微生物工程下游工程簡介

一、微生物工程下游工程概論目前一頁\總數(shù)六十三頁\編于十八點1、微生物工程下游工程的特點

1）發(fā)酵液是復雜的多相系統(tǒng)2）所需產(chǎn)物在培養(yǎng)液中濃度較低3）普遍存在下游工程代價高，回收率較低等問題目前二頁\總數(shù)六十三頁\編于十八點2、微生物工程下游工程的一般程序成品加工發(fā)酵液的預處理和過濾提取精制采用凝聚和絮凝技術加速固、液分離；如產(chǎn)物在細胞內，還要進行細胞破碎提取（初步純化）目的是除去與目標產(chǎn)物性質差異大的雜質精制（高度純化）是采用對產(chǎn)品有高度選擇性的分離技術，除去與產(chǎn)物化學性質和物理性質相近的雜質最終獲得質量合格的產(chǎn)品目前三頁\總數(shù)六十三頁\編于十八點3、主要操作單元：絮凝離心過濾細胞破碎萃取沉淀層析結晶干燥目前四頁\總數(shù)六十三頁\編于十八點二、發(fā)酵液預處理和過濾目前五頁\總數(shù)六十三頁\編于十八點一）發(fā)酵液的預處理1、目的：發(fā)酵液中雜質多且成分復雜，其中對純化影響最大的是高價無機離子(Ca2+、Mg2+、Fe3+等)和雜蛋白等

改變發(fā)酵液的物理性質，加快懸浮液中固形物沉降的速度；盡可能使產(chǎn)物轉入便于以后處理的相中；能夠除去部分雜質。目前六頁\總數(shù)六十三頁\編于十八點2、高價無機離子的去除鎂離子的去除：常用草酸與鈣離子生成草酸鈣沉淀草酸為弱酸，對發(fā)酵產(chǎn)物的破壞較小，草酸鈣沉淀還能促進蛋白質凝固，有利于提高濾液的過濾速度；草酸的溶解度較小，需大用量時，可用草酸鈉取代；草酸價格較高，生產(chǎn)上一般需回收鈣離子的去除：鐵離子的去除：常用三聚磷酸鈉與鎂離子形成可溶性絡合物Na5P3O10+Mg2+=MgNa3P3O10+2Na+常用黃血鹽與鐵離子形成普魯氏藍沉淀3K4Fe(CN)6+4Fe3+=Fe4[Fe(CN)6]3↓+12K+目前七頁\總數(shù)六十三頁\編于十八點3、可溶性雜蛋白的去除

雜蛋白的存在會降低離子交換樹脂和大網(wǎng)格樹脂的吸附量，如采用溶劑萃取，會發(fā)生乳化，影響兩相分離。此外，在常規(guī)過濾和膜過濾時，還會使濾速下降，使膜受到污染。目前八頁\總數(shù)六十三頁\編于十八點1）沉淀法

調等電點

因羧基的電離度比氨基大，所以大多數(shù)蛋白質的等電點都在酸性范圍(pH4.0-5.5)

但僅靠調等電點還不能使大部分蛋白質沉淀蛋白質是兩性物質，在酸性溶液中，能與一些陰離子物質如三氯乙酸鹽、水楊酸鹽、鎢酸鹽、苦味酸鹽、鞣酸鹽和過氯酸鹽等形成沉淀；在堿性溶液中，能與一些陽離子如Ag+、Cu2+、Zn2+、Fe3+、Pb2+等形成沉淀2）變性法

變性蛋白溶解度較小

最常用加熱法

加熱不僅能使蛋白變性，還可降低液體黏度，提高過濾速率；

其他方法：

大幅度調節(jié)pH，加酒精、丙酮等有機溶劑或表面活性劑

變性法存在一定的局限

如加熱法只適用于對熱較穩(wěn)定的目的產(chǎn)物；極端pH也會導致某些目的產(chǎn)物失活，且需消耗大量酸堿，而有機溶劑法通常只適用于所處理的液體數(shù)量較少的場合。3）吸附法加入某些吸附劑或沉淀劑吸附雜蛋白而將其除去

如四環(huán)素生產(chǎn)中，采用黃血鹽和硫酸鋅的協(xié)同作用生成亞鐵氰化鉀的膠狀沉淀來吸附蛋白；在枯草芽孢桿菌發(fā)酵中，加入氯化鈣和磷酸氫二鈉，兩者生成龐大的凝膠，把蛋白質、菌體及其他不溶性粒子吸附并包裹在其中而除去目前九頁\總數(shù)六十三頁\編于十八點二）發(fā)酵液的過濾1、質量比阻力（rB）——單位濾餅厚度的阻力系數(shù)；與濾餅的結構特性有關，衡量過濾特性的主要指標。對于不可壓縮濾餅，比阻力值是常數(shù)；對于可壓縮性濾餅，比阻力是操作壓力差的函數(shù)rB=r(⊿P)mr——不可壓縮濾餅的比阻（對一定料液其值為常數(shù)）；m——壓縮性指數(shù)，一般為0.5-0.8；不可壓縮濾餅為0；⊿P——壓力差目前十頁\總數(shù)六十三頁\編于十八點

發(fā)酵液多為非牛頓流體，濾渣為可壓縮性的；

發(fā)酵液濾餅的比阻與一般可壓縮濾餅相比，有其特殊性。一般可壓縮濾餅的比阻是操作壓力差的函數(shù)，在不變的壓差之下，濾餅比阻力是一定值，即在不變壓差下過濾時，過濾速度的逐漸下降是由于濾餅厚度的逐漸增加所致，而作為單位濾餅厚度的過濾阻力即濾餅比阻力是不變的；但發(fā)酵液濾餅，即使在恒定的操作壓差下，當濾餅中所含固形物濃度達到某一界限值時，濾餅的比阻力就不是一定值，而會突然升高，因此過濾速度不但隨濾餅厚度的增加而下降，還會因濾餅比阻力的突然升高而額外下降。這是由于有機物質的膠體粒子借靜電吸引而結合的水分子所致；對發(fā)酵液進行預處理，可以降低結合水的比率，使發(fā)酵液濾餅更接近一般可壓縮性濾餅的性質。目前十一頁\總數(shù)六十三頁\編于十八點2、常用過濾設備1）板框(plateandframe)壓濾機板框過濾機結構圖

（曹軍衛(wèi)320頁）1-尾板2-濾框3-濾板4-主梁5-頭板6-緊壓裝置2）帶式壓濾機目前十二頁\總數(shù)六十三頁\編于十八點發(fā)酵后期要少加消泡劑和少進行補料，防止消泡劑和未用完的培養(yǎng)基增加過濾難度；菌體自溶前放罐可防止因菌體自溶釋放出的代謝產(chǎn)物增加發(fā)酵液黏度3、影響發(fā)酵液過濾的因素1）菌體細胞體積真菌菌絲體較粗大，質量比阻小，發(fā)酵液不需經(jīng)特殊處理就很容易過濾；放線菌菌絲細而分支，交織成網(wǎng)格狀，質量比阻力大，較難過濾，發(fā)酵液需經(jīng)預處理，凝固蛋白質等膠體物質，提高過濾速度；細菌菌體更小，發(fā)酵液如不經(jīng)絮凝等預處理，很難用常規(guī)過濾設備進行過濾操作。2）培養(yǎng)基組成黃豆餅粉、花生餅粉等會增加過濾難度3）放罐時機目前十三頁\總數(shù)六十三頁\編于十八點當發(fā)酵液中有不溶性多糖時，會使發(fā)酵液的黏度增大而影響過濾速度；可用酶將其轉化成可溶性單糖，提高濾速。4、提高過濾性能的方法1）加助濾劑

助濾劑是一種不可壓縮的多孔微粒，能使濾餅疏松，從而增加濾速；

常用硅藻土、珍珠巖等；

加入方法有兩種：a)預先在濾布上鋪上一層1-2mm厚的助濾劑；b)直接把助濾劑加入發(fā)酵液中。2）添加填充凝固劑如CaSO4、AlPO4等本身就是助濾劑，且能使膠狀物和懸浮物凝固3）酶解法目前十四頁\總數(shù)六十三頁\編于十八點三）細胞破碎目的代謝產(chǎn)物并非都是分泌型的，許多是存在于細胞內的，特別是基因工程菌在細胞內形成的包含體是不分泌的，故需進行細胞破碎。目前十五頁\總數(shù)六十三頁\編于十八點大規(guī)模破碎細胞常用方法；利用高壓使細胞懸液通過針型閥，由于突然減壓和高速沖擊撞擊環(huán)，造成細胞破碎。影響破碎的主要因素是壓力、溫度和循環(huán)次數(shù)1、細胞破碎方法1）高壓勻漿法高壓勻漿器排出閥2）高速球磨法高速球磨機1-物料進口2-物料出口3、4-冷卻水進、出口5、6-夾套冷卻水進、出口由于圓盤的高速旋轉，細胞懸浮液與極細的玻璃小珠、石英砂或氧化鋁一起快速攪拌或研磨，使細胞得以破碎。3）超聲波法常用超聲波頻率15-25kHz；細胞的破碎是由于超聲波的空穴作用，由于這種空穴泡又受到超聲波的迅速沖擊而閉合，從而產(chǎn)生極為強烈的沖擊波壓力，由此引起的黏滯性旋渦在介質中的細胞上造成了剪切應力，促使細胞內液體發(fā)生流動，造成細胞破碎；超聲波振蕩易引起溫度的劇烈上升，操作是需冷卻；通常桿菌比球菌易破，陰性菌比陽性菌易破4）酶解法

專一性強，條件溫和；但費用較高

酶解法的另一方式是利用微生物的自溶作用即溶胞的酶是微生物自身產(chǎn)生的；大多數(shù)微生物都能產(chǎn)生一種可以水解自身細胞壁上聚合結構的酶；當改變一定的環(huán)境條件時，可誘發(fā)這種酶的過量產(chǎn)生或激發(fā)其他自溶酶產(chǎn)生，而發(fā)生自溶現(xiàn)象。5）滲透壓沖擊法

將細胞先放入高滲透壓的介質中，如高濃度的甘油或蔗糖液，在達到平衡后，介質突然被稀釋，或將細胞轉入水或緩沖液中，水就會迅速進入細胞內，致使細胞膨脹，引起細胞壁的破裂；此法適用于細胞壁較脆弱的，或者細胞壁預先用酶處理的，或細胞壁合成受到抑制的微生物；6）反復凍結-融化法將細胞反復在低溫下突然冷凍后在室溫下融化，引起細胞破裂；低溫冷凍一方面能使細胞膜的疏水鍵結構斷裂，從而增加細胞的親水性能；另一方面胞內水結晶使細胞內外溶液濃度發(fā)生變化，引起細胞突然膨脹而破裂。該法適用于細胞壁較脆弱的細胞目前十六頁\總數(shù)六十三頁\編于十八點2、細胞破碎率測定當細胞內含物釋放到水相時，會引起導電率的變化；隨破碎率的增加而增加，有線性關系；

因導電率的讀數(shù)取決于微生物的種類、處理條件、細胞濃度等，應先用其他方法標準化1）直接測定法觀察計數(shù)（必要時配合染色技術）2）測定釋放的蛋白或酶活力3）測定導電率目前十七頁\總數(shù)六十三頁\編于十八點三、沉淀法（Precipitation）目前十八頁\總數(shù)六十三頁\編于十八點沉淀是通過改變條件或加入某種試劑，使溶液中的溶質由液相轉變?yōu)楣滔辔龀龅倪^程。方法簡單、成本低、使用廣泛，一般作為初步分離的手段；鹽析法有機溶劑沉淀法等電點沉淀法非離子型聚合物沉淀法聚電解質沉淀法生成鹽復合物沉淀法熱變性及酸堿變性沉淀法目前十九頁\總數(shù)六十三頁\編于十八點

中性鹽的加入能破壞蛋白、酶等的膠體性質，中和微粒上的電荷，促使蛋白質等沉淀。一）鹽析法(Saltingout)目前二十頁\總數(shù)六十三頁\編于十八點1、鹽析原理——Cohn方程蛋白質的溶解度與鹽濃度間的關系可用Cohn方程式表示：logS/S0=－Ks·I

S—離子強度為I時的蛋白溶解度(g/L);S0—純溶劑（即I=0）時蛋白的溶解度；Ks—鹽析常數(shù)，與溫度和pH無關；I—離子強度目前二十一頁\總數(shù)六十三頁\編于十八點鹽析法分離蛋白質時，可分兩類：1）在一定的pH值和溫度下，改變離子強度或鹽濃度的沉淀方法——“K”分級鹽析法2）在一定離子強度下，改變溶液的pH值及溫度的沉淀方法——“”分級鹽析法當溫度一定時，S0對于某一溶質是一常數(shù)，即logS0=是溶質的特征常數(shù)，對于蛋白質而言，其大小主要取決于不同蛋白質的性質，它也與溶液的溫度和pH值有關，但與鹽的種類無關。目前二十二頁\總數(shù)六十三頁\編于十八點2、影響鹽析的主要因素鹽溶(saltingin)：許多蛋白在低鹽濃度下發(fā)生鹽溶現(xiàn)象（比在純水中的溶解度大大增加）；高鹽濃度則鹽析，離子強度越大，蛋白質的溶解度越低；鹽析劑種類很多，不同種類的鹽對蛋白溶解度的影響是不同的；離子半徑小且電荷高的離子對鹽析作用的影響較強，離子半徑較大而電荷低的離子影響較弱；不同種類的鹽對溶解度的影響，主要是對Ks值的影響，，Ks值越大，該鹽的鹽析效果越好。1）蛋白質濃度

高濃度的蛋白溶液，可減少鹽的用量；但共沉現(xiàn)象嚴重用低濃度蛋白溶液進行鹽析，需用較多的鹽，共沉作用較輕2）離子強度和種類3）溫度溫度是影響溶質溶解度的重要因素，升高溫度可以增加許多無機鹽和小分子有機化合物的溶解度；但在高鹽濃度中，蛋白質等生物大分子物質的溶解度隨溫度的升高反而減小這主要是因為蛋白質分子在水化時要吸熱，失水時則放熱；溫度升高有利于蛋白質失水沉淀。4）pH值除與蛋白質和溫度有關外，還與pH有關；鹽析pH的選擇要以不降低產(chǎn)物的活性為原則；由于蛋白質在等電點時最易沉淀，故可選擇等電點的pH作為鹽析pH目前二十三頁\總數(shù)六十三頁\編于十八點二）等電點沉淀法原理：利用兩性電解質在電中性時溶解度最低優(yōu)點：許多蛋白的等電點都在偏酸范圍內，而許多無機酸的價格低廉，并能為食品標準允許；缺點：酸化時易引起蛋白失活

不少蛋白質與金屬結合后會發(fā)生等電點偏移，如胰島素的等電點為5.3，在與Zn2+結合形成胰島素鋅鹽，其等電點升為6.2；故加入金屬離子后選擇等電點沉淀時，要注意調整pH。目前二十四頁\總數(shù)六十三頁\編于十八點三）有機溶劑沉淀法許多有機溶劑如丙酮、乙醇、甲醇等能使溶于水的小分子生物物質以及核酸、多糖、蛋白質等生物大分子發(fā)生沉淀作用。這種沉淀作用是多種效應的結果，但主要作用是降低水溶液的介電常數(shù)。當有機溶劑濃度增大時，水對蛋白等分子表面上荷電基團或親水基團的水化程度降低，或者說溶劑的介電常數(shù)降低，因而靜電吸引力增大，帶電溶質互相吸引而聚集。對于具有表面水層的生物分子，有機溶劑與水的作用，使這些分子表面水層厚度不斷壓縮，最后使這些分子脫水而相互聚集析出。不同濃度的有機溶劑可使不同的溶質沉淀，即分步沉淀法，達到分離純化的目的。1、原理目前二十五頁\總數(shù)六十三頁\編于十八點2、優(yōu)缺點優(yōu)點：

分辨能力較高，一種溶質只在一個比較窄的有機溶劑范圍內沉淀；沉淀無需脫鹽；有機溶劑密度低，與沉淀物密度差大，易進行固液分離；有機溶劑易揮發(fā)，不會在成品中殘留。缺點：

易引起蛋白變性；易燃、易爆目前二十六頁\總數(shù)六十三頁\編于十八點用于生物物質沉淀的有機溶劑須能與水互溶，但對蛋白無作用；例如：乙醇、甲醇、丙酮、二甲基甲酰胺、二甲基亞砜、氯仿、乙醚等；乙醇是核酸、糖類、氨基酸和核苷酸等物質最常用的沉淀劑；在沉淀過程中，乙醇與水混合時放出大量的稀釋熱，使溶液的溫度顯著升高，這對熱穩(wěn)定性較差的產(chǎn)物影響較大（少量多次、攪拌）3、影響有機溶劑沉淀的因素1）有機溶劑的種類2）溫度多數(shù)生物物質在有機溶劑與水的混合液中的溶解度是隨溫度的降低而降低的，因此降低溫度可增加收率；低溫沉淀還能更好地保護生物物質的活性3）pH在結構穩(wěn)定范圍內，選擇溶解度最低時的pH，有助于提高沉淀效果；在接近等電點處，引起沉淀所需有機溶劑的量最??；合適的pH還可大大提高分離的分辨能力4）樣品濃度和分子質量低濃度樣品需要使用有機溶劑的量較大，但共沉作用小，有利于提高分離的效果；但低濃度樣品損失較大，回收率低；高濃度樣品使用有機溶劑的量較小，減少了變性的危險；但共沉作用大，分離效果較差。蛋白質分子質量越大，產(chǎn)生沉淀所需加入的有機溶劑量越少。5）金屬離子和離子強度Mn2+、Fe2+、Co2+、Cu2+、Zn2+等離子能與蛋白質的羧基、氨基和含有氮雜環(huán)的化合物結合；Ca2+、Ba2+、Mg2+、Pb2+能與羧基結合；Ag+、Hg2+、Pb2+能與巰基結合形成復合物；某些有機化合物能與生物大分子形成難容的復合物.這類復合物在水或有機溶劑中的溶解度都大大降低，而不影響蛋白質的生物活性，同時還能降低有機溶劑的用量。目前二十七頁\總數(shù)六十三頁\編于十八點四）非離子型多聚物沉淀法聚乙二醇(PEG)、葡聚糖右旋糖酐硫酸鈉等沉淀效能高；操作條件溫和，不易引起生物大分子變性；沉淀后易除去；無毒、不可燃；廣泛用于核酸、蛋白等的分離純化。機制：可能降低生物大分子水化度，與大分子發(fā)生共沉作用；與生物大分子形成復合物；或通過空間位置排斥，使液體中的微粒被迫聚集而沉淀。常用PEG6000-20000；PEG的沉淀效果除與沉淀劑的濃度有關外，還受離子強度、pH和溫度的影響目前二十八頁\總數(shù)六十三頁\編于十八點離子型的多糖化合物：

酸性多糖用的較多，如羧甲基纖維素、海藻酸鹽、果膠酸鹽、卡拉膠等陰離子聚合物：如聚丙烯酸陽離子聚合物：如聚乙烯亞胺等

可沉淀蛋白，作用方式類似于絮凝劑，兼有一定的鹽析和水化作用五）聚電解質沉淀法目前二十九頁\總數(shù)六十三頁\編于十八點四、溶劑萃取法(Solventextraction)目前三十頁\總數(shù)六十三頁\編于十八點一）溶劑萃取原理——分配定律

溶劑萃取法是以分配定律為基礎的，即利用各種物質在不同溶劑中具有不同的溶解度的原理，達到將不同物質分離純化的目的。分配定律（distributionlaw;Nester,1891）——在一定溫度和壓力下，溶質分配在兩不相溶的溶劑中，達到平衡時，溶質在兩相的濃度之比為一常數(shù)。

K=CL/CR=萃取液濃度/萃余液濃度K為分配常數(shù)（分配系數(shù)、分配比），其大小反映出溶質在不同溶劑中溶解度的差異，及在此系統(tǒng)中的選擇性

在溶劑萃取中，含有溶質的未被提取過的溶液稱為料液；用于進行萃取的溶劑稱為萃取劑；經(jīng)萃取后含有溶質的萃取劑稱為萃取液；被萃取過失去溶質的料液稱為萃余液。目前三十一頁\總數(shù)六十三頁\編于十八點分離因素（分離系數(shù)）

若在同一體系中有兩種溶質A和B，它們在相同條件下的分配常數(shù)分別為KA、KB，則分離系數(shù)的定義為：

=KA/KB=(CLA/CLB)/(CRA/CRB)目前三十二頁\總數(shù)六十三頁\編于十八點二）有機溶劑的選擇1）選擇萃取用的溶劑應考慮對產(chǎn)物有較大的溶解度和較好的選擇性。分離因素可以表征溶劑的選擇性如何，溶解度則由相似相溶的分子極性所決定。介電常數(shù)是一個化合物摩爾極化程度的量度；通過這一數(shù)值，可預知一個化合物是極性化合物還是非極性化合物。4）價格低廉，安全（如無毒、閃點高）常用：乙酸乙酯、乙酸丁酯、丁醇2）溶劑與被萃取液的互溶度要小，黏度低，界面張力適中，對相的分散和相的分離有利；3）溶劑的化學穩(wěn)定性高，回收和再生容易；目前三十三頁\總數(shù)六十三頁\編于十八點三）影響水相溶質溶解度的因素1）離子強度有些物質在高離子強度下溶解度增加，如DNA-蛋白；有些則在低離子強度下溶解度增加，如RNA-蛋白；絕大多數(shù)蛋白質和酶存在“鹽溶”和“鹽析”現(xiàn)象；鹽析作用可以降低許多生化產(chǎn)物在水中的溶解度，也能減少有機溶劑在水中的溶解度。例如：在VB12的提取中，加入中性鹽硫酸銨，有利于VB12自水相轉移到有機溶劑中；在提取青霉素時加入NaCl，也有利于青霉素從水相轉移到有機溶劑中。2）pH3）溫度溫度可改變物質的溶解度，影響分配系數(shù)；一般生物物質對溫度敏感，萃取多在室溫或低溫下進行（通常0-10℃）；但也有采用熱提取法的（50-70℃），多用于一些小分子生物物質4）帶溶劑

帶溶劑是一類能和所提取的生物物質形成復合物，而易溶于溶劑的物質，且此復合物在一定條件下易分解形成原來的生物物質。提取水溶性強、在常用的有機溶劑中溶解度小的物質時可采用添加帶溶劑；對于水溶性不強的物質，也可通過帶溶劑提高收率和選擇性；

例如：鏈霉素是水溶性較強的堿，可與脂肪酸（如月桂酸）形成復合物，該復合物能溶于乙醇、醋酸丁酯等，而被萃取到有機相；在酸性條件下，又分解成鏈霉素而轉溶于水相。目前三十四頁\總數(shù)六十三頁\編于十八點四）乳化與去乳化在萃取過程中，經(jīng)常會出現(xiàn)一種液體分散到另一種本不相溶的液體中，即乳化現(xiàn)象。乳化現(xiàn)象會造成有機溶劑相和水相分層困難，出現(xiàn)兩種夾帶現(xiàn)象：

一是發(fā)酵液提取廢液中夾帶有機溶劑微粒，導致產(chǎn)品損失；二是有機溶劑相中夾帶發(fā)酵液微粒，會將雜質帶入產(chǎn)品中。目前三十五頁\總數(shù)六十三頁\編于十八點油（有機溶劑）、水不溶→分層表面活性劑存在可發(fā)生乳化這類表面活性劑稱為乳化劑；1、乳濁液的成因及穩(wěn)定條件乳濁液有兩種：

水包油型(O/W型)油滴分散在水中油包水型(W/O型)水滴分散在油中目前三十六頁\總數(shù)六十三頁\編于十八點

由于乳化劑的兩性性質，能夠將本不相溶的油與水連在一起，但其分子處在任何一相都是不穩(wěn)定的，只有處在兩相界面上時，親水基團對著水，疏水基團對向油，在相的界面上形成單分子層時，比較穩(wěn)定。乳化劑能夠降低表面張力，液體容易分散成微滴而發(fā)生乳化。

影響乳濁液穩(wěn)定性的因素包括是否在界面上形成保護膜，液滴的帶電性質以及介質的黏度；在發(fā)酵液中，蛋白對表面張力的影響最為顯著，隨著蛋白含量的增多，表面張力明顯下降，由此引起的乳濁液是相當穩(wěn)定的。目前三十七頁\總數(shù)六十三頁\編于十八點CaCO3可被水浸潤，但不能被有機溶劑潤濕；將乳濁液通過CaCO3層時，乳濁液中的水分則被吸附。2、去乳化方法1）離心分離法2）提高溫度提高溫度可使黏度下降，使乳濁液穩(wěn)定性降低3）稀釋法4）電解質破乳法離子型乳化劑所形成的乳濁液的穩(wěn)定性，是因其分散相帶有電荷；加入電解質，可中和其電性，促使聚沉；常用NaCl、NaOH、HCl、Al3+等5）吸附法6）頂替法加入表面活性更強但不能形成保護膜的物質，將原來的乳化劑從界面上頂替出來。

常用頂替劑有戊醇，其表面活性很強，但碳鏈很短，不能形成保護膜7）轉型法如果在O/W型乳濁液中加入親脂性的乳化劑，則乳濁液有從O/W轉變?yōu)閃/O型的趨向；但因在轉變過程中，其他條件還不允許形成W/O型乳濁液，而使乳濁液遭到破壞。去乳化劑：目前三十八頁\總數(shù)六十三頁\編于十八點五）萃取方式1、單級萃取多級逆流萃取包括若干萃取級，在第一級中加入料液，并逐漸向下一級移動，而在最后一級中加入萃取劑，并逐漸向前一級移動。料液移動的方向和萃取劑移動的方向相反，故得名。2、多級錯流萃取(multistagecross-flowextraction)由幾個萃取器串聯(lián)組成，料液經(jīng)第一級萃取后分離成兩個相；萃余相流入下一個萃取器，再加入新鮮萃取劑繼續(xù)萃??；萃取相則分別由各級排出，混合在一起，再進入回收器回收溶劑，回收得到的溶劑仍作萃取劑循環(huán)使用。3、多級逆流萃?。╩ultistagecounter-currentextraction）目前三十九頁\總數(shù)六十三頁\編于十八點五、離子交換法(Ionexchange)目前四十頁\總數(shù)六十三頁\編于十八點一）離子交換樹脂的分類其活性基團一般是磺酸基(-SO3H);由于是強酸性基團，電離程度不受外界pH的影響，在pH1-14范圍內均能起交換作用，一般沒有使用pH的限制。以與NaCl的交換為例：R-SO3H+NaClR-SO3Na+HCl其再生是用NaOH處理并水洗至pH8-9。再用HCl處理并用水洗至pH51、強酸性陽離子交換樹脂2、弱酸性陽離子樹脂以羧基(-COOH)、酚羥基(-OH)等為活性基團；其交換性能與溶液的pH有很大關系，因為這種樹脂的電離度很小。例如：羧基樹脂交換pH﹥7，酚羥基樹脂交換pH﹥9。在酸性溶液中，這類樹脂幾乎不發(fā)生交換反應，其交換能力隨溶液pH增高而增高。典型交換反應：R-COOH+NaOHRCOONa+H2O

反應生成的鹽RCOONa很容易水解并使溶液呈堿性，故鈉型樹脂不可能水洗到中性，一般只能水洗到pH8-9。3、強堿性陰離子交換樹脂有兩種：

強堿Ⅰ型——含有三甲胺基

強堿Ⅱ型——含有二甲基--羥基-乙基胺Ⅰ型比Ⅱ型的堿性強，但再生困難；Ⅱ型的穩(wěn)定性則較差；強堿性陰離子交換樹脂與強酸性陽離子交換樹脂一樣，沒有使用pH的限制；典型交換反應：RN(CH3)3Cl+NaOHRN(CH3)3OH+NaCl4、弱堿性陰離子交換樹脂活性基團有伯胺基-NH2、仲胺基＝NH、叔胺基≡NH和吡啶基等；與弱酸性陽離子樹脂情況類似，交換能力隨pH的變化而變化，pH越低，交換能力越大；典型交換反應：RNH3OH+HClRNH3Cl+H2O生成的鹽RNH3Cl很容易水解；這類樹脂與OH－的結合能力較強，容易再生成羥型，耗堿量也少。另有一些特殊的樹脂，如鰲合樹脂、兩性樹脂、氧化還原樹脂；大孔樹脂目前四十一頁\總數(shù)六十三頁\編于十八點二）離子交換樹脂的命名法□□□×□交聯(lián)度連接符號順序號骨架號分類號大孔樹脂在前面加“D”目前四十二頁\總數(shù)六十三頁\編于十八點例如：001×7：強酸性苯乙烯系陽離子交換樹脂，交聯(lián)度為7

D301：弱堿性苯乙烯系大孔陰離子交換樹脂

樹脂性質分類骨架分類分類號樹脂種類骨架號骨架材料

0強酸性0苯乙烯系1弱酸性1丙烯酸系2強堿性2酚醛系3弱堿性3環(huán)氧系4鰲合性4乙烯吡啶系5兩性5尿醛系6氧化還原6氧乙烯系目前四十三頁\總數(shù)六十三頁\編于十八點三）離子交換樹脂理化指標合成樹脂時單體中交聯(lián)劑（如二乙烯苯）的含量百分數(shù)稱為交聯(lián)度。通常8%-12%；一般交聯(lián)度越大，樹脂越堅固，機械強度越好，在水中不易膨脹；交聯(lián)度越低，樹脂越柔軟，越容易膨脹，越能很好地吸附較大的離子，達到交換平衡的速度越大；但機械強度差，吸附的選擇性小；1、交聯(lián)度2、膨脹度

樹脂不溶于水，但親水性強，具有親水膠體性質，一般吸水膨脹，脫水收縮；

測定方法：將10-15ml風干樹脂放入量筒，加入欲實驗的溶劑（多為水），然后不時搖動，24h后，測定樹脂的體積。前后體積之比稱為膨脹系數(shù)；

膨脹系數(shù)與交聯(lián)度有一定關系，交聯(lián)度大的樹脂膨脹系數(shù)小；3、交換容量指一定量樹脂中可交換基團的毫克當量數(shù)，是表征樹脂性能的重要指標。若將樹脂裝柱進行操作，流出液中產(chǎn)物離子達到某一濃度時，操作即應停止，樹脂進行再生后再使用。這一濃度稱為漏出點。在漏出點時樹脂所吸附的量叫做工作交換容量。目前四十四頁\總數(shù)六十三頁\編于十八點四）離子交換工作原理

根據(jù)物質的酸堿性、極性不同，在水溶液中所帶陰陽離子不同，電荷不同的物質對層析柱上的離子交換劑有不同的親和力，改變洗脫液的離子強度或pH，不同物質就能依次從層析柱中分離出來。在離子交換過程中，離子首先擴散到樹脂表面，通過樹脂擴散到交換位置，在交換位置進行離子交換。被交換的分子所帶電荷越多，它與樹脂的結合越緊密，也就越不容易被其它離子所取代。被交換的離子擴散到樹脂表面，洗脫液通過，被交換的離子擴散到外部溶液中。目前四十五頁\總數(shù)六十三頁\編于十八點目前四十六頁\總數(shù)六十三頁\編于十八點大分子物質要選擇交聯(lián)度低些的樹脂，小分子物質則選用交聯(lián)度高的樹脂；由于交聯(lián)度低樹脂強度差、易破碎，因此，交聯(lián)度選擇的原則是在不影響交換容量的條件下，盡可能提高交聯(lián)度。五）離子交換樹脂的選擇1、首先要考慮的是產(chǎn)物的酸堿性質

如強酸性物質應該選用弱堿性陰離子交換樹脂，這主要是從是否容易解吸的角度考慮的；因為強堿性陰離子交換樹脂固然也能吸附強酸性物質，但洗脫困難；

若產(chǎn)物為弱酸性物質則應選擇強堿性陰離子交換樹脂，如用弱堿性陰離子樹脂則不易吸附。

同理，強堿性產(chǎn)物則應選用弱酸性陽離子交換樹脂；弱堿性產(chǎn)物則選用強酸性陽離子交換樹脂。2、其次要考慮交聯(lián)度目前四十七頁\總數(shù)六十三頁\編于十八點如：當產(chǎn)物分子是低價離子時，增加濃度有利于交換上柱；高價離子則在較低濃度下易被吸附。六）操作條件的控制1、交換條件控制1）最重要的是控制交換時的pH合適的pH應該考慮三方面：a)應在被吸附物質穩(wěn)定的pH范圍內；b）能夠使被吸附物質離子化；c）同時能使樹脂離子化2）在使用之前，樹脂還必須處理成一定的型式對于弱酸性和弱堿性樹脂，為了使其能離子化，應采用鈉型或氯型；而強酸性或強堿性樹脂可采用任何型式，但若產(chǎn)物在酸性或堿性條件下易破壞的，則不能采用氫型或羥型；對于偶極離子的有機物，應該采用氫型樹脂。3）要考慮到產(chǎn)物濃度對交換有影響目前四十八頁\總數(shù)六十三頁\編于十八點2、洗脫條件的控制洗脫條件正好與上柱條件相反如對pH范圍的選擇，若酸性上柱，則應在堿性條件下洗脫；若堿性上柱，就采用酸性條件洗脫；目前四十九頁\總數(shù)六十三頁\編于十八點六、結晶法（crystallization）目前五十頁\總數(shù)六十三頁\編于十八點

物質從液態(tài)（液體或熔融體）或氣態(tài)形成晶體的過程叫結晶。結晶法常用于發(fā)酵產(chǎn)物的分離純化目前五十一頁\總數(shù)六十三頁\編于十八點目前五十二頁\總數(shù)六十三頁\編于十八點一）晶體的一般性質

許多性質相同的粒子在三維空間有規(guī)律地排列成格子狀固體的物質稱為晶體。晶體應該是具有一定形狀的固態(tài)物質，由許多性質相同的粒子（原子、離子和分子）有規(guī)律地排列而成。

某些液體表面上看不像晶體，但內部結構明顯具有晶體空間排列規(guī)律性，這種液體稱為液晶。目前五十三頁\總數(shù)六十三頁\編于十八點

大多數(shù)物質結晶都是在溶液中進行的，所以形成的晶體中常含有一定量的結晶水。晶體的含水量與晶體蒸汽壓強有關，當晶體蒸汽壓強高于大氣蒸汽壓強時，則風化失去結晶水。

晶體與非晶體的主要區(qū)別在于晶態(tài)物質的許多性質如光學和電學都具有方向性，即在同一方向上具有相同的性質，在不同方向上具有相異性（稱為晶體各向相異性）；非晶體則不具此性質。目前五十四頁\總數(shù)六十三頁\編于十八點二）晶體的結構與分類

構成晶體的微觀粒子（分子、原子或離子）按一定的幾何規(guī)則排列，由此形成的最小單元稱為晶格(crystallattice)。

如果結晶時沒有其他晶體或別的物質干擾，作為質點在空間晶格上排列的結果，晶體就具有明顯晶角和平滑晶面的外形。

雖然同一物質的不同晶體，其晶面、晶邊相差很大，但對應晶面所構成的晶面角對同一物質都是一樣的，這是物質的一種特征。目前五十五頁\總數(shù)六十三頁\編于十八點考慮某一特定晶體，通常選擇3個主要的不平行晶面，稱為結晶軸平面；

晶軸(crystalaxis)晶軸可互相垂直，可兩軸互不垂直而垂直于第三軸，可以互相傾斜成相等的角度，也可以互相傾斜成不等的角度；除三晶軸平面外，可選擇第四個基本平面與所有三軸相交，而此平面與三軸所截的線段可作為沿各軸測量長度的單位。目前五十六頁\總數(shù)六十三頁\編于十八點晶體按晶格空間結構，即按晶體的晶面角和晶軸長度，分為7種不同的晶系：立方晶系：三晶軸互相垂直且相等四方晶系：三晶軸互相垂直，其中兩軸長度相等，但不等于第三軸六方晶系：其三共面晶軸互相傾斜成60°，但其長度與相垂直的第四軸不相等；斜方晶系：三晶軸不等，且互成垂直；單斜晶系：三晶軸不等，其中兩者成傾斜，但垂直于第三軸；三斜晶系：三晶軸互相傾斜而長度不等，所有晶面角不等，且不等于30°、60°、90°；三方晶系：三晶軸長度相等，但相互傾斜度不等；目前五十七頁\總數(shù)六十三頁\編于十八點目前五十八頁\總數(shù)六十三頁\編于十八點三）生物物質形成結晶的條件無論大分子還是小分子，均需達到一定純度；因雜質可能影響結晶溶質在晶面上的定向排列，或能與結晶溶質化合或結合成絡合物；但要求純度不定，隨物質種類而異；大多數(shù)蛋白質要求達50%以上；1、樣品純度2、溶液的飽和度結晶形成的另一條件是溶解度的改變，合適的濃度才能增加分子的碰撞機會，使其能以一定的速度作定向排列聚集而形成晶體。濃度過高，溶質分子在溶液中聚集析出的速度太快，超過這些分子形成晶體的速率，只能獲得無定型固體顆粒，而得不到晶體；濃度過低，晶