waters色譜柱相關(guān)知識(shí)

液相色譜基礎(chǔ)知識(shí)色譜柱基礎(chǔ)知識(shí)waters色譜柱相關(guān)知識(shí)第1頁對(duì)HPLC柱填料了解平均顆粒度，顆粒度分布顆粒度(dp)顆粒度越?。褐г礁?傳質(zhì)好，渦流擴(kuò)散小)

柱壓越高(滲透性差)顆粒分布顆粒分布越寬∶柱效低(滲透性差)顆粒形狀球型∶柱效高、重現(xiàn)性好、柱床結(jié)構(gòu)均勻無定型：柱床結(jié)構(gòu)不均勻

流動(dòng)相線性速度不均勻

譜帶擴(kuò)展waters色譜柱相關(guān)知識(shí)第2頁對(duì)HPLC柱填料了解（二）平均孔徑/孔體積孔徑/孔體積分布大孔徑可分析高分子量分子waters色譜柱相關(guān)知識(shí)第3頁對(duì)HPLC柱填料了解（三）鍵合相化學(xué)影響化合物分離度：a

不一樣鍵合相對(duì)不一樣種類化合物分離不一樣可能造成色譜分離機(jī)理不一樣如：C18、C8、CNwaters色譜柱相關(guān)知識(shí)第4頁硅膠表面及鍵合相waters色譜柱相關(guān)知識(shí)第5頁鍵合相色譜柱以硅膠為基質(zhì)，經(jīng)過化學(xué)鍵合方式把碳十八、碳八、胺基等基團(tuán)聯(lián)在基質(zhì)上，作為固定相。優(yōu)點(diǎn)∶固定相穩(wěn)定，不易流失應(yīng)用廣泛，可使用各種溶劑消除硅羥基不良影響缺點(diǎn)∶pH值不能小于3一樣填料，各種牌號(hào)色譜柱不盡相同waters色譜柱相關(guān)知識(shí)第6頁對(duì)HPLC柱填料了解（四）含碳量含碳量越高，k'值越大（固定相傳質(zhì)效應(yīng)增加）高含碳量有利于不易保留化合物分離水解穩(wěn)定性好，重現(xiàn)性好有利于極性化合物拖尾改進(jìn)低含碳量有利于分析中性及堿性化合物降低溶劑損耗waters色譜柱相關(guān)知識(shí)第7頁不一樣色譜柱含碳量

色譜柱 C% k'苊(50/50乙腈/水)SymmetryC18 19 17ZorbaxODS 17 15.7LiChrosorbRP-18 15 10.3SymmetryC8 12 12.5ResolveC-18 12 12.4UltrasphereODS 11 11.3PartisilODS-3 11 12.0mBondpakC-18 10 7.9Nova-PakC-18 7 5.5waters色譜柱相關(guān)知識(shí)第8頁對(duì)HPLC柱填料了解(五)填料端基封口封口殘余硅羥基降低不可逆吸附或拖尾增加碳含量（0.1%-1%）waters色譜柱相關(guān)知識(shí)第9頁殘基處理效果NovaPakC18未封口C18①抗壞血酸②煙酰胺③對(duì)氨基苯甲酸④哌咯西叮⑤核黃素⑥苯酚⑦鹽酸硫胺waters色譜柱相關(guān)知識(shí)第10頁對(duì)HPLC柱填料了解（六）硅膠活性主要影響堿性化合物保留行為：k'生產(chǎn)硅膠時(shí)處理溫度不一樣，硅膠活性也不一樣是選擇性差異主要起源硅膠雜質(zhì)含量重金屬含量低，硅羥基活性小，拖尾減小是色譜柱質(zhì)量好壞主要標(biāo)志waters色譜柱相關(guān)知識(shí)第11頁對(duì)HPLC柱填料了解（七）填料穩(wěn)定性硅膠填料pH：2-8聚合物填料pH：2-12pH值小于2時(shí)

鍵合相水解waters色譜柱相關(guān)知識(shí)第12頁填料基質(zhì)物理性質(zhì)影響全部C18柱都是相同嗎?填料基質(zhì)物理性質(zhì)對(duì)色譜柱影響平均孔徑及其分布∶影響被分析樣品分子量，大孔徑可分析高分子量樣品平均孔體積及其分布∶影響同孔徑含碳量∶影響化合物保留時(shí)間，高含碳量保留時(shí)間長填料端基封口∶主要影響堿性化合物峰形，未封口會(huì)使堿性化合物拖尾硅膠活性∶主要影響堿性化合物保留行為：K’，高活性K’大硅膠雜質(zhì)含量∶更苛刻條件下堿性化合物峰形waters色譜柱相關(guān)知識(shí)第13頁Waters色譜柱內(nèi)徑分析柱：WatersSpherisorb及其它企業(yè)品牌色譜柱多為4.6mm內(nèi)徑。Waters傳統(tǒng)品牌分析柱以3.9mm內(nèi)徑為主，比普通分析柱(4.6mm)細(xì)，所以：相對(duì)靈敏度高省溶劑，可用相對(duì)較低流速一樣流速下，柱壓較高(高效柱尤為顯著)注意在用文件方法時(shí)轉(zhuǎn)換流速,即:降低流速,以保持線速度相同。waters色譜柱相關(guān)知識(shí)第14頁色譜柱化學(xué)及外形結(jié)構(gòu)關(guān)系waters色譜柱相關(guān)知識(shí)第15頁對(duì)HPLC柱了解理論塔板數(shù)(N),容量因子(K’),選擇性系數(shù)(),其影響原因有∶N：受平均顆粒度及顆粒度分布影響,顆粒度越小,N越高：受填料表面化學(xué)性質(zhì)對(duì)色譜柱影響,不一樣鍵合相對(duì)不一樣種類樣品分離不一樣K’：受鍵合相表面含碳量影響,含碳量高時(shí)保留時(shí)間長waters色譜柱相關(guān)知識(shí)第16頁在一樣情況下保留行為也有差異所以：需要對(duì)色譜化學(xué)品(色譜柱)有更多了解需要不一樣品牌，即各個(gè)原因有較大差異色譜柱，以得到更各種選擇性Waters擁有眾多不一樣品牌色譜柱，目標(biāo)就是：供不一樣應(yīng)用要求用不一樣品牌色譜柱時(shí)，色譜方法有時(shí)可能需要重新開發(fā)waters色譜柱相關(guān)知識(shí)第17頁Waters各種硅膠基質(zhì)色譜柱waters色譜柱相關(guān)知識(shí)第18頁Waters不一樣品牌色譜柱m-BondaPak文件背景強(qiáng),是工業(yè)標(biāo)準(zhǔn)平均孔徑125?，10mm高活性、無定形硅膠中等疏水性表面，端基封口。有獨(dú)特選擇性Nova-Pak平均孔徑60?，4mm高韌度低活性球形硅膠低酸性，高疏水性,極好端基封口有利于小分子物質(zhì)分析waters色譜柱相關(guān)知識(shí)第19頁Waters不一樣品牌色譜柱Resolve平均孔徑90?，5/10mm低活性硅膠非常高疏水性,無故基封口有利于低保留中性及酸性化合物分離Delta-Pak有100?和300?兩種孔徑，5/15mm硅膠中到高疏水性，端基封口適合于多肽、蛋白分離及制備色譜waters色譜柱相關(guān)知識(shí)第20頁新一代硅膠基質(zhì)色譜柱Symmetry高純度硅膠：Fe,Al,Mg等均<10ppm孔徑100?，5m球形顆粒，端基封口超高含碳量：C18/19%，C8/12%表面積：300m2/g孔體積：1mL/g特點(diǎn)對(duì)稱峰形，好重現(xiàn)性，不一樣選擇性，使用壽命長waters色譜柱相關(guān)知識(shí)第21頁因?yàn)橥衔惨l(fā)靈敏度差異

他莫昔芬0.25g/mL信噪比11.06.5AUSymmetryC18AU5.0010.00MinutesConventionalC18waters色譜柱相關(guān)知識(shí)第22頁99.6%99.8%99.9%峰面積回收率T=1.0092.3%95.3%97.8%T=1.58Waters21,379峰面積回收率因?yàn)橥衔惨l(fā)積分誤差waters色譜柱相關(guān)知識(shí)第23頁超越極限：全新Xterra色譜柱集硅膠與聚合物基質(zhì)填料優(yōu)點(diǎn)為一體,突破常規(guī)高效色譜柱極限高效、高速分離不但能夠使用極小粒徑填料以進(jìn)行高分辨及快速分析，而且允許在高溫下進(jìn)行分離峰形優(yōu)異--對(duì)堿性化合物尤其如此pH范圍可與聚合物基質(zhì)色譜柱相比

pH范圍1-12極佳穩(wěn)定性即使在高溫或極端pH條件下仍可維持長壽命waters色譜柱相關(guān)知識(shí)第24頁峰形比較：XTerra?MSC18與普通C184.AcenaphthenePeakID:1.Propranolol2.Butylparaben3.Naphthalene5.AmitriptylineUsingSymmetryQCconditions:3.9x150mm,1.0mL/min,MeOH/20mMK2HPO4/KH2PO4,pH7.0,(65/35),23.4°CTime(min)0102030C18-Silica1234512345XTerra?MSC18USPT=2.28USPT=1.35Alden,Iranetawaters色譜柱相關(guān)知識(shí)第25頁寬pH范圍在pH1-12范圍內(nèi)保持穩(wěn)定使pH成為改變選擇性有力工具使可在非離子狀態(tài)下進(jìn)行分析堿性物質(zhì)穩(wěn)定保留waters色譜柱相關(guān)知識(shí)第26頁加速色譜柱壽命試驗(yàn)：

(pH10，50°C)壽命(小時(shí))waters色譜柱相關(guān)知識(shí)第27頁Xterra:快梯度分析AU0.000.100.20Minutes0.200.400.600.801.001.201.401.601.802.002.202.40waters色譜柱相關(guān)知識(shí)第28頁Waters特殊應(yīng)用色譜柱(1)糖及其它碳水化合物分析離子交換柱(鈣基/Ca)用于單糖、雙糖及糖醇等低分子量糖、及乙醇等分析。主要用于藥廠維生素C原料分析(sorbitol/mannitol-山梨醇/甘露醇)，酒廠(葡萄酒、啤酒等)糖及乙醇含量分析。柱溫~90℃，要求有柱溫箱。對(duì)流動(dòng)相(水)要求較高，要求用戶另置超純水系統(tǒng)。氨基類型柱分析單糖、雙糖及三糖等多糖分析，最大到DP10。用途較為廣泛，主要用于食品中糖分析。反相類型柱硅膠類型柱體積排除(凝膠/GPC)類型柱waters色譜柱相關(guān)知識(shí)第29頁Waters特殊應(yīng)用色譜柱(2)食品中常見有機(jī)物分析游離脂肪酸(FreeFattyAcid)分析甘油三酯及膽甾醇(俗稱膽固醇)分析NovaPakC18膽甾醇及未皂化油中抗氧劑分析StyragelHR100A及500A柱有效地分離。離子排斥類型色譜柱，用于有機(jī)酸，醇和碳水化合物類分析，適合于分析單糖類、有機(jī)酸或糖酸離子排斥及反相混合類型色譜柱，可測(cè)定葡萄酒、啤酒或其它飲料中乙醇及有機(jī)酸種類及含量，以確定其香型waters色譜柱相關(guān)知識(shí)第30頁Waters特殊應(yīng)用色譜柱(3)Waters生命科學(xué)專用柱(1)蛋白，多肽分析和提純Protein-Pak系列凝膠柱Protein-Pak系列離子交換柱弱陰離子/DEAE 弱陽離子/CM強(qiáng)陰離子/Q 強(qiáng)陽離子/SP疏水回受柱親合色譜柱反相柱DNA分析，同蛋白分析相近，但有些專用柱waters色譜柱相關(guān)知識(shí)第31頁Waters特殊應(yīng)用色譜柱(4)Waters生命科學(xué)專用柱(2)糖蛋白寡聚糖分析及純化離子交換柱(酸性)，Glyco-PakDEAE分配柱(中性)，Glyco-PakN(7.8×300mm)CarbohydrateAnalysis兒茶酚胺分析柱ResolveC18(傳統(tǒng)方法)、SymmetryC8氨基酸分析柱離子交換柱反相柱：Pico-Tag方法，AccQ-Tag方法waters色譜柱相關(guān)知識(shí)第32頁液相色譜實(shí)用技術(shù)（二）色譜柱使用及保養(yǎng)waters色譜柱相關(guān)知識(shí)第33頁色譜柱與儀器聯(lián)接不一樣企業(yè)色譜柱接頭不一樣。處理不妥時(shí),會(huì)造成：色譜峰展寬(死體積)致使柱效下降或滲漏處理方法∶自制對(duì)應(yīng)轉(zhuǎn)換接頭使用“通用”型接頭（錐箍及螺母）這種錐箍在不銹鋼管上是活動(dòng)，即stop-depth長度可調(diào)。所以能夠換接不一樣色譜系統(tǒng)及色譜柱。從WatersPhaseSeparations企業(yè)能得到一些PEEK工程塑料接頭,可用在各種類型色譜柱上。waters色譜柱相關(guān)知識(shí)第34頁色譜柱聯(lián)接各種錐箍和管路接頭長度示意圖:waters色譜柱相關(guān)知識(shí)第35頁色譜柱聯(lián)接Stop_depth長度不適當(dāng)造成柱前死體積waters色譜柱相關(guān)知識(shí)第36頁色譜柱聯(lián)接錐箍錐度不適當(dāng)造成滲漏:waters色譜柱相關(guān)知識(shí)第37頁Waters色譜柱聯(lián)接Waters及PhaseSeparations錐箍及螺母相同，但錐箍前露出不銹鋼管長度不一樣其長度被稱為：“stop-depth”Waters除Spherisorb以外各種品牌色譜柱用是“Waters”標(biāo)準(zhǔn)，其stop-depth長度為0.130英寸Spherisorb品牌色譜柱及PhaseSeparations企業(yè)其它品牌色譜柱用是“Parker-style”標(biāo)準(zhǔn)，其stop-depth為0.090英寸waters色譜柱相關(guān)知識(shí)第38頁測(cè)柱效-良好色譜試驗(yàn)習(xí)慣拿到一根新色譜柱時(shí)，先測(cè)柱效保留在新色譜柱上測(cè)得色譜圖，并統(tǒng)計(jì)色譜測(cè)試條件定時(shí)檢測(cè)柱效定時(shí)檢測(cè)儀器譜帶展寬waters色譜柱相關(guān)知識(shí)第39頁測(cè)柱效方法色譜柱種類繁多,性能各異,測(cè)定方法亦各不相同Waters色譜柱均附有UseandCare說明書,可按說明書所述方法測(cè)定以下是Waters反相C18柱測(cè)定方法:流動(dòng)相:乙腈/水=60:40;流速:1ml/min樣品:50mgAcenaphthene(二氫苊)溶于100ml乙腈,加入600μl丙酮進(jìn)樣量5μl檢測(cè)波長:254nmwaters色譜柱相關(guān)知識(shí)第40頁計(jì)算色譜柱柱效N理論塔板數(shù)計(jì)算公式：W s

方法Wtan 16 切線法Wh 5.54 半峰高W3s 9 3sW4s 16 4sW5s 25 5swaters色譜柱相關(guān)知識(shí)第41頁InjectInject用“切線”法計(jì)算柱效不好色譜柱柱效反而比好色譜柱要高，因?yàn)槠渫衔膊糠譁y(cè)不出來waters色譜柱相關(guān)知識(shí)第42頁GoodColumnInjectInject用“5”法計(jì)算柱效waters色譜柱相關(guān)知識(shí)第43頁色譜柱正確使用及操作流動(dòng)相轉(zhuǎn)換尤其是GPC柱流速(壓力)改變幅度溫度改變幅度專用色譜柱∶樣品及溶劑要求waters色譜柱相關(guān)知識(shí)第44頁正確使用色譜柱（一）樣品方面除去微粒及雜質(zhì)了解樣品在流動(dòng)相中溶解度如樣品溶劑不是流動(dòng)相，一定要用流動(dòng)相試溶解度，預(yù)防其在流動(dòng)相中析出

了解樣品與色譜柱基質(zhì)/填料是否相互作用waters色譜柱相關(guān)知識(shí)第45頁正確使用色譜柱（二）流動(dòng)相方面除去微粒純度要求超純水，梯度試驗(yàn)時(shí)水中有機(jī)雜質(zhì)含量要低緩沖液pH值，在填料允許范圍內(nèi)緩沖液（鹽）濃度溶劑：色譜純，并與填料相匹配溶劑中雜質(zhì)含量流動(dòng)相對(duì)樣品溶解度有機(jī)溶劑或水百分比waters色譜柱相關(guān)知識(shí)第46頁色譜柱在線保護(hù)裝置給色譜柱提供物理保護(hù)除去樣品及流動(dòng)相中顆粒給色譜柱提供化學(xué)保護(hù)預(yù)防分析柱被化學(xué)污染裝置在線過濾器自裝填料保護(hù)柱預(yù)裝保護(hù)柱waters色譜柱相關(guān)知識(shí)第47頁在線過濾器In-LineFilter，部件號(hào)WAT084560預(yù)防顆粒在色譜柱頭累積優(yōu)點(diǎn)：基本不影響柱效在需要高柱效分析時(shí)中慣用（如：氨基酸分析）可更換消耗品更換濾芯，部件號(hào)WAT005139(5/pkgs)更換墊圈，部件號(hào)WAT084567(10/pkgs)waters色譜柱相關(guān)知識(shí)第48頁保護(hù)柱可防止化學(xué)污染。多數(shù)保護(hù)柱影響到整個(gè)色譜柱柱效，尤其是在用微柱時(shí)保護(hù)柱種類普通自裝填料保護(hù)柱Waters部件號(hào)，WAT084550，用戶自裝填料影響柱效同裝填技術(shù)相關(guān)，柱效降低較大Guard-Pak預(yù)裝保護(hù)柱Waters部件號(hào)，WAT088141有各種填料預(yù)裝柱供選擇，使用方便。填料容積較小，會(huì)引發(fā)柱效降低waters色譜柱相關(guān)知識(shí)第49頁色譜柱清洗對(duì)所做樣品要有充分了解用對(duì)該樣品洗脫能力最強(qiáng)流動(dòng)相清洗硅膠柱普通方法先用甲醇洗去極性雜質(zhì)用干燥二氯甲烷、正庚烷100~200ml依次活化鍵合相柱(烷基)普通方法20倍柱體積：甲醇-氯仿-甲醇-水依次沖洗waters色譜柱相關(guān)知識(shí)第50頁色譜柱存放存放前處理除去雜質(zhì)、緩沖鹽適當(dāng)存放溶劑防止色譜柱床干涸防止機(jī)械震動(dòng)預(yù)防細(xì)菌生長注意存放溫度waters色譜柱相關(guān)知識(shí)第51頁色譜柱故障與異常柱壓過高多少才算高?不一樣色譜柱有差異不一樣系統(tǒng)有差異不一樣溶劑有差異柱效低重復(fù)性差不出峰，回收率低waters色譜柱相關(guān)知識(shí)第52頁柱壓過高為何柱壓會(huì)過高微粒堵塞樣品流動(dòng)相密封墊柱床膨脹不可逆吸附細(xì)菌生長waters色譜柱相關(guān)知識(shí)第53頁柱效低為何柱效低色譜柱被污染過濾片部分堵塞樣品、流動(dòng)相或密封墊細(xì)小顆粒造成堵塞色譜柱內(nèi)死體積流動(dòng)相pH值及組成不適當(dāng)造成固定相流失流速急劇改變?cè)斐晒潭ㄏ辔锢頁p壞機(jī)械震動(dòng)造成柱床產(chǎn)生裂縫柱床收縮或干涸waters色譜柱相關(guān)知識(shí)第54頁重復(fù)性差、回收率低試驗(yàn)重復(fù)性差色譜柱被污染流動(dòng)相pH值及組成不適當(dāng)造成鍵合相流失樣品溶劑不一樣或樣品本身不穩(wěn)定回收率低，不出峰“不可逆”吸附固定相過強(qiáng)或流動(dòng)相過弱非特異性吸附waters色譜柱相關(guān)知識(shí)第55頁色譜柱以外原因（一）“柱效”問題，不一定是色譜柱問題！系統(tǒng)連接問題：連接不好造成死體積進(jìn)樣器檢測(cè)器管路，連接口保護(hù)柱在線過濾器堵塞流動(dòng)相問題：色譜柱未平衡好進(jìn)樣量太大waters色譜柱相關(guān)知識(shí)第56頁色譜柱以外原因（二）柱壓過高，不一定是色譜柱問題！系統(tǒng)反壓問題阻尼器堵塞進(jìn)樣器堵塞管路或連接口堵塞在線過濾器不潔凈保護(hù)柱壓力傳感器不準(zhǔn)確流速是否錯(cuò)誤?waters色譜柱相關(guān)知識(shí)第57頁色譜柱以外原因（三）試驗(yàn)重復(fù)性差梯度試驗(yàn)時(shí)平衡時(shí)間不足溫度波動(dòng)流動(dòng)相組成改變樣品溶劑不一樣樣品穩(wěn)定性不好方法開發(fā)不好緩沖液pH值不適當(dāng)緩沖液緩沖能力不足waters色譜柱相關(guān)知識(shí)第58頁簡單判別方法高柱反壓是否伴伴隨保留時(shí)間改變?峰形變壞?分辨率變壞?測(cè)量色譜系統(tǒng)譜帶展寬經(jīng)典分析系統(tǒng)應(yīng)遠(yuǎn)小于100微升如大于此數(shù)應(yīng)檢驗(yàn)儀器系統(tǒng)waters色譜柱相關(guān)知識(shí)第59頁測(cè)量色譜系統(tǒng)譜帶展寬卸下色譜柱，用UNION(兩通)代替之按測(cè)柱效方法，以1/10樣品濃度進(jìn)樣，大約2~5微升用5sigma方法測(cè)4.4%峰高處峰寬：W儀器參數(shù)∶流速∶1.0ml/min紙速∶20cm/min(用統(tǒng)計(jì)儀時(shí)，接檢測(cè)器10mV檔)檢測(cè)器靈敏度∶0.5-1.0AUFS(用統(tǒng)計(jì)儀時(shí))檢測(cè)器時(shí)間常數(shù)∶小于0.2譜帶展寬（ml） =1000×W（cm）/20 （統(tǒng)計(jì)儀）

=1000×W（min） （工作站）waters色譜柱相關(guān)知識(shí)第60頁流動(dòng)相及樣品預(yù)處理液相色譜實(shí)用技術(shù)（三）waters色譜柱相關(guān)知識(shí)第61頁液相色譜對(duì)流動(dòng)相要求除色譜柱對(duì)流動(dòng)相正確要求外，還有∶與檢測(cè)器匹配脫氣防止鹵素離子（不銹鋼系統(tǒng)）溶劑粘度預(yù)防細(xì)菌生長waters色譜柱相關(guān)知識(shí)第62頁流動(dòng)相脫氣流動(dòng)相脫氣目標(biāo)使色譜泵輸液準(zhǔn)確輸液均勻準(zhǔn)確，而且脈動(dòng)減小保留時(shí)間及色譜峰面積重現(xiàn)性提升提升檢測(cè)性能預(yù)防氣泡引發(fā)尖峰基線穩(wěn)定，信噪比增加溶劑紫外吸收本底降低保護(hù)色譜柱降低死體積預(yù)防填料氧化waters色譜柱相關(guān)知識(shí)第63頁流動(dòng)相脫氣方法加熱簡單，如同抽真空一起使用，其效果很好。但輕易造成流動(dòng)相組成改變抽真空同上，普通在溶劑抽濾同時(shí)，也有脫氣效果超聲波簡單，但效果不理想。通惰性氣體（普通用氦氣）可保持連續(xù)脫氣，多用于低壓梯度在線脫氣機(jī)可保持連續(xù)脫氣，多用于低壓梯度waters色譜柱相關(guān)知識(shí)第64頁樣品預(yù)處理樣品預(yù)處理目標(biāo)除去微粒降低干擾雜質(zhì)濃縮微量組份提升檢測(cè)靈敏度及選擇性改進(jìn)分離效果有利于保護(hù)色譜柱及儀器waters色譜柱相關(guān)知識(shí)第65頁樣品預(yù)處理主要性占樣品分析時(shí)間百分比最大樣品預(yù)處理所用時(shí)間遠(yuǎn)大于色譜分離時(shí)間占分析消耗總成本比重最大消耗大量溶劑及其它化學(xué)品試驗(yàn)重復(fù)性及準(zhǔn)確性最差步驟影響試驗(yàn)結(jié)果好壞最主要原因

是決定性步驟waters色譜柱相關(guān)知識(shí)第66頁樣品預(yù)處理過程waters色譜柱相關(guān)知識(shí)第67頁理想樣品處理方法選擇性吸附去除干擾物在廣泛極性范圍內(nèi)，對(duì)酸性、堿性及中性物質(zhì)皆可取得高而重現(xiàn)性回收率輕易實(shí)現(xiàn)自動(dòng)化以取得高樣品吞吐量簡單方法輕易使用，耐受性好快速、經(jīng)濟(jì)waters色譜柱相關(guān)知識(shí)第68頁樣品預(yù)處理慣用方法高速離心過濾、超濾選擇性沉淀衍生反應(yīng)液-固萃取/液-液萃取Oasis和Sep-Pak固相提取小柱其它waters色譜柱相關(guān)知識(shí)第69頁去除微粒過濾過濾膜/過濾裝置有機(jī)(0.5μm)/無機(jī)(0.45μm)膜片可更換一次性使用膜“Cartridge”使用方便簡單，交叉污染小有更小內(nèi)徑，可用于微量樣品處理高速離心大于：10,000rpmwaters色譜柱相關(guān)知識(shí)第70頁超濾機(jī)理超濾是一個(gè)基于分子量分離技術(shù)目標(biāo)依據(jù)分子量不一樣把分子、細(xì)胞及病毒等分為不一樣餾份除去小分子樣品中大分子蛋白脫鹽waters色譜柱相關(guān)知識(shí)第71頁選擇性沉淀慣用于生化樣品中除蛋白有機(jī)溶劑乙腈，甲醇強(qiáng)酸三氯乙酸，過氯酸鹽50%硫酸銨10%TCAwaters色譜柱相關(guān)知識(shí)第72頁樣品衍生提升檢測(cè)靈敏度增加紫外基團(tuán)以增強(qiáng)紫外檢測(cè)靈敏度增加熒光基團(tuán)方便使用高靈敏度熒光檢測(cè)器改變分離選擇性改變組份基團(tuán)，如：變離子型化合物為非離子型，用反相方法分離經(jīng)典例子氨基酸分析waters色譜柱相關(guān)知識(shí)第73頁AccQ-Tag衍生法6-氨基喹啉waters色譜柱相關(guān)知識(shí)第74頁濃縮樣品濃縮樣品方法萃取/吹干沉淀/再溶解色譜法液固抽提

Oasis小柱

Sep-Pak小柱waters色譜柱相關(guān)知識(shí)第75頁固相萃取（SPE）技術(shù)固相萃取技術(shù)是基于同液相色譜一樣技術(shù)開發(fā)產(chǎn)品，分離復(fù)雜樣品中不一樣組份固相萃取技術(shù)（SPE）主要性試驗(yàn)室中60~80%成本及工作量在樣品制備上縮短樣品制備時(shí)間降低樣品前處理成本提升分析準(zhǔn)確性及回收率更輕易自動(dòng)化降低樣品處理步驟降低對(duì)不穩(wěn)定樣品影響提升安全性waters色譜柱相關(guān)知識(shí)第76頁全新固相提取小柱OasisHLB親水-親脂平衡共聚物“親水”使填料含有水可浸潤性質(zhì)降低與水接觸角“親脂”提供對(duì)被分析物質(zhì)反相保留能力NO親水性單體∶

N-乙烯基吡咯烷酮親脂性單體∶

二乙烯基苯waters色譜柱相關(guān)知識(shí)第77頁特征一，水濕性優(yōu)勢(shì)∶即使小柱在固相提取過程中干枯，也能吸附被分析物質(zhì)益處∶ 即使小柱在固相提取過程中干枯，也能取得高回收率(>85%)提取板及小柱可取得一致回收率(RSD‘s<5%)輕易使用OasisHLB固相提取小柱waters色譜柱相關(guān)知識(shí)第78頁C18與OasisHLB吸附劑浸潤能力比較HLHLHLHLHLHLLLLLLLLLLLLL

HLBH=親水單元L=親脂單元C18waters色譜柱相關(guān)知識(shí)第79頁特征二，通用型吸附劑優(yōu)勢(shì):

在很寬極性范圍內(nèi)保留酸性、堿性及中性化合物樣品不會(huì)穿透小柱益處:

對(duì)極性化合物可取得較高回收率使用同一方法，提取藥品及其極性代謝產(chǎn)物可取得高而重現(xiàn)性好回收率一個(gè)吸附劑適合用于大多數(shù)SPE提取過程OasisHLB固相提取小柱waters色譜柱相關(guān)知識(shí)第80頁結(jié)果:通用型吸附劑020406080100AcidsNeutralsBases%回收率Ibuprofen(2.5?g)Naproxen(2?g)SalicylicAcid(5?g)Sulfadiazine(10?g)Sulfamerazine(10?g)Acetaminophen(0.5?g)Theobromine(0.5?g)Paraxanthine(0.5?g)Theophylline(0.5?g)Caffeine(0.5?g)Procainamide(0.5?g)Ranitidine(0.5?g)Oxycodone(1?g)Propranolol(4?g)Naltrexone(1?g)Salbutamol(2?g)Doxepin(4?g)

SpikedSerumon1cc30mgOasis?HLBCartridgeswaters色譜柱相關(guān)知識(shí)第81頁Oasis小柱使用方法平衡/活化小柱1mL甲醇/1mL水上樣可上200mL樣品清洗1mL5%甲醇/水洗脫1mL甲醇揮發(fā)并用流動(dòng)相重組樣品制備將樣品用水稀釋準(zhǔn)備進(jìn)樣waters色譜柱相關(guān)知識(shí)第82頁OasisHLB：優(yōu)化提取方法waters色譜柱相關(guān)知識(shí)第83頁OasisHLB固相提取小柱特征三，重現(xiàn)性O(shè)asisHLB吸附劑填料在WatersISO9002-認(rèn)可工廠中生產(chǎn)—確保重現(xiàn)性.

優(yōu)勢(shì)∶每批吸附劑進(jìn)行嚴(yán)格質(zhì)量控制，建立SPE填料重現(xiàn)性新標(biāo)準(zhǔn)益處: 每盒產(chǎn)品附帶合格證書不一樣批次含有重現(xiàn)回收率waters色譜柱相關(guān)知識(shí)第84頁Oasis不一樣批次間重現(xiàn)性BatchABatchBBatchC

0.96%1.21%2.02%3.66%2.40%3.06%3.67%RSD020406080100%RecoveryProcainamideRanitidineAcetaminophenPropranololDP-phthalateDoxepinb-MethasoneValeratewaters色譜柱相關(guān)知識(shí)第85頁OasisHLB-應(yīng)用各種藥品提取，尤其是生理體液中藥品，如血漿、尿液中藥品等天然產(chǎn)物提取農(nóng)業(yè)化學(xué)應(yīng)用，如提取除草劑、殺蟲劑等環(huán)境化學(xué)應(yīng)用，如提取多環(huán)芳烴等waters色譜柱相關(guān)知識(shí)第86頁色譜圖常見問題色譜圖常見問題主要有兩類:色譜峰峰形異常問題比如負(fù)峰,寬峰,肩峰,雙峰,峰形不對(duì)稱等色譜峰保留時(shí)間問題保留時(shí)間不穩(wěn)定等waters色譜柱相關(guān)知識(shí)第87頁色譜圖常見問題分析(一)色譜峰峰形異常問題:色譜圖中未出峰:進(jìn)樣問題:未進(jìn)樣或樣品分解流動(dòng)相問題:泵未輸液或流動(dòng)相不正確檢測(cè)器設(shè)置不正確,或檢測(cè)器有問題一個(gè)或幾個(gè)峰是負(fù)峰流動(dòng)相吸收本底高進(jìn)樣過程中進(jìn)了空氣離子對(duì)分離中系統(tǒng)峰樣品組分吸收(RI或UV)低于流動(dòng)相waters色譜柱相關(guān)知識(shí)第88頁色譜圖常見問題分析(一)(續(xù))色譜峰峰形異常問題:全部峰均為負(fù)峰:信號(hào)電纜接反或檢測(cè)器輸出極性設(shè)置顛倒光學(xué)裝置還未到達(dá)平衡全部峰都是寬峰系統(tǒng)未平衡或未到達(dá)化學(xué)平衡溶樣溶劑比流動(dòng)相強(qiáng)很多色譜柱類型或尺寸不正確色譜柱或保護(hù)柱被污染或降級(jí)溫度改變對(duì)色譜柱影響waters色譜柱相關(guān)知識(shí)第89頁色譜圖常見問題分析(一)(續(xù))色譜峰峰形異常問題:較早洗脫峰呈寬峰進(jìn)樣體積過大或樣品濃度太高進(jìn)樣器有問題,定量環(huán)(Loop)大小不適當(dāng)在線過濾器,保護(hù)柱,色譜柱或管路堵塞管路問題:內(nèi)徑不對(duì)或切管不正確管路連接問題:接頭或錐箍不正確檢測(cè)器時(shí)間常數(shù)不正確waters色譜柱相關(guān)知識(shí)第90頁色譜圖常見問題分析(一)(續(xù))色譜峰峰形異常問題:峰比預(yù)想要小樣品粘度過大進(jìn)樣器有問題或進(jìn)樣體積有誤檢測(cè)器設(shè)置不正確,定量環(huán)(Loop)體積不正確檢測(cè)器輸出未置零用了不正確檢測(cè)器輸出信號(hào)檢測(cè)池被污染檢測(cè)器燈可能有問題waters色譜柱相關(guān)知識(shí)第91頁色譜圖常見問題分析(一)(續(xù))色譜峰峰形異常問題:雙峰或肩峰進(jìn)樣量或樣品濃度過大保護(hù)柱或色譜柱進(jìn)口堵塞保護(hù)柱或色譜柱污染或失效前伸峰進(jìn)樣量或樣品濃度過大溶樣溶劑相對(duì)于流動(dòng)相太強(qiáng)保護(hù)柱或色譜柱污染或失效waters色譜柱相關(guān)知識(shí)第92頁色譜圖常見問題分析(一)(續(xù))色譜峰峰形異常問題:拖尾峰保護(hù)柱或色譜柱問題:污染或失效進(jìn)樣問題檢測(cè)器時(shí)間常數(shù)不正確平頭峰檢測(cè)器設(shè)置不正確進(jìn)樣體積太大或樣品濃度太高waters色譜柱相關(guān)知識(shí)第93頁色譜峰保留時(shí)間問題:保留時(shí)間飄忽不定(各次運(yùn)行之間)系統(tǒng)不穩(wěn)定或未達(dá)化學(xué)平衡泵壓力不穩(wěn)(泵頭里有氣泡)進(jìn)樣體積過大或樣品濃度過大溫度波動(dòng)流動(dòng)相混合不均勻色譜柱被污染色譜圖常見問題分析(二)waters色譜柱相關(guān)知識(shí)第94頁色譜峰保留時(shí)間問題:保留時(shí)間增加或降低(各次運(yùn)行之間)系統(tǒng)不穩(wěn)定或化學(xué)平衡不足泵流速改變溫度改變色譜柱污染,柱效下降流動(dòng)相被污染溶劑入口過濾器堵或管路堵塞系統(tǒng)滲漏色譜圖常見問題分析(二)(續(xù))waters色譜柱相關(guān)知識(shí)第95頁色譜圖常見問題分析(二)(續(xù))色譜峰保留時(shí)間問題:保留時(shí)間改變到一個(gè)新恒定值流動(dòng)相不正確或其組成不正確泵流速改變實(shí)際輸液流速不正確(泵失靈或故障)環(huán)境溫度改變；柱溫不正確色譜柱尺寸或類型不正確色