微生物培養(yǎng)技術(shù)演示文稿

微生物培養(yǎng)技術(shù)演示文稿目前一頁\總數(shù)五十頁\編于十八點微生物非細胞生物：病毒原核生物：細菌、放線菌、支原體、立克次氏體真核生物：真菌（酵母菌、霉菌）目前二頁\總數(shù)五十頁\編于十八點菌落1、概念：

單個或少數(shù)微生物在適宜的固體培養(yǎng)基表面或內(nèi)部生長、繁殖到一定程度，就會形成一個肉眼可見的，具有一定形態(tài)結(jié)構(gòu)的子細胞群體，叫做菌落。2、菌落是鑒定微生物的重要依據(jù)：不同微生物在特定培養(yǎng)基上生長形成的菌落一般具有穩(wěn)定的特征，如菌落的大小、形狀、邊緣特征、隆起程度、顏色等。目前三頁\總數(shù)五十頁\編于十八點細菌菌落細菌的菌落特征因種而異目前四頁\總數(shù)五十頁\編于十八點如圖是酵母菌電子顯微鏡下的形態(tài)結(jié)構(gòu)真菌：酵母菌和霉菌青霉目前五頁\總數(shù)五十頁\編于十八點一、微生物的分離和純培養(yǎng)（3項技術(shù)1個案例）（一）培養(yǎng)基配制技術(shù)（二）無菌技術(shù)（三）接種技術(shù)

案例：大腸桿菌的分離和純培養(yǎng)

目前六頁\總數(shù)五十頁\編于十八點（一）無菌技術(shù)1、概念：無菌操作泛指在培養(yǎng)微生物的操作中，所有防止雜菌污染的方法。①對實驗操作的空間、操作者的衣著和手，進行清潔和消毒；②將用于微生物培養(yǎng)的器皿、接種用具和培養(yǎng)基等進行滅菌；④實驗操作時，應避免已經(jīng)滅菌處理的材料用具與周圍的物品相接觸。③為避免周圍環(huán)境中微生物的污染，實驗操作應在酒精燈火焰附近進行——酒精燈的火焰旁的局部高溫使微生物難以生存目前七頁\總數(shù)五十頁\編于十八點2、消毒（1）定義：使用較為溫和的物理或化學方法僅殺死物體表面或內(nèi)部一部分對人體有害的微生物（不包括芽孢和孢子）目前八頁\總數(shù)五十頁\編于十八點A、煮沸消毒法:100℃煮沸5-6min，日常生活常用B、巴氏消毒法：70-75℃下煮30min或80℃下煮15min，適用于不耐高溫的液體，如牛奶。C、化學藥劑消毒法:用酒精進行皮膚消毒;氯氣消毒水源D、射線消毒法，如紫外線（2）消毒的方法：目前九頁\總數(shù)五十頁\編于十八點（1）定義：使用強烈的理化因素殺死物體內(nèi)外所有的微生物，包括芽孢和孢子。2、滅菌目前十頁\總數(shù)五十頁\編于十八點（2）滅菌的方法：A、灼燒滅菌方法：直接在酒精燈火焰的充分燃燒層(溫度最高)灼燒(迅速徹底)適用范圍：接種環(huán)、接種針、金屬用具(接種工具)；試管口或瓶口(在接種過程中易被污染的部位)目前十一頁\總數(shù)五十頁\編于十八點C、濕熱滅菌方法：高壓蒸汽滅菌P8適用于培養(yǎng)基的滅菌B、干熱滅菌：方法：干熱滅菌箱,160-170℃下加熱1-2h。適用范圍：吸管、培養(yǎng)皿(玻璃器皿)、金屬用具(能耐高溫的、需保持干燥的物品)目前十二頁\總數(shù)五十頁\編于十八點1、培養(yǎng)基定義：（課本第9頁）2、營養(yǎng)構(gòu)成：環(huán)境條件：pH、氧氣、二氧化碳、滲透壓等

（二）培養(yǎng)基配制技術(shù)基本營養(yǎng)成分：水、無機鹽、碳源、氮源等特殊營養(yǎng)成分：維生素、生長因子等特殊的、能滿足微生物不同需要的營養(yǎng)物質(zhì)。目前十三頁\總數(shù)五十頁\編于十八點固體培養(yǎng)基用于菌種分離、鑒定菌落等半固體培養(yǎng)基可觀察微生物的運動液體培養(yǎng)基常用于發(fā)酵工業(yè)。（1）按物理狀態(tài)分：固體培養(yǎng)基和液體培養(yǎng)基、半固體培養(yǎng)基。3.培養(yǎng)基的分類目前十四頁\總數(shù)五十頁\編于十八點固體培養(yǎng)基平板培養(yǎng)基（課本第9頁）斜面培養(yǎng)基固體培養(yǎng)基中需加入凝固劑，如瓊脂目前十五頁\總數(shù)五十頁\編于十八點半固體培養(yǎng)基無運動有運動半固體培養(yǎng)基中也需要加入凝固劑瓊脂，但加入量少于固體培養(yǎng)基。目前十六頁\總數(shù)五十頁\編于十八點液體培養(yǎng)基表面生長均勻混濁生長沉淀生長目前十七頁\總數(shù)五十頁\編于十八點選擇培養(yǎng)基（2）按功能分：選擇培養(yǎng)基和鑒別培養(yǎng)基加入青霉素的培養(yǎng)基:抑制細菌和放線菌的生長，分離酵母菌、霉菌等真菌。

不加氮源的無氮培養(yǎng)基:分離固氮菌定義（課本第18頁）舉例：加入高濃度食鹽的培養(yǎng)基:分離金黃色葡萄球菌目前十八頁\總數(shù)五十頁\編于十八點鑒別培養(yǎng)基

根據(jù)微生物的代謝特點，在培養(yǎng)基中加入某種指示劑或化學藥品配制而成的，用以鑒別不同種類的微生物。

例如：在培養(yǎng)基中加入伊紅和美藍，可以用來鑒別大腸桿菌。如果有大腸桿菌，其代謝產(chǎn)物就與伊紅和美藍結(jié)合，使菌落呈藍紫色，并帶有金屬光澤。

(課本15頁)目前十九頁\總數(shù)五十頁\編于十八點

用化學成分已知的化學物質(zhì)配成的，因成分明確，常用于分類、鑒定等合成培養(yǎng)基主要成分是氨基酸、維生素、碳水化合物、無機鹽和其它一些輔助物質(zhì)。合成培養(yǎng)基:天然培養(yǎng)基：（3）按成分：合成培養(yǎng)基和天然培養(yǎng)基(P9用化學成分不明確的天然物質(zhì)配成的，如血清、組織提取液等目前二十頁\總數(shù)五十頁\編于十八點稱量：準確地稱取各種成分。牛肉膏比較黏稠，可以用玻棒挑取，放在稱量紙上稱量。牛肉膏和蛋白胨都容易吸潮，稱量時動作要迅速，稱后要及時蓋上瓶蓋。4.培養(yǎng)基的配制步驟（第10頁）（1）.計算:根據(jù)牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基配方的比例，計算配制100mL的培養(yǎng)基時，各種成分的用量。（以牛肉膏蛋白胨固體培養(yǎng)基為例）目前二十一頁\總數(shù)五十頁\編于十八點（2）.溶化：①加水加熱熔化牛肉膏

將稱好的牛肉膏連同稱量紙一同放入燒杯加入少量的水，加熱。當牛肉膏溶化并與稱量紙分離后，用玻棒取出稱量紙。②加入蛋白胨和氯化鈉，用玻棒攪拌，使其溶解；③加入瓊脂；④用蒸餾水定容到100mL。整個過程不斷用玻棒攪拌，目的是防止瓊脂糊底而導致燒杯破裂。（3）.調(diào)節(jié)pH（4）.分裝、包扎（5）.滅菌（6）擱置斜面P11或倒平板P13目前二十二頁\總數(shù)五十頁\編于十八點擱置斜面------斜面培養(yǎng)基(P11)待試管冷卻至50℃左右，將試管口部枕在高約1cm的木條或其他合適高度的物體上，使其自然冷卻，斜面長度不超過試管總長的1/2.目前二十三頁\總數(shù)五十頁\編于十八點待培養(yǎng)基冷卻到50℃左右時，在酒精燈附近倒平板。倒平板------平板培養(yǎng)基(P13)①在火焰旁右手拿錐形瓶，左手拔出棉塞；②右手拿錐形瓶，使錐形瓶的瓶口迅速通過火焰；③左手將培養(yǎng)皿打開一條縫隙，右手將培養(yǎng)基倒入培養(yǎng)皿，立刻蓋上皿蓋。④待平板冷卻凝固后，將平板倒過來放置。平板冷凝后倒置的原因：平板冷凝后，皿蓋上會凝結(jié)水珠，凝固后的培養(yǎng)基表面的濕度也比較高，將平板倒置，①既可以使培養(yǎng)基表面的水分更好地揮發(fā)，②又可以防止皿蓋上的水珠落入培養(yǎng)基，造成污染。

目前二十四頁\總數(shù)五十頁\編于十八點倒平板技術(shù)目前二十五頁\總數(shù)五十頁\編于十八點（三）接種技術(shù)1.定義:在無菌條件下將微生物接入培養(yǎng)基的操作過程。3.平板培養(yǎng)基上接種方法平板劃線法、稀釋涂布平板法、稀釋混合平板法2.斜面培養(yǎng)基上接種方法目的：菌種轉(zhuǎn)移、擴大培養(yǎng)和保存純凈菌種目的：用來培養(yǎng)、分離細菌等微生物目前二十六頁\總數(shù)五十頁\編于十八點斜面培養(yǎng)基上接種方法準備接種接種環(huán)滅菌挑取菌種劃線接種培養(yǎng)、觀察點燃酒精燈、取斜面培養(yǎng)基、取菌種試管灼燒多次，迅速徹底地滅菌試管口通過火焰2-3次，殺滅試管口微生物試管口滅菌接種環(huán)冷卻后挑取菌種不要將培養(yǎng)基的表面劃破37℃下培養(yǎng)24h目前二十七頁\總數(shù)五十頁\編于十八點平板培養(yǎng)基上接種方法1、平板劃線法將混在一起的微生物或同一微生物群體中的不同細胞用接種環(huán)在平板培養(yǎng)基表面通過分區(qū)劃線稀釋而得到較多獨立分布的單個細胞。準備接種接種環(huán)滅菌劃線接種培養(yǎng)、觀察試管口滅菌挑取菌種目前二十八頁\總數(shù)五十頁\編于十八點平板劃線操作目前二十九頁\總數(shù)五十頁\編于十八點⑵平板劃線要點①在操作的第一步以及每次劃線之前都要灼燒接種環(huán)的原因——A.操作的第一步灼燒接種環(huán)是為了避免接種環(huán)上可能存在的微生物污染培養(yǎng)物；B.每次劃線前灼燒接種環(huán)是為了殺死上次劃線結(jié)束后接種環(huán)上殘留的菌種，使下一次劃線時，接種環(huán)上的菌種直接來源于上次劃線的末端，從而通過劃線次數(shù)的增加，使每次劃線時菌種的數(shù)目逐漸減少，以便得到菌落。②在劃線操作結(jié)束時，仍需灼燒接種環(huán)的原因——劃線結(jié)束后灼燒接種環(huán)能及時殺死接種環(huán)上殘留的菌種，避免細菌污染環(huán)境和感染操作者。③在灼燒接種環(huán)之后，要等其冷卻后再進行劃線的原因——以免接種環(huán)溫度太高，殺死菌種。④在做第二次以及其后的劃線操作時，總是從上一次劃線的末端開始劃線的原因——劃線后，線條末端細菌的數(shù)目比線條起始處要少，每次從上一次劃線的末端開始，能使細菌的數(shù)目隨著劃線次數(shù)的增加而逐步減少，最終能得到由單個細菌繁殖而來的菌落。目前三十頁\總數(shù)五十頁\編于十八點2、稀釋涂布平板法

將菌液進行一系列的梯度稀釋，然后將不同稀釋度的菌液分別涂布到瓊脂固體培養(yǎng)基的表面，進行培養(yǎng)。在稀釋度足夠高的菌液里，聚集在一起的微生物將被分散成單個細胞，從而能在培養(yǎng)基表面形成單個的菌落,即為純培養(yǎng)物。目前三十一頁\總數(shù)五十頁\編于十八點系列稀釋操作目前三十二頁\總數(shù)五十頁\編于十八點70%的酒精涂布平板操作步驟取菌液滴加到培養(yǎng)基表面目前三十三頁\總數(shù)五十頁\編于十八點1、微生物實驗室培養(yǎng)的基本操作程序（1）器具的滅菌（2）培養(yǎng)基的配制（3）培養(yǎng)基的滅菌（4）倒平板（5）微生物接種（6）恒溫箱中培養(yǎng)（7）菌種的保存（四）案例：大腸桿菌的分離和純培養(yǎng)目前三十四頁\總數(shù)五十頁\編于十八點（1）制備牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基2、大腸桿菌的分離和純培養(yǎng)步驟目前三十五頁\總數(shù)五十頁\編于十八點（2)配制培養(yǎng)基：計算稱量；熔化；調(diào)PH；分裝；滅菌；倒平板（3）接種：平板劃線法；稀釋涂布平板法。（4）培養(yǎng)：倒置，37℃恒溫箱，12和24h。（5）純化培養(yǎng)：倒置，37℃恒溫箱，24h。（6）菌種保藏：臨時、長期保存法。目前三十六頁\總數(shù)五十頁\編于十八點菌種的保存

1、臨時保藏：接種到固體斜面培養(yǎng)基，菌落長成后置于4℃冰箱保存。2、長期保存：甘油冷凍管藏法-20℃冷凍箱保存目前三十七頁\總數(shù)五十頁\編于十八點二、測定微生物的數(shù)量目前三十八頁\總數(shù)五十頁\編于十八點（一）測定微生物數(shù)量的方法1.直接計數(shù)法最常用：顯微鏡直接計數(shù)法（方法、優(yōu)點、缺點、適用條件）一、基礎知識目前三十九頁\總數(shù)五十頁\編于十八點2、間接計數(shù)法：最常用的是稀釋平板計數(shù)法稀釋平板法稀釋涂布平板法稀釋混合平板法目前四十頁\總數(shù)五十頁\編于十八點1、土壤取樣、制備土壤懸液土壤中分解尿素的細菌的分離與計數(shù)2、配制選擇性培養(yǎng)基：采用唯一氮源為尿素的培養(yǎng)基尿素瓊脂培養(yǎng)基牛肉膏蛋白胨瓊脂培養(yǎng)基二、實踐案例目前四十一頁\總數(shù)五十頁\編于十八點目前四十二頁\總數(shù)五十頁\編于十八點3、樣品稀釋細菌：一般選用104、105、106倍的稀釋液進行培養(yǎng)放線菌：一般選用103、104、105倍的稀釋液真菌：一般選用102、103、104倍的稀釋液4、取樣及平板接種（涂布平板或混合平板）目前四十三頁\總數(shù)五十頁\編于十八點

在以尿素為惟一氮源的培養(yǎng)基中加入酚紅指示劑，指示劑變紅，就可以準確的鑒定該種細菌能夠分解尿素。5、培養(yǎng)與觀察：細菌：30～370C的溫度下培養(yǎng)1～2d；放線菌：25～280C的溫度下培養(yǎng)5～7d；霉菌：25～280C的溫度下培養(yǎng)3～4d。目前四十四頁\總數(shù)五十頁\編于十八點當菌落數(shù)目穩(wěn)定時，選取菌落數(shù)在30～300的平板進行計數(shù)。在同一稀釋度下，至少對3個平板進行重復計數(shù)，然后求出平均值，并根據(jù)平板所對應的稀釋度計算出樣品中細菌的數(shù)目。每克樣品中的菌數(shù)＝(C/V)×MC:代表某一稀釋度下平板上生長的平均菌落數(shù)V:代表涂布平板時所用的稀釋液的體積M：稀釋的倍數(shù)6、細菌計數(shù)目前四十五頁\總數(shù)五十頁\編于十八點菌落數(shù)的選擇：一般選擇菌落數(shù)在30～300的平板上進行計數(shù)。當只有一個稀釋倍數(shù)的平均菌落數(shù)符合此范圍時，則以該平均菌落乘以稀釋的倍數(shù)；若有兩個稀釋倍的平均菌落數(shù)均在30～300之