且能與該抗原發(fā)生特異性結(jié)合的具有免疫功能的球蛋白——抗體。

抗體分布于血清中，也分布于組織液及外分泌液中。目前二十三頁\總數(shù)七十三頁\編于四點抗體與相應(yīng)抗原特異性結(jié)合目前二十四頁\總數(shù)七十三頁\編于四點

抗體由何種細(xì)胞產(chǎn)生？主要分布在哪里?目前二十五頁\總數(shù)七十三頁\編于四點3、抗體的傳統(tǒng)生產(chǎn)方法：從血清中分離抗體多種漿細(xì)胞動物體內(nèi)多種抗體抗原目前二十六頁\總數(shù)七十三頁\編于四點目前二十七頁\總數(shù)七十三頁\編于四點血清抗體（也稱多克隆抗體）由血清中提取的抗體是由不同淋巴細(xì)胞產(chǎn)生的多種抗體的混合物，可達(dá)百萬種以上，稱為多克隆抗體。特點：產(chǎn)量低、純度低、特異性差、反應(yīng)不夠靈敏?？乖患兛贵w不純

抗原動物體內(nèi)刺激效應(yīng)B抗體目前二十八頁\總數(shù)七十三頁\編于四點

每一個B淋巴細(xì)胞只分泌一種化學(xué)性質(zhì)單一，特異性強的抗體。如果利用單個B淋巴細(xì)胞進(jìn)行無性繁殖（克?。?，形成細(xì)胞群，這樣的細(xì)胞群就有可能產(chǎn)生出化學(xué)性質(zhì)單一、特異性強的抗體——單克隆抗體。問題：怎樣獲得化學(xué)性質(zhì)單一、特異性強的抗體呢？目前二十九頁\總數(shù)七十三頁\編于四點在體外培養(yǎng)的條件下，一個B淋巴細(xì)胞能無限增殖形成細(xì)胞群嗎？什么樣的細(xì)胞能夠在體外無限增殖呢？

——腫瘤細(xì)胞！目前三十頁\總數(shù)七十三頁\編于四點

抗體

抗原應(yīng)答抗體的不純性

動物細(xì)胞受到抗原刺激,引起免疫反應(yīng)產(chǎn)生的球蛋白.不是自己的而又能引起免疫應(yīng)答反應(yīng)的物質(zhì)就是抗原.一種抗原有多種不同的決定簇,刺激的是多種B細(xì)胞,作用于不同的B細(xì)胞后,會產(chǎn)生多種抗體,這是多克隆的,故不純!

4.制備單克隆抗體的思路抗原

B細(xì)胞漿細(xì)胞抗體

刺激目前三十一頁\總數(shù)七十三頁\編于四點怎么才能得到純的抗體?光純還不行,還要大量.怎么辦?但，有問題:找，什么細(xì)胞能無限繁殖呢?思路就出來了:要想獲單一的純抗體,就必須從一個B細(xì)胞出發(fā).讓B細(xì)胞大量繁殖(克隆)就可以產(chǎn)生大量抗體了.B細(xì)胞是不能無限繁殖的.怎么辦?癌!只有癌細(xì)胞.但它不能產(chǎn)生抗體.癌細(xì)胞能無限繁殖,但不能產(chǎn)生抗體.B細(xì)胞能產(chǎn)生抗體,但不能大量繁殖.融合呀!只要將兩個細(xì)胞融合即可互補.目前三十二頁\總數(shù)七十三頁\編于四點

5.技術(shù)思路的重點雜交瘤細(xì)胞

HAT篩選McAb大量培養(yǎng)PEG誘導(dǎo)細(xì)胞融合免疫B

脾礦物油骨髓瘤瘤問題:在培養(yǎng)體系中,有5種細(xì)胞.B細(xì)胞、瘤細(xì)胞,和雜交細(xì)胞。我們還是拿不到McAb,怎么辦?篩選！篩出雜交瘤細(xì)胞。怎么篩?

又是一個思路問題。關(guān)鍵一步目前三十三頁\總數(shù)七十三頁\編于四點目前三十四頁\總數(shù)七十三頁\編于四點⑵如何誘導(dǎo)融合？

加入聚乙二醇（PEG）⑴如何得到B淋巴細(xì)胞？6.制備單克隆抗體的過程目前三十五頁\總數(shù)七十三頁\編于四點⑶細(xì)胞兩兩融合后，有哪些類型？B-BB-瘤(雜交瘤細(xì)胞)瘤-瘤⑷如何篩選出雜交瘤細(xì)胞？

單克隆抗體制備過程中，總共有兩次篩選，第一次篩選出雜交瘤細(xì)胞，第二次篩選出能產(chǎn)生特異性抗體的雜交瘤細(xì)胞，兩次篩選的原理和方法是不相同的。

①首先用選擇培養(yǎng)基篩選出雜交瘤細(xì)胞目前三十六頁\總數(shù)七十三頁\編于四點①細(xì)胞合成DNA有D和S兩條途徑，其中D途徑能被氨基嘌呤阻斷。②人淋巴細(xì)胞中有這兩種DNA的合成途徑，但一般不分裂增殖。

③鼠骨髓瘤細(xì)胞中只有D途徑，沒有S途徑，可是能不斷分裂增殖。你想到篩選雜交瘤細(xì)胞的方案了么？

小資料：目前三十七頁\總數(shù)七十三頁\編于四點在培養(yǎng)液中加入氨基蝶呤，收集增殖細(xì)胞！加入氨基嘌呤后，使D合成途徑阻斷，僅有D合成途徑的骨髓瘤細(xì)胞及其彼此融合的細(xì)胞就不能增殖，但人淋巴細(xì)胞和骨髓瘤細(xì)胞融合后的雜種細(xì)胞因為可以利用淋巴細(xì)胞中的S途徑合成DNA而增殖。目前三十八頁\總數(shù)七十三頁\編于四點例：已知細(xì)胞增殖時合成DNA有D和S兩條途徑，其中D途徑能被氨基喋呤阻斷。人淋巴細(xì)胞中有這兩種DNA的合成途徑，但一般不分裂增殖。鼠骨髓瘤細(xì)胞中盡管沒有S途徑，但能不斷分裂增殖，將兩種細(xì)胞在培養(yǎng)液中混合，加聚乙二醇促融，在培養(yǎng)液中有種細(xì)胞。加入氨基喋呤后，使D合成途徑阻斷，僅有D合成途徑的及其彼此融合的細(xì)胞不能增殖。人淋巴細(xì)胞和骨髓瘤細(xì)胞融合后的雜交細(xì)胞中可利用淋巴細(xì)胞中的S途徑合成DNA而增殖。從培養(yǎng)液中分離出雜交細(xì)胞。如何篩選出培養(yǎng)液中的雜交瘤細(xì)胞？5骨髓瘤細(xì)胞目前三十九頁\總數(shù)七十三頁\編于四點目前四十頁\總數(shù)七十三頁\編于四點通常采用有限稀釋克隆細(xì)胞的方法，將雜交瘤細(xì)胞多倍稀釋，接種在多孔細(xì)胞培養(yǎng)板上培養(yǎng)，使每孔細(xì)胞不超過一個，再由這些單細(xì)胞克隆生長，然后檢測各孔上清液中細(xì)胞分泌的抗體，那些上清液可與特定抗原結(jié)合的培養(yǎng)孔為陽性孔。最終選出分泌預(yù)定特異抗體的雜交細(xì)胞株進(jìn)行擴大培養(yǎng)。②再篩選出能分泌所需抗體的雜交瘤細(xì)胞目前四十一頁\總數(shù)七十三頁\編于四點陽性孔方法——抗原-抗體雜交法

在單克隆抗體制備過程中，兩次篩選的原理和方法是不相同的。目前四十二頁\總數(shù)七十三頁\編于四點⑻如何得到大量的單克隆抗體？

體內(nèi)培養(yǎng)體外培養(yǎng)單克隆抗體——化學(xué)性質(zhì)單一、特異性強目前四十三頁\總數(shù)七十三頁\編于四點注射抗原效應(yīng)B細(xì)胞骨髓瘤細(xì)胞融合多種雜交細(xì)胞選擇性培養(yǎng)基

篩選1抗原-抗體雜交法克隆化單克隆抗體

篩選24.第一次篩選出的雜交瘤細(xì)胞為何需進(jìn)行克隆化培養(yǎng)和專一抗體檢測？目前四十四頁\總數(shù)七十三頁\編于四點目前四十五頁\總數(shù)七十三頁\編于四點單克隆抗體篩選雜交細(xì)胞雜交瘤細(xì)胞體外或體內(nèi)細(xì)胞培養(yǎng)篩選骨髓瘤細(xì)胞誘導(dǎo)細(xì)胞融合特異性雜交瘤細(xì)胞雜交瘤細(xì)胞系提取經(jīng)過免疫的B淋巴細(xì)胞動物細(xì)胞融合技術(shù)動物細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)單克隆抗體的制備過程：特點：既能產(chǎn)生專一抗體又能大量繁殖特點：特異性強靈敏度高可大量制備注射抗原免疫目前四十六頁\總數(shù)七十三頁\編于四點7、單抗隆抗體的應(yīng)用①作為診斷試劑②定位診斷腫瘤、心血管畸形等疾病

用于體外診斷人類和動植物疾病及病原鑒定，純度高、特異性強，具有準(zhǔn)確、高效、簡易、快速的優(yōu)點。③用于治療疾病和運載藥物

利用同位素標(biāo)記單抗，在特定組織成像

制成生物導(dǎo)彈，將藥物定向帶到癌細(xì)胞所在的位置，在原位殺死癌細(xì)胞，療效高、副作用小。單克隆抗體的優(yōu)點：特異性強，靈敏度高，并可以大量制備。目前四十七頁\總數(shù)七十三頁\編于四點目前四十八頁\總數(shù)七十三頁\編于四點

目前四十九頁\總數(shù)七十三頁\編于四點⑵用于治療疾病和運載藥物①特異性強、靈敏度高

生物導(dǎo)彈——單克隆抗體＋抗癌藥物

②療效高、毒副作用小結(jié)合同位素的單抗-----生物導(dǎo)彈目前五十頁\總數(shù)七十三頁\編于四點結(jié)合同位素的單抗-----生物導(dǎo)彈單抗放射性同位素目前五十一頁\總數(shù)七十三頁\編于四點項目動物細(xì)胞融合植物體細(xì)胞雜交原理細(xì)胞膜的流動性細(xì)胞膜的流動性和植物細(xì)胞的全能性融合前提分散成單個細(xì)胞去除細(xì)胞壁誘導(dǎo)方法聚乙二醇、離心、振動、電激、滅活病毒聚乙二醇、離心、振動、電激、結(jié)果獲得雜種細(xì)胞或細(xì)胞產(chǎn)物獲得雜種植株用途制備單克隆抗體培育作物新品種意義使遠(yuǎn)緣雜交成為可能克服遠(yuǎn)緣雜交障礙目前五十二頁\總數(shù)七十三頁\編于四點對比比較項目植物體細(xì)胞雜交單克隆抗體的制備原理融合前處理促融方法

用途過程第一步第二步第三步第四步細(xì)胞膜的流動性、細(xì)胞的全能性細(xì)胞膜的流動性、細(xì)胞增殖酶解法去壁小鼠要免疫處理物理法化學(xué)法物理、化學(xué)、生物法原生質(zhì)體的制備融合親本細(xì)胞的準(zhǔn)備原生質(zhì)體的融合與篩選動物細(xì)胞融合與兩次篩選雜種細(xì)胞的形成與培養(yǎng)對產(chǎn)生特定抗體的雜交瘤細(xì)胞培養(yǎng)雜種植株的鑒定單克隆抗體的分離提純單抗有助于疾病的診斷、治療

獲得具優(yōu)良性狀的雜種植株目前五十三頁\總數(shù)七十三頁\編于四點動物細(xì)胞工程小結(jié)動物細(xì)胞培養(yǎng)：原理、營養(yǎng)、條件、過程、細(xì)胞生長特點、結(jié)果、應(yīng)用動物細(xì)胞融合：原理、誘導(dǎo)方法、過程、應(yīng)用單克隆抗體的制備：原理、過程、特點、應(yīng)用核移植與克隆動物：供體、受體、核移植方法、克隆動物的方法、克隆動物的遺傳特性、應(yīng)用動、植物細(xì)胞工程的比較：植物組培技術(shù)與動物細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)、植物體細(xì)胞雜交技術(shù)與動物細(xì)胞融合技術(shù)目前五十四頁\總數(shù)七十三頁\編于四點⑶圖中B為________過程，常用_________作為誘導(dǎo)劑，該細(xì)胞繼承___________的遺傳特性，既能__________,又能___________

。B體外培養(yǎng)骨髓瘤細(xì)胞雜交瘤細(xì)胞足夠數(shù)量的細(xì)胞群注射到小鼠腹腔AC

1.下圖為某同學(xué)根據(jù)雜交瘤技術(shù)的方法，設(shè)計的生產(chǎn)破傷風(fēng)桿菌的抗體實驗方案⑴該實驗方案的目是

；⑵A是從小鼠的脾臟中取得_______,該細(xì)胞能夠產(chǎn)生

；制備單克隆抗體B細(xì)胞專一抗體細(xì)胞融合滅活病毒雙親細(xì)胞分泌專一抗體無限增殖目前五十五頁\總數(shù)七十三頁\編于四點單克隆抗體的制備1、怎樣獲得能分泌專一抗體的B淋巴細(xì)胞？2、從何處獲得較多的B淋巴細(xì)胞？3、用什么方法可以使B淋巴細(xì)胞與骨髓瘤細(xì)胞融合？4、怎樣篩選出雜交瘤細(xì)胞？5、篩選出的雜交瘤細(xì)胞產(chǎn)生的抗體都一樣嗎？6、怎樣獲得只產(chǎn)生特異性抗體的雜交瘤細(xì)胞？7、怎樣獲得大量的單一抗體？反復(fù)注射特定的抗原，免疫小鼠。小鼠的脾臟PEG、滅活的病毒等利用HAT選擇培養(yǎng)基培養(yǎng)，篩選否用多孔細(xì)胞培養(yǎng)板培養(yǎng)，稀釋度要保證每個孔內(nèi)不多于一個細(xì)胞?？乖贵w雜交法檢測——呈陽性反應(yīng)體內(nèi)或體外大量培養(yǎng)特異的雜交瘤細(xì)胞，從中提取單一抗體。目前五十六頁\總數(shù)七十三頁\編于四點單克隆抗體篩選雜交細(xì)胞雜交瘤細(xì)胞體外或體內(nèi)細(xì)胞培養(yǎng)篩選骨髓瘤細(xì)胞誘導(dǎo)細(xì)胞融合特異性雜交瘤細(xì)胞雜交瘤細(xì)胞系提取經(jīng)過免疫的B淋巴細(xì)胞動物細(xì)胞融合技術(shù)動物細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)單克隆抗體的制備過程：特點：既能產(chǎn)生專一抗體又能大量繁殖特點：特異性強靈敏度高可大量制備注射抗原免疫目前五十七頁\總數(shù)七十三頁\編于四點單克隆抗體B淋巴細(xì)胞骨髓瘤細(xì)胞誘導(dǎo)融合選擇培養(yǎng)雜交瘤細(xì)胞克隆化培養(yǎng)抗體檢測產(chǎn)生所需抗體的雜交瘤細(xì)胞體外培養(yǎng)小鼠腹腔內(nèi)增殖單克隆抗體多種雜交細(xì)胞1、該過程中用到了兩種技術(shù)小結(jié)2單克隆抗體的制備過程：動物細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)動物細(xì)胞融合技術(shù)2、單克隆抗體的制備過程的三個“一”：一種誘導(dǎo)細(xì)胞融合的新方法，產(chǎn)生了一種新細(xì)胞，得到了一種優(yōu)勢抗體。滅活病毒誘導(dǎo)融合雜交瘤細(xì)胞單克隆抗體優(yōu)勢：特異性強、靈敏度高，可大量制備目前五十八頁\總數(shù)七十三頁\編于四點兩個過程動物細(xì)胞培養(yǎng)過程單克隆抗體制備過程三個“一”一個誘導(dǎo)細(xì)胞融合的新方法－－滅活病毒一個新細(xì)胞－－雜交瘤細(xì)胞一個優(yōu)勢－－單克隆抗體特異性強、靈敏度高的優(yōu)勢本節(jié)小結(jié)重點目前五十九頁\總數(shù)七十三頁\編于四點1975年Kohler和Milstein的單克隆抗體技術(shù)在生產(chǎn)和使用抗體方面開創(chuàng)了新紀(jì)元，圖10示單克隆抗體制備流程階段示意圖。請據(jù)圖回答下列問題：圖10（1）該技術(shù)是在動物細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)和

技術(shù)的基礎(chǔ)上發(fā)展起來的。（2）圖10中細(xì)胞A體外培養(yǎng)不具有分裂能力，但能分泌

，細(xì)胞B體外培養(yǎng)能夠

。（3）動物細(xì)胞融合常用的方法是

。圖10（1）動物細(xì)胞融合（2）分泌特異性抗體、無限增殖（3）PEG（滅活的病毒、電刺激）目前六十頁\總數(shù)七十三頁\編于四點（4）細(xì)胞融合是隨機的過程，在HAT培養(yǎng)基中培養(yǎng)，要篩選出

細(xì)胞。在細(xì)胞培養(yǎng)過程中，為了促進(jìn)細(xì)胞攝取葡萄糖，常向培養(yǎng)液中加入

（激素）。（5）培養(yǎng)2周后，即測定培養(yǎng)細(xì)胞的特征，篩選出

細(xì)胞置于不同孔內(nèi)（如圖所示）培養(yǎng)。此操作前要將培養(yǎng)細(xì)胞稀釋到7～10個細(xì)胞/ml，每孔滴入0.1ml細(xì)胞稀釋液，其目的是

。（6）要獲得大量的單克隆抗體，可對獲得的雜交瘤細(xì)胞進(jìn)行

培養(yǎng)。（4）雜交瘤、胰島素（5）特異性分泌抗X蛋白抗體的、保證每個孔內(nèi)不多于一個細(xì)胞，達(dá)到單克隆培養(yǎng)的目的（單一細(xì)胞培養(yǎng)以保證抗體的純度）、（6）體外或體內(nèi)目前六十一頁\總數(shù)七十三頁\編于四點單克隆抗體制備過程目前六十二頁\總數(shù)七十三頁\編于四點8.已知細(xì)胞合成DNA有D和S兩條途徑，其中D途徑能被氨基嘌呤阻斷。人淋巴細(xì)胞中有這兩種DNA的合成途徑，但一般DNA不分裂增殖。鼠骨髓瘤細(xì)胞中盡管沒有S途徑，但能不斷分裂增殖，將這兩種細(xì)胞在試管中混合，加聚乙二醇促融，獲得雜種細(xì)胞。請回答：

⑴試管中除融合的雜種細(xì)胞外，還有

種融合細(xì)胞

2

目前六十三頁\總數(shù)七十三頁\編于四點⑵設(shè)計一方法（不考慮機械方法），從培養(yǎng)液中分離出雜種細(xì)胞，并說原理。

培養(yǎng)液中加入氨基嘌呤，收集增殖的細(xì)胞。

加入氨基嘌呤后，使D合成途徑阻斷，僅有D合成途徑的骨髓瘤細(xì)胞及其彼此融合的細(xì)胞就不能增殖，但人淋巴細(xì)胞和骨髓瘤細(xì)胞融合后的雜種細(xì)胞因為可以利用淋巴細(xì)胞中的S途徑合成DNA而增殖。目前六十四頁\總數(shù)七十三頁\編于四點（1）融合后的雜種細(xì)胞容易成活嗎？（2）制備單克隆抗體的過程應(yīng)用了哪些細(xì)胞工程技術(shù)手段？

（3）在整個制備的過程中要經(jīng)過幾次篩選？思考：細(xì)胞的同源性越近，融合形成的雜種細(xì)胞越易成活細(xì)胞融合技術(shù)、細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)Ⅰ.篩選得到雜交瘤細(xì)胞，Ⅱ.篩選先在多孔培養(yǎng)板上，在每孔只有一個雜交瘤細(xì)胞下培養(yǎng)篩選出特異抗體的細(xì)胞群目前六十五頁\總數(shù)七十三頁\編于四點⑷怎樣篩選出B淋巴細(xì)胞和骨髓瘤細(xì)胞間融合所形成的能產(chǎn)生特定抗體的雜交瘤細(xì)胞？用抗體檢測和克隆化培養(yǎng)得到能分泌所需抗體的雜種細(xì)胞——專一抗體檢測。18.如何利用雜交瘤細(xì)胞來大量生產(chǎn)單克隆抗體？①將雜交瘤細(xì)胞在體外大規(guī)模培養(yǎng)，從細(xì)胞培養(yǎng)液中就能提取大量的單克隆抗體；②把雜交瘤細(xì)胞注射到小鼠腹腔內(nèi)增殖，再從小鼠腹腔中提取單克隆抗體。目前六十六頁\總數(shù)七十三頁\編于四點⑸如何進(jìn)行雜交瘤細(xì)胞的抗體檢測及克隆化培養(yǎng)？融合后的細(xì)胞經(jīng)選擇性培養(yǎng)基培養(yǎng)后，能存活的細(xì)胞就是雜交瘤細(xì)胞。但這些雜交瘤細(xì)胞并非都是能分泌所需抗體的細(xì)胞，通常用“有限稀釋法”來選擇。將雜交瘤細(xì)胞稀釋，用多孔細(xì)胞培養(yǎng)板培養(yǎng)，使每孔細(xì)胞不超過一個，通過培養(yǎng)讓其增殖。然后檢測各孔上清液中細(xì)胞分泌的抗體（常用酶聯(lián)免疫吸附試驗法），那些上清液可與特定抗原結(jié)合的培養(yǎng)孔為陽性孔。陽性孔中的細(xì)胞還不能保證是來自單個細(xì)胞，挑選陽性孔的細(xì)胞繼續(xù)進(jìn)行有限稀釋，一般需進(jìn)行3～4次，直至確信每個孔中增殖的細(xì)胞為單克隆細(xì)胞。該過程即為雜交瘤細(xì)胞的克隆化培養(yǎng)。目前六十七頁\總數(shù)七十三頁\編于四點第二次篩選的原理和方法：在實際免疫過程中，由于采用連續(xù)注射抗原的方法，且一種抗原決定簇刺激機體形成相對應(yīng)的一種效應(yīng)B淋巴細(xì)胞，因此，從小鼠脾臟中取出的效應(yīng)B淋巴細(xì)胞的特異性是不同的，經(jīng)HAT培養(yǎng)液篩選的雜交瘤細(xì)胞特異性也存在差異，所以必須從雜交瘤細(xì)胞群中篩選出能產(chǎn)生針對某一預(yù)定抗原快定簇的特異性雜交瘤細(xì)胞。通常采用有限稀釋克隆細(xì)胞的方法，將雜交瘤細(xì)胞多倍稀釋，接種在多孔的細(xì)胞培養(yǎng)板上，使每一孔含一個或幾個雜交瘤細(xì)胞（理論上30%的孔中細(xì)胞數(shù)為0時，才能保證有些孔中是單個細(xì)胞），再由這些單細(xì)胞克隆生長，最終選出分泌預(yù)定特異抗體的雜交細(xì)胞株進(jìn)行擴大培養(yǎng)。

目前六十八頁\總數(shù)七十三頁\編于四點思考與探究1.植物體細(xì)胞雜交技術(shù)與動物細(xì)胞融合技術(shù)有什么不同？植物體細(xì)胞雜交技術(shù)與動物細(xì)胞融合技術(shù)基本相同，不同的是植物體細(xì)胞融合前需去掉細(xì)胞壁，然后再融合；動物細(xì)胞融合是兩個體細(xì)胞直接融合。誘導(dǎo)融合方法不同：動物細(xì)胞誘導(dǎo)融合所用的方法比植物體細(xì)胞雜交多一類滅活的病毒誘導(dǎo)；結(jié)果不同：植物體細(xì)胞雜交培養(yǎng)成了雜種植株，而動物細(xì)胞融合只培養(yǎng)出了雜交細(xì)胞。目前六十九頁\總數(shù)七十三頁\編于四點2.制備單克隆抗體時，為什么要選用B淋巴細(xì)胞和骨髓瘤細(xì)胞融合形成雜交瘤細(xì)胞？哺乳動物感染抗原后，其體內(nèi)會形成相應(yīng)的B淋巴細(xì)胞，B淋巴細(xì)胞能分泌相應(yīng)的抗體凝聚或殺死這些抗原。動物在免疫反應(yīng)的過程中，每一種B淋巴細(xì)胞能分泌一種特異性抗體，要想獲得大量的特異性抗體，必須使能分泌該單一抗體的B淋巴細(xì)胞大量增殖。B淋巴細(xì)胞具有產(chǎn)生單一抗體的能力，但不能在體外增殖；骨髓瘤細(xì)胞是一種癌細(xì)胞，它能在體外培養(yǎng)條件下無限增殖，但不能產(chǎn)生抗體。因此，把一種B淋巴細(xì)胞與骨髓瘤細(xì)胞進(jìn)行細(xì)胞融合，產(chǎn)生雜交瘤細(xì)胞，它會兼有兩個親本細(xì)胞的特性──在體外培養(yǎng)條件下能不斷增殖，同時能產(chǎn)生出某種特異性的抗體。目前七十頁\總數(shù)七十三頁\編于四點知識拓展