微生物的實驗室培養(yǎng)

微生物的實驗室培養(yǎng)微生物的實驗室培養(yǎng)第1頁微生物包含哪五類：病毒細菌放線菌真菌原生動物特點：結(jié)構(gòu)都相當簡單,個體多數(shù)十分微小.通常要用光學顯微鏡或電子顯微鏡才能看到，有甚至沒有細胞結(jié)構(gòu).且體內(nèi)普通不含有葉綠素.不能進行光合作用.原核生物界原生生物界真菌界病毒界微生物基礎知識微生物的實驗室培養(yǎng)第2頁芽孢有些細菌在一定條件下，細胞里面形成一個橢圓形休眠體，叫做芽孢。芽孢壁很厚，對干旱、低溫、高溫等惡劣環(huán)境有很強抵抗力。比如，有細菌芽孢，煮沸3小時以后才死亡。芽孢又小又輕，能夠隨風飄散。當環(huán)境適宜（如溫度、水分適宜）時候，芽孢又能夠萌發(fā)，形成一個細菌.微生物的實驗室培養(yǎng)第3頁菌落：單個或少數(shù)細菌在固體培養(yǎng)基上大量繁殖時，就會形成一個肉眼可見，含有一定形態(tài)結(jié)構(gòu)子細胞群體，叫做菌落。菌落是判定菌種主要依據(jù)。微生物的實驗室培養(yǎng)第4頁菌落細菌菌落特征因種而異微生物的實驗室培養(yǎng)第5頁放線菌1、結(jié)構(gòu)：單細胞原核分支狀菌絲（基內(nèi)菌絲、氣生菌絲）微生物的實驗室培養(yǎng)第6頁鏈霉素、土霉素、四環(huán)素、氯霉素、紅霉素、慶大霉素

微生物中發(fā)覺了幾千種抗生素，其中2/3是由放線菌產(chǎn)生

應用:微生物的實驗室培養(yǎng)第7頁細菌營養(yǎng)類型依據(jù)細菌所利用能源和碳源不一樣，將細菌分為兩大營養(yǎng)類型。自養(yǎng)菌（autotroph）異養(yǎng)菌（heterotroph）微生物的實驗室培養(yǎng)第8頁了解相關培養(yǎng)基基礎知識，進行無菌技術(shù)操作，進行微生物培養(yǎng)。

一、課題目標：掌握培養(yǎng)基制備、高壓蒸氣滅菌和平板劃線法等基礎操作技術(shù)，熟練、規(guī)范地進行無菌操作，成功地培養(yǎng)微生物。無菌技術(shù)操作。二、課題重點和難點：三、技能目標：微生物的實驗室培養(yǎng)第9頁一、基礎知識：（一）培養(yǎng)基

培養(yǎng)基（培養(yǎng)液）是由人工方法配制而成，專供微生物生長繁殖使用混合營養(yǎng)液。（1）按物理狀態(tài)來分：培養(yǎng)基可分為固體培養(yǎng)基和液體培養(yǎng)基。其中固體培養(yǎng)基用于菌種分離、判定菌落等。（2）按功效來分，可分為選擇培養(yǎng)基和判別培養(yǎng)基。（3）按成份來分，可分為天然培養(yǎng)基和合成培養(yǎng)基。1.培養(yǎng)基類型和用途微生物的實驗室培養(yǎng)第10頁2.不一樣微生物往往需要采取不一樣培養(yǎng)基配方

(參考教材附錄內(nèi)容)

3.不論哪種培養(yǎng)基，普通都含有水、碳源、和氮源、無機鹽、等營養(yǎng)物質(zhì)，另外還需要滿足微生物生長對pH、特殊營養(yǎng)物質(zhì),比如:生長因子(即細菌生長必需，而本身不能合成化合物,如維生素、一些氨基酸、嘌呤、嘧啶)以及氧氣、二氧化碳、滲透壓等要求。微生物的實驗室培養(yǎng)第11頁選擇培養(yǎng)基加入青霉素培養(yǎng)基:

分離酵母菌、霉菌等真菌加入高濃度食鹽培養(yǎng)基:

分離金黃色葡萄球菌不加氮源無氮培養(yǎng)基:

分離固氮菌不加含碳有機物無碳培養(yǎng)基:

分離自養(yǎng)型微生物加入青霉素等抗生素培養(yǎng)基:

分離導入了目標基因受體細胞加入氨基喋呤、次黃嘌呤和胸腺嘧啶核苷培養(yǎng)基:

分離雜交瘤細胞微生物的實驗室培養(yǎng)第12頁

依據(jù)細胞生存所需物質(zhì)種類和數(shù)量，用人工方法模擬合成。合成培養(yǎng)基主要成份是氨基酸、維生素、碳水化合物、無機鹽和其它一些輔助物質(zhì)。

優(yōu)點：標準化生產(chǎn)，組分和含量相對固定;成本低缺點：缺乏一些成份，不能完全滿足體外細胞生長需要。合成培養(yǎng)基:微生物的實驗室培養(yǎng)第13頁天然培養(yǎng)基有血清、血漿、和組織提取液（如雞胚和牛胚浸液）。優(yōu)點：營養(yǎng)成份豐富，培養(yǎng)效果好缺點：起源受限;成份復雜，影響對一些試驗產(chǎn)物提取和試驗結(jié)果分析;易發(fā)生支原體污染;天然培養(yǎng)基：微生物的實驗室培養(yǎng)第14頁液體培養(yǎng)基：表面生長均勻混濁生長沉淀生長微生物的實驗室培養(yǎng)第15頁固體培養(yǎng)基：菌落，菌苔微生物的實驗室培養(yǎng)第16頁4.培養(yǎng)基用途液體培養(yǎng)基：增菌固體培養(yǎng)基：純化，增菌半固體培養(yǎng)基：動力檢測，保種微生物的實驗室培養(yǎng)第17頁（二）無菌技術(shù)1.無菌技術(shù)概念

無菌操作泛指在培養(yǎng)微生物操作中，全部預防雜菌污染方法。不論是隨即將要學到倒平板、平板劃線操作，還是平板稀釋涂布法，其操作中每一步都需要做到“無菌”，即預防雜菌污染。只有熟練、規(guī)范地進行無菌操作，才可能成功地培養(yǎng)微生物。微生物的實驗室培養(yǎng)第18頁

（１）消毒定義：利用化學或物理方法，殺死大部份致病微生物過程。區(qū)分為高程度消毒（High-levelDisinfection）、中程度消毒（Intermediate-levelDisinfection）、低程度消毒（Low-levelDisinfection）三種方式。2.消毒與滅菌概念及二者區(qū)分

微生物的實驗室培養(yǎng)第19頁

（2）滅菌定義：

以化學劑或物理方法毀滅全部微生物，包含全部細菌繁殖體、芽孢、霉菌及病毒，而到達完全無菌之過程。

滅菌與消毒技術(shù)是微生物相關工作中最普通也是最主要技術(shù)。微生物的實驗室培養(yǎng)第20頁1、煮沸消毒法:100℃煮沸5-6min2、巴氏消毒法：70-75℃下煮30min或80℃下煮15min3、化學藥劑消毒法:用75%酒精、新潔爾滅等進行皮膚消毒;氯氣消毒水源4、紫外線消毒……(1)消毒方法：3.常見消毒與滅菌方法微生物的實驗室培養(yǎng)第21頁1、灼燒滅菌2、干熱滅菌：160-170℃下加熱1-2h。3、高壓蒸氣滅菌：100kPa、121℃下維持15-30min.(2)滅菌方法：微生物的實驗室培養(yǎng)第22頁

最常見滅菌方法是高壓蒸汽滅菌，它能夠殺滅全部生物，包含最耐熱一些微生物休眠體，同時能夠基礎保持培養(yǎng)基營養(yǎng)成份不被破壞。有些玻璃器皿也可采取高溫干熱滅菌。為了預防雜菌，尤其是空氣中雜菌污染，試管及玻璃燒瓶都需采取適宜塞子塞口，通常采取棉花塞，也可采取各種金屬、塑料及硅膠帽，它們只可讓空氣經(jīng)過，而空氣中其它微生物不能經(jīng)過。而平皿是由正反兩平面板互扣而成，這種器具是專為預防空氣中微生物污染而設計。

微生物的實驗室培養(yǎng)第23頁分類定義方法滅菌法殺滅一切微生物物理法：熱力、輻射、微波、等離子體化學法：醛類、烷化劑高效消毒法殺滅一切致病微生物紫外線、含氯劑、臭氧、復配劑等中效消毒法殺滅除芽孢外致病微生物超聲波、碘類、醇類、酚類低效消毒法殺滅細菌繁殖體、親脂病毒單鏈季胺鹽、雙胍類、中草藥、金屬離子無菌技術(shù)微生物的實驗室培養(yǎng)第24頁3.微生物試驗室培養(yǎng)基礎操作程序1、器具滅菌2、培養(yǎng)基配制3、培養(yǎng)基滅菌4、倒平板5、微生物接種6、恒溫箱中培養(yǎng)7、菌種保留微生物的實驗室培養(yǎng)第25頁1.無菌技術(shù)除了用來預防試驗室培養(yǎng)物被其它外來微生物污染外，還有什么目標？2.請你判斷以下材料或用具是否需要消毒或滅菌。假如需要，請選擇適當方法。（1）培養(yǎng)細菌用培養(yǎng)基與培養(yǎng)皿（2）玻棒、試管、燒瓶和吸管（3）試驗操作者雙手答：無菌技術(shù)還能有效防止操作者本身被微生物感染。答：（1）、（2）需要滅菌；（3）需要消毒。旁欄思索微生物的實驗室培養(yǎng)第26頁三、試驗操作

1.制備牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基（用于培養(yǎng)細菌）微生物的實驗室培養(yǎng)第27頁1．計算、稱量2．溶化3．調(diào)pH：pH7．6

4．過濾：這一步能夠省去。5．分裝：分裝過程中注意不要使培養(yǎng)基沾在管口或瓶口上，以免沾污棉塞而引發(fā)污染。分裝三角燒瓶量以不超出三角燒瓶容積二分之一為宜。6．加塞7．包扎操作步驟微生物的實驗室培養(yǎng)第28頁8．滅菌:

將50ml培養(yǎng)基用玻棒轉(zhuǎn)移至三角錐瓶中，塞上棉花塞，包上牛皮紙，再放入高壓蒸氣滅菌鍋，在壓力為100kPa、溫度為121℃，滅菌15～30min。將培養(yǎng)皿用舊報紙包裹，放入干熱滅菌箱內(nèi)，在160～170℃下滅菌2h。9．倒平板:

待培養(yǎng)基冷卻到50℃左右時，在酒精燈附近倒平板。（倒平板操作見書本）2d后觀察平板，無雜菌污染才可用來接種.10．無菌檢驗：將滅菌培養(yǎng)基放入37℃溫室中培養(yǎng)24—48小時，以檢驗滅菌是否徹底。微生物的實驗室培養(yǎng)第29頁倒平板技術(shù)微生物的實驗室培養(yǎng)第30頁1.培養(yǎng)基滅菌后，需要冷卻到50℃左右時，才能用來倒平板。你用什么方法來預計培養(yǎng)基溫度？問題討論答：能夠用手觸摸盛有培養(yǎng)基錐形瓶，感覺錐形瓶溫度下降到剛才不燙手時，就能夠進行倒平板了。2.為何需要使錐形瓶瓶口經(jīng)過火焰？答：經(jīng)過灼燒滅菌，預防瓶口微生物污染培養(yǎng)基。微生物的實驗室培養(yǎng)第31頁3.平板冷凝后，為何要將平板倒置？4.在倒平板過程中，假如不小心將培養(yǎng)基濺在皿蓋與皿底之間部位，這個平板還能用來培養(yǎng)微生物嗎？為何？答：平板冷凝后，皿蓋上會凝結(jié)水珠，凝固后培養(yǎng)基表面濕度也比較高，將平板倒置，既能夠使培養(yǎng)基表面水分更加好地揮發(fā)，又能夠預防皿蓋上水珠落入培養(yǎng)基，造成污染。答：空氣中微生物可能在皿蓋與皿底之間培養(yǎng)基上滋生，所以最好不要用這個平板培養(yǎng)微生物。微生物的實驗室培養(yǎng)第32頁2、純化大腸桿菌接種方法有：平板劃線法和稀釋涂布平板法

平板劃線法:經(jīng)過接種環(huán)在瓊脂固體培養(yǎng)基表面連續(xù)畫線操作,將聚集菌鐘逐步稀釋分散到培養(yǎng)基表面.在數(shù)次畫線后,能夠分離到由一個細胞繁殖而來肉眼可見子細胞群體,這就是菌落.微生物接種技術(shù)微生物的實驗室培養(yǎng)第33頁微生物的實驗室培養(yǎng)第34頁微生物的實驗室培養(yǎng)第35頁問題討論

1.為何在操作第一步以及每次劃線之前都要灼燒接種環(huán)？在劃線操作結(jié)束時，依然需要灼燒接種環(huán)嗎？為何？

答：操作第一步灼燒接種環(huán)是為了防止接種環(huán)上可能存在微生物污染培養(yǎng)物；每次劃線前灼燒接種環(huán)是為了殺死上次劃線結(jié)束后，接種環(huán)上殘留菌種，使下一次劃線時，接種環(huán)上菌種直接起源于上次劃線末端，從而經(jīng)過劃線次數(shù)增加，使每次劃線時菌種數(shù)目逐步降低，方便得到菌落。劃線結(jié)束后灼燒接種環(huán)，能及時殺死接種環(huán)上殘留菌種，防止細菌污染環(huán)境和感染操作者。微生物的實驗室培養(yǎng)第36頁

2.在灼燒接種環(huán)之后，為何要等其冷卻后再進行劃線？答：以免接種環(huán)溫度太高，殺死菌種。

3.在作第二次以及其后劃線操作時，為何總是從上一次劃線末端開始劃線？

答：劃線后，線條末端細菌數(shù)目比線條起始處要少，每次從上一次劃線末端開始，能使細菌數(shù)目伴隨劃線次數(shù)增加而逐步降低，最終能得到由單個細菌繁殖而來菌落。微生物的實驗室培養(yǎng)第37頁微生物的實驗室培養(yǎng)第38頁微生物的實驗室培養(yǎng)第39頁問題討論

涂布平板全部操作都應在火焰附近進行。結(jié)合平板劃線與系列稀釋無菌操作要求，想一想，第2步應怎樣進行無菌操作？

應從操作各個細節(jié)確?！盁o菌”。比如，酒精燈與培養(yǎng)皿距離要適當、吸管頭不要接觸任何其它物體、吸管要在酒精燈火焰周圍等等。微生物的實驗室培養(yǎng)第40頁微生物恒溫培養(yǎng)微生物恒溫培養(yǎng)微生物的實驗室培養(yǎng)第41頁微生物恒溫培養(yǎng)微生物的實驗室培養(yǎng)第42頁菌種保留1、暫時保藏：接種到固體斜面培養(yǎng)基，菌落長成后置于4℃冰箱保留。2、長久保留：甘油冷凍管藏法微生物的實驗室培養(yǎng)第43頁四、課題結(jié)果評價

（一）培養(yǎng)基制作是否合格假如未接種培養(yǎng)基在恒溫箱中保溫1～2d后無菌落生長，說明培養(yǎng)基制備是成功，不然需要重新制備。（二）接種操作是否符合無菌要求假如培養(yǎng)基上生長菌落顏色、形狀、大小基礎一致，并符合大腸桿菌菌落特點，則說明接種操作是符合要求；假如培養(yǎng)基上出現(xiàn)了其它菌落，則說明接種過程中，無菌操作還未到達要求，需要分析原因，再次練習。（三）是否進行了及時細致觀察與統(tǒng)計培養(yǎng)12h與24h后大腸桿菌菌落大小會有顯著不一樣，及時觀察統(tǒng)計同學會發(fā)覺這一點，并能觀察到其它一些細微改變。這一步要求主要是培養(yǎng)學生良好科學態(tài)度與習慣。微生物的實驗室培養(yǎng)第44頁本課題知識小結(jié):微生物的實驗室培養(yǎng)第45頁【典例解析】例1．關微生物營養(yǎng)物質(zhì)敘述中，正確是A.是碳源物質(zhì)不可能同時是氮源B.凡碳源都提供能量C.除水以外無機物只提供無機鹽D.無機氮源也能提供能量解析：不一樣微生物，所需營養(yǎng)物質(zhì)有較大差異，要針對微生物詳細情況分析。對于A、B選項，它表示是不完整。有碳源只能是碳源，如二氧化碳；有碳源可同時是氮源，如NH4HCO3；有碳源同時是能源，如葡萄糖；有碳源同時是氮源，也是能源，如蛋白胨。對于C選項，除水以外無機物種類繁多，功效也多樣。如二氧化碳，可作為自養(yǎng)型微生物碳源；NaHCO3，可作為自養(yǎng)型微生物碳源和無機鹽